全 文 ：蜡样芽孢杆菌 !"##!"#$%核黄素操纵子的克隆 及在枯草芽孢杆菌中的表达 王靖宇，陈 涛，班 睿，陈 洵，赵学明! （天津大学 化工学院生物工程系，天津$%%%&’）
摘 要：利用 ()!*"从 ! + "#$#%& !"##,-.&/的基因组中找到一段与枯草芽孢杆菌核黄素操纵子具有较高相似性的 -+0 12大小的基因组 34!片段，该片段中含有完整的核黄素操纵子。该操纵子结构基因的编码产物的氨基酸序列 与枯草芽孢杆菌核黄素操纵子相应结构基因的编码产物的氨基酸序列具有 //5的同源性。该片段被克隆到大肠 杆菌 6枯草芽孢杆菌穿梭载体 789,$:中。表达分析的结果表明 ! + "#$#%& !"##,-.&/核黄素操纵子可在大肠杆菌 和枯草芽孢杆菌中表达。利用 9#;方法用来自枯草杆菌的 &’"(基因的启动子替换 ! + "#$#%& !"##,-.&/核黄素操
纵子原有的启动子使其更好表达。替换启动子后的核黄素操纵子在本文使用的发酵条件下有较好的表达，核黄素
产量从 $/+. <= > )增加到 0,+& <= > )。 关键词：核黄素；蜡样芽孢杆菌；核黄素操纵子；枯草芽孢杆菌 中图分类号： ?@, 文献标识码： ! 文章编号：,0&’A$0&@（’%%-）%’A%%0@A%0
&’()*)+ ,-. /*0(1’23*) (4./() (1 ! + "#$#%& 56&&,-.&/ 2)7
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B!4C DEF=AGH，#8I4 "JK，(!4 ;HE，#8I4 LHF，M8!N LHOA（3O7JPQ509,/2:,：! -+.12 34! RPJ=,-.&/ =OFK! + &%()*+*& PE2KRUJYEF K7OPKF JZ QTO \HOPG ZO\HOFSO+ "TO VOVHSOV JKR ! + "#$#%& !"## ,-.&/ O]TE2EQOV //5 ZERPJ=2KRUJYEF K7OPKF KR ! + "#$#%& !"## ,-.&/ [JZ K7OPJQEYO EF 2KQT - + ".+* JFV ! + &%()*+*& +8K[OYOP，EQZ O]7POZA
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收稿日期：’%%-A%$A,’ 基金项目：国家自然科学基金（4K^’%%$0%,%）和国家 /&$计划项目（4K^’%%$#(&,0%%$）
作者简介：王靖宇（,/@%A），男，硕士，研究方向：代谢工程。
联系人：赵学明，"OU_‘J]：@0A’’A’&-%0&&%；IA:JG ’%%-
·0@·
生 物 加 工 过 程
#TEFOZO DKHPFJU KR (EK7PKSOZZ IF=EFOOPEF=
第 ’卷第 ’期
’%%-年 .月
万方数据
核黄素（维生素 !"）是生物合成黄素单核苷酸
（#$%&’( )*(*(+,$-*.’/-，#01）和黄素腺嘌呤二核苷
酸（#$%&’( %/-(’(- /’(+,$-*.’/-，#23）的前体物，#01
和 #23作为黄素蛋白的辅酶参与细胞的氧化还原
反应，在基础代谢中起重要作用。
微生物发酵法是一种重要的核黄素生产方
法［4］。枯草芽孢杆菌核黄素基因工程菌由于发酵周
期短（!56 7），具有较高的生产效率和比较成熟的
原核细胞基因工程技术支持等优势。8.-9%(*&等［"］
构建了产核黄素工程菌 ! : "#$%&’&" ;6< = 90>?，发酵<br条件经优化后，发酵 <@ A 56 7 后可产核黄素 <:? B = C。D-EF’(G 等［;］利用基因扩增原理，在对宿主菌 ! : "#$%&’&" 45@进行遗传改造的基础上构建了一系列
工程菌，其中 ! : "#$%&’&" H!?6：［9H#5I］56 发酵 <@ 7 后可产核黄素 4; A 4< B = C，?5 7后达 4? B = C［<］。此 外国内的陆文清［?］等以 ()*+,%-*.&#+ /"-$0&& 为出发
菌株，利用经典诱变方法筛选出一株核黄素生产菌
J;6，经补糖发酵后核黄素产量可达 @ B = C以上。目
前国内还未见有利用基因工程技术构建核黄素高产
菌的报道。
近十年来，随着代谢工程理论的出现和成熟，它
在产核黄素基因工程枯草芽孢杆菌研究中的应用后
使得这一领域的研究水平在质上产生了飞跃。代谢
工程实践过程包括“合成”K“分析”K“设计”三个步
骤，这三个步骤周而复始，不断循环，将研究水平不
断提高［5］。根据代谢工程中“合成“部分的理论，构
建可过量表达核黄素的枯草杆菌的主要思路是：一
方面解除受体菌对核黄素合成的反馈抑制，使核黄
素能够过量积累；另一方面是增加核黄素操纵子的
基因剂量，使之强表达［;］。在研究中，我们遇到了通
过增加基因剂量来高效表达枯草杆菌本身的核黄素
操纵子易发生同源重组引起结构不稳定的问题。因
采用外源基因表达时由于其序列的同源性较低不易
发生同源重组［L］，本研究尝试通过在枯草芽孢杆菌
中表达外源核黄素操纵子来进行提高核黄素的产量
的研究，并且这方面的研究未见有文献报道。蜡样
芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的亲缘关系较近，并且蜡
样芽孢杆菌典型菌株 2JMM4序。文献［@］中提到蜡样芽孢杆菌中也有核黄素操
纵子结构，但是未提到具体的信息。因此本文从蜡
样芽孢杆菌 2JMM4黄素操纵子并进行初步的研究。
! 材料与方法
4:4 材料
4:4:4 菌株和质粒
大肠杆菌 3N?!，! : "#$%&’&" 3!46<（-&" K，12)H"，
12)O4@，/2)O;）和 "草穿梭质粒 9ND4;0（M)E，O)E）由本实验室保藏；
! : .*)*#" 2JMM442"46（ )&$3"）来自 !Q8M（!/.&’’#" Q-(-.’, 8.*,F M-(R .-E）。 4:4:" 酶 DSE*T-G. 312聚合酶，J< 连接酶和内切酶均购 自 J%P%H%（大连）公司。 4:4:; 培养基 核黄素发酵培养基：蔗糖 46U，酵母粉 "U 0BR 8V<·LN"V 6:6?U，9N L:@。89’WW-(基本培养基参照 文献［I］，其他条件下培养皆采用 C!培养基。 4:" 方法 4:":4 生物信息学方法：序列比对程序 !C28J和开 放阅读框搜索器（VH# X’(/-E）均使用位于 1M!Y上的 网络服务。参照文献［46］进行。同源性分析采用 J K MV##OO［44］。 4:":" 312酶切，连接与大肠杆菌转化及染色体的 提取，按文献［4"］操作。枯草芽孢杆菌的转化按文 献［I］操作。 4:":; DMH扩增 ! : .*)*#" 2JMM 4?LI核黄素操纵<br子：根据得到的核黄素操纵子序列信息设计引物 HM4Z和 HM4C：HM4Z位于 ! : .*)*#" 2JMM4?LI核黄<br素操纵子 )&$Q结构基因上游 ?I5 K 545T9，?’端引入
421 Y位点；HM4C位于 ! : .*)*#" 2JMM4操纵子 )&$N 结构基因下游 <<< K <5"T9，?’端引入 !/+5 Y和 421Y位点。以 ! : .*)*#" 2JMM 4?LI的染<br色体为模板，用 J 9-EG*(%$型扩增仪扩增。引物序列
如下：
HM4Z：?’RM M M Q Q Q Q Q J 2 M M 2 J Q Q J J J 2
Q M 2 2 M J M M Q J J 2 J 2 J M MR;’
HM4C：?’RM M M Q Q Q Q Q 2 J M M Q Q J 2 M M J J
Q J Q 2 2 M Q M M J Q J J 2 M JR;’
扩增条件：I"[ < )’(；I"[ ;6 G，??[ 4 )’(，L"[
?:? )’( ;6个循环；L"[ ? )’(。
4:":< 核黄素定性：定性采用 NDCM 方法，使用
ND4466系统，操作同文献［4;］。
"66<年 ?月 王靖宇等：蜡样芽孢杆菌 2JMM4万方数据
!"#"$核黄素缺陷型互补实验：将重组质粒转化到 ! " "#$%&’&" ()*(+中，在基本培养基上划线培养，观察
菌落生长情况。
!"#"% &’(方法替换 ! " ,-.-#" )*’’ !+$,-核黄素 操纵子的启动子：首先用 &’( 方法扩增 "/,.［!+］启 动子（含有 (./序列和 )*0密码子），以 1.!2+的染 色体为模板，扩增引物 /3位于 ! " "#$%&’&" "/,.结构
基因上游 + $$4 +,567，$’端引入 !/01 8和 2348位 点；/9 5’末端的 !:个碱基位于 ! " "#$%&’&" "/,.结构 基因上游 ! 4 !:67。其中 /9 的 $’段的序列与 ! " ,-.-#" )*’’ !+$,-核黄素操纵子的第一个结构基 因 .&$0的编码区上游的 - 4 #,67 的序列互补。引 物序列如下： /3：$’;’ ’ ’ 0 0 0 0 0 ) * ’ ’ 0 0 * ) ’ ’ ’ ) * ’ ) ’ ) * ) * ) ’ ’ * 0 ’ ’ 0 /9：$’;’ * ’ * ’ ’ * ) ) ) ) ) ) ) * ’ ) ) ’ ) * ’ 0 * * ’ ) * 0 * ’ * ’ ’ * * 扩增条件：-#< + =>?；-#< +2 @，$$ < ! =>?，,#< !
=>? 52个循环；,#< $=>?。 以 &’(扩增的 ! " "#$%&’&" "/,.启动子和 &’(扩
增的 ! " ,-.-#" )*’’ !+$,- 核黄素操纵子产物纯化 后，混合作为 &’(模板，以 /3和 (’!9为上下引物。 再次进行 &’(。扩增条件同扩增核黄素操纵子。在 &’(过程中首先形成完整的模板，后面的循环中，新 形成的模板被扩增，得到替换启动子的核黄素操纵 子。 !"#", 核黄素发酵与测量：核黄素发酵在 +!<下， #$2 A B =>?，在倾斜 +$C的摇管（!#2 ==，装$ =9发酵
培养基，$D接种量）中培养 %$ E。发酵液中核黄素
的测量参照文献［!$］进行。 ! 结果与讨论 #"! ! " ,-.-#" )*’’!+$,- 核黄素操纵子序列的获
得与分析
通过 F’.8的 GH6服务，在 ! " ,-.-#" )*’’!+$,- 的基因组中找到一段与 ! " "#$%&’&" 核黄素操纵子序
列具有较好同源性的片段，长度为 +"% I6左右。使
用 J(K K>?LHA对之进行处理，从这段 1F)序列中找
出 +个 J(K，它们对应的编码产物的氨基酸序列与
枯草杆菌核黄素操纵子结构基因编码的产物 (>60，
(>6.，(>6)，(>6M 的序列相比分别有 $5D、%2D、 ,+D、,#D 的 相 同，但 有 --D 的 相 似 性。与 ! " "#$%&’&"核黄素操纵子相比，! " ,-.-#" )*’’ !+$,- 的核 黄 素 操 纵 子 没 有 .&$1 基 因。 ! " ,-.-#"
)*’’!+$,-核黄素操纵子的这些基因的起始密码子 除 .&$0的以外，本文的结果与 F’.8上公布的由测
序单位所做的 J(K搜索结果相同；对于 .&$0基因的 起始密码子，本研究认为是 )*0，而网上公布的结果 上却是 **0，具体位置如图 !所示。得到的 (>60结 果经过保守域（’1）搜索后表明所有功能区完整，是 可能存在的；这样 (>60的长度是 5,2个氨基酸残基 而非 5,-个。 图 ! ! " ,-.-#" )*’’!+$,-的 .&$0基因的起始密码子分析结果 K>N"! *EH O?OPQ@>@ AH@RPS CT @SOAS ’C?LC? CT .&$0 CT ! " ,-.-#"
)*’’ !+$,- 这个结果与我们对另一株菌 ! " ,-.-#" )*’’ !2-:,核黄素操纵子中 .&$0基因的分析结果相吻合
（其 (>60有 5,2个氨基酸残基）。并且这两株蜡样
芽孢杆菌 .&$0基因的起始密码子 )*0前 :67处都 可以找到富含 0’ 的 /1 序列，其中包含保守序列 “)00)”；如果以 **0为起始密码子，则无法在它的 前面找到这样的序列。这就进一步说明了本文的结 果更为可靠。 #"# ! " ,-.-#" )*’’ !+$,-核黄素操纵子的克隆
利用设计引物，扩增出一段长度为 +"$I6 的 1F)片段，将 &’( 产物用 234 8 酶切后和 7M&!5U 连接转化到大肠杆菌中。通过质粒提取和酶切鉴 定，得到了有目的片段插入的重组质粒，将该重组质 粒命名为 7M&;.’(!+。 #"5 带有 7M&;.’(!+ 的大肠杆菌过夜培养物的 M&9’分析 含有 7M&;.’(!+ 的大肠杆菌过夜培养物显示 出明显的黄色，推测这可能是转化子合成并向培养 基中分泌了核黄素。将过夜培养物离心后，取上清 液按照文献［!#］所述的方法进行 M&9’定性分析， ·,2· 生物加工过程 第 #卷第 #期 万方数据 分析结果见图 !。 "#$%&’(&)( *&+,-. /0 )12/0-&31’
4# $5,.)’&%&’% /0 /3.)’167% 85-%5). 图 ! 核黄素的 9:;<定性 =16>! ?7. @5&-1%&%13. &’&-A*1* /0 )12/0-&31’ 2A 9:;< 在色谱条件下，核黄素得到了充分的洗脱和分 离。图 !"中标准核黄素的保留时间为 !>BC +1’，而 图 !4中上清液中的峰 D的保留时间亦为 !>BC +1’， 可以定性为核黄素峰。这样就表明克隆到的 EF" 片段确实是含有核黄素操纵子（酶切图谱见图 D）， 并且 ! > "#$#%& "?<< GHICJ 核黄素操纵子可以在大
肠杆菌中表达。
图 D ! ’ "#$#%& "?<< GHICJ核黄素操纵子的酶切图谱 =16#D K.*%)18%1/’ +&, /0$() /,.)/’ /0 ! ’ "#$#%& "?<!>H 核黄素缺陷型互补实验
将 ,9:L4! > &%)*(+(& G"!GM 中后在基本培养基上划线，并在
DCN下培养 OM 7（同时以 G"!GM作为对照），结果见
图 H。
图 H 核黄素缺陷型互补实验
=16#H K12/0-&31’ &5P/%)/,7 8/+2-.+.’%)3 .P2.)1+.’%
从图 H 中可以看出只有含有质粒 ,9:L4的菌株生长情况良好。这表明该操纵子可以在枯草
芽孢杆菌中表达。
!>I ! > "#$#%& "?<< GHICJ 核 黄 素 操 纵 子 在
! > &%)*(+(& !HKE中的表达
将质粒 ,9:L4 &%)*(+(& !HKE中。
! > &%)*(+(& !HKE是一株可过量积累核黄素的枯草杆
菌，其核黄素表达的调控机制已被解除，本身产生少
量的核黄素。在本研究中使用的发酵条件下对
! > &%)*(+(& !HKE Q ,9:L4测定，发酵结果显示带有和不带有质粒 ,9:L4的 ! > &%)*(+(& !HKE 的核黄素产量没有明显的变化
（结果见图 C）。这可能是因为该核黄素操纵子位于
编码区前面的调控序列具有正常的调控作用。根据
文献［B］［GO］［GC］的研究，枯草杆菌中类似序列的转
录产物可以形成 K=F结构，该结构可以直接感知细
胞内的 =RF Q ="E 的浓度，并根据这些代谢物的浓
度在终止子 S 反终止子这两种结构之间变换；当
=RF Q ="E的浓度较高时，形成的终止子构象可以引
起操纵子转录的提前终止。转录 K=F结构的序列
（ $,-.)/0）具有保守性，蜡样芽孢杆菌的核黄素操纵 子编码区前的调控序列中也可以搜索出$,-.)/0 保
守序列但无实验验证［B］，因此该操纵子可能也受到
K=F机制的调控。
!>O ! > "#$#%& "?<< GHICJ核黄素操纵子启动子的
替换与修改后操纵子的表达
根据上述的结果，推测更换核黄素操纵子的启
动子区域可能会增加核黄素操纵子表达。在构建以
蔗糖为发酵碳源的基因工程枯草芽孢杆菌时，常用
到 &1"4启动子，而且这个启动子也容易获得［C］。因
此选用这个启动子来替换操纵子上原有的启动子。
:右的 :见图 I。
图 I &1"!启动子的酶切图谱
=16#I K.*%)18%1/’ +&, /0 &1"4 ,)/+/%.)
替换启动子的 :!MMH年 I月 王靖宇等：蜡样芽孢杆菌 "?<万方数据
出虽然 !"#产物的长度并不唯一，但是明显的出现
了有所要的长度为 $%& ’( 左右的更换启动子的操 纵子片段。将 !"# 产物用 !"#$ ) 酶切后连接到
*+!,-.上。用重组质粒为模板进行 !"#扩增 %"&/
启动子（用扩增 %"&/的体系和条件），检查质粒的正
确性，同时以质粒 *+!0/"#,$和 1/,2$的染色体作
为对照（见图 3/）。图 3/的结果表明 $%& ’(左右大 小的目的片段确实是被 %"&/启动子替换了启动子 的核黄素操纵子。 45#6789:7 ;< :=6 76>;?@ !"# !：!"# *A;@8>: .：1B4 ,C( DE@@6A /5 #6789:7 ;< !"# @6:6>:F;? ;< !7E>/ 4：!"# *A;@8>:（:EG*9E:6：>=A;G;7;G6 ;< 1/,2$）
/：!"# *A;@8>:（:EG*9E:6：*9E7GF@ ;< :AE?7<;AGE?: , H）
"：!"# *A;@8>:（:EG*9E:6：*9E7GF@ ;< :AE?7<;AGE?: I H）
1：!"# *A;@8>:（:EG*9E:6：*9E7GF@ ;< :AE?7<;AGE?: - H）
J：!"# *A;@8>:（:EG*9E:6：*+! K /"#,$） .：1B4 ,C( DE@@6A 图 3 !"#结果 LFM53 #6789:7 ;< !"# 将重组质粒命名为 *+!0N/"#,$，并将该质粒转
化到受体菌 ! % %’()*+*% I$#1中；对转化子进行核黄 素发酵，以 ! % %’()*+*% I$#1为对照。发酵结果如图
O所示。
从图 O中可以看出含有重组质粒 *+!0N/"#,$的 ! % %’()*+*% I$#1的核黄素的产量与对照相比有了
一定的提高。这表明 ! % &,-,’% 4P"" ,$&OQ 的核黄 素操纵子在替换启动子后表达有了一定程度的增 强，使核黄素的产量有了一定幅度的提高。这个结 果表明来自 ! % &,-,’% 4P"" ,$&OQ 的核黄素操纵子
成功地在枯草芽孢杆菌中实现了较好的表达，同时
这个结果也表明通过过量表达蜡样芽孢杆菌的核黄
素操纵子来生产核黄素的这个思路是可以进一步进
行研究的。
从工程的角度来看，本研究中 ! % %’()*+*% I$#1 R *+!0N/"#,$核黄素产量的绝对量还不够高，这可能
是因为用 7E>/启动子表达核黄素操纵子不是很合
图 O 核黄素发酵结果
LFM5O #6789:7 ;< AF(;<9ESF? <6AG6?:E:F;?
适，应该进一步从 G#B4和蛋白质的水平来考察该
外源核黄素操纵子在细胞内的表达情况。此外，根
据代谢工程相关部分的理论，我们考虑使用强的组
成型启动子来表达该核黄素操纵子，并使用基因扩
增技术，使该核黄素操纵子实现高水平的表达，使该
研究结果达到工业化的要求。
参考文献：
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-,&,5
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·OI· 生物加工过程 第 I卷第 I期
万方数据
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%&$R%& ,)%520)6 -20:$8$0;$ 20 #52;&$@5;)6 N0A50$$850A（第九届全国 生物化工学术会议论文集）［-］，>""" ? ［!W］=%$50@$%X 4，7$ -2I B，E9@$85;& =*$% )6*+&$B,E ’$IG$0;$ 2: %&$A$0$:28 %&$ ’$;8$%$( !"#$%%&’ ’&()$%$’ $0X9@$ 6$F)0’G;8)’$ )0( 5%’ A$D 0$%5; ;20%826 ’5%$’［C］* 426 Y$0 Y$0$%，!RSK，>""：>>" Z >>S ?
［!K］ Q&)8@);2H2$5) 2: Q*U*-&50)（中华人民共和国药典）［4］* !RRKNB? #$5[50A：-&$@5;)6 .0(G’%89 Q8$’’，!RRK ?
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0)’;$0% U,E：) @$;&)05’@ %2 ;20%826 %8)0’;85H%520 50 1);%$85)［C］* -$66，>""J，!!!：LWLDLK\ ?
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（上接 KR页）
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