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6　 PRACTICAL FORES TRY TECHNOLOGY
二★一★年第十二期　林业实用技术
黄波罗离体生长与部分培养因子的关系
白荣芬　郑　颖　张利萍　丁琳琳
(辽宁省森林经营研究所　辽宁　丹东　118002)
[ 摘要] 　观察黄波罗离体生长在不同浓
度的外源生长调节物质 、光照强度 、光照
时间 、温度 、pH 值和培养时间下的表现 ,
用数字的形式分别说明各因素的影响 ,从
控制环境的角度改善黄波罗离体培养方
式。结果表明:NAA+BA 组合的芽分化
率和变异率均好于 NAA+KT 组合;在生
长环境的试验中 , 经极差分析发现:光照
强度对温度和 pH 值的影响最大 , 生物量
和光照时间有最显著的关系;相同外植体
的瓶苗在接种初期对温度比较敏感 , 当温
度达到 23 ℃时是瓶苗生长关键期 , 到
26 ℃时已经发现有 56.24%玻璃化苗。
[ 关键词] 　黄波罗　离体生长　玻璃化
　国家二级保护植物　中草药
黄波罗(Phellodend ron amurense Ru-
pr)又名黄蘖 , 芸香科 , 落叶乔木 , 常生长
在水土肥沃的河边 、溪边 ,为水土保持 、生
态维护起着不可替代的作用。《本草纲
目》载:“黄蘖主治湿热 、肾热 , 热毒下利及
吐血 , 滋阴降火。” 果实还可用于制酒 , 叶
可作为染料和栲胶原料。由于黄波罗在
生态领域 、医药领域及经济领域的适用价
值 , 加之过度开发 ,天然资源呈下降趋势 ,
《中国植物红皮书》将其列为渐危种[ 1] 。
目前黄波罗已经被列为国家二级保护植
物[ 4] , 保护和发展黄波罗资源十分迫切。
而传统的播种育苗繁殖速度慢 、苗木质量
低 、易遭受病害 、冻害。 利用离体培养的
方式开展育苗造林的研究是扩大黄波罗
种群 、合理保护和利用黄波罗资源的有效
途径。国内吴克贤等 1990 年已报道 , 利
用组织培养手段培养黄波罗[ 5] ,但是在繁
育过程中有不同程度的变异苗及玻璃化
苗产生。实践证明玻璃化瓶苗极难生根 ,
所以 , 我们选取黄波罗离体生长过程中的
诱导阶段 , 旨在提高离体繁殖苗的品质。
1　试验
1.1　试验材料的采集与选取
试验种子于 2008 年 12 月中旬采自
辽宁省本溪县偏岭镇新农村(E123°57′,
N41°24′)黄波罗多年生成熟母树 , 取回后
直接洗净果皮 , 贮藏于 3 ℃的冰箱内 1 个
月 ,在无菌操作台内用 0.1%的 Hgcl溶液
消毒 8 min ,用无菌水漂洗 5 次 ,剥去种皮
打破休眠 , 取出胚珠直接接种于 MS +
IBA 0.5 mg/ L的培养基中 , 培养 5 d 后便
已萌出新鲜的黄绿色的子叶 , 在 10 d 后茎
段生长至 3 cm 左右时已形成完整植株的
情况下 ,选出达到下述各要求的外植体进
行试验:(1)具 3片淡绿色叶片 , 1 支主脉;
(2)基部没有愈伤组织形成;(3)均为成熟
种子发育而成的顶芽;(4)长度均 1.5 cm
左右。本次试验每次处理每瓶均放置 2个
外植体 , 每个处理接种 10 瓶且培养 4 个
周期。
1.2　试验方法
1.2.1　生长素和分裂素调试　各外植体
接种完成后带到培养室观测 , 包括外植体
颜色 、长 、宽 、愈伤组织质量等 ,后转瓶。培
养基的处理按在MS 培养基中别添加 NAA
0.05、0.06 、0.08、0.09、0.1 mg/ L+BA0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ L 和 NAA 0.05、0.06、
0.08、0.09、0.1 mg/ L +KT0.1 、0.2 、0.3、
0.4 、0.5 mg/ L , 编号 A1-A50 , B1-B50 ,
100个处理砂糖浓度均为 20 mg/ L , pH 值
5.8 , 光照为 1 600 lx , 温度为 20 ℃的环境
培养 , 培养时间设置为 21 d , 相对湿度
70%～ 80%,空调房育苗 , 精心管护。
1.2.2　光照时间 、光照强度试验设计方
案　光照强度分别设置 1 000 lx和 2 000 lx
日光灯源安放在容器的正上方 , 设置不同
的光照周期;外植体均来自同一培养基中
的相同材料 , pH 值为 5.8 , 砂糖浓度
20 mg/ L ,琼脂 8 g/ L , 乙烯膜封口 , 温度
20 ℃的环境培养;实验设置两组实验编
号分别来测定温度 、pH 值 、生物量和玻璃
化苗发生率 , 试验每个处理每瓶均放置 2
个外植体 , 每个处理接种 10 瓶且 3 次重
复。按照正交试验设计方法。
1.2.3　数据处理　实验数据利用 EX-
CEL2003 进行归集处理 , 数据分析采用
SPSS Statistics 17.0 软件。
分化率=(诱导出丛生芽数/接种外
植体总数)×100%;
变异系数=变异总数/诱导出芽的外
植体总数;
玻璃化苗发生率=玻璃化苗发生率/
该外植体诱导出的不定芽总数×100%。
2　结果与分析
2.1　不同培养基中发芽率和整体分化率
性状及差异分析
从表 1中的考核指标中可以看出:当培
养基中添加 NAA+BA 时, 芽分化率平均高
达54.79%, 变异系数平均为 15.18%;在
NAA + KT 的 组合中分化率 平均达
43.83%,变异系数平均为 32.33%。比较
这两个组合不难看出 NAA+KT 中黄波
罗组培苗的变异幅度较大 ,而分化率明显
不如 NAA+BA 组合。
在激动素 KT 和 BA 的组合比较中发
现 , KT 组合产生的组培苗更易脱叶 , 变
黄 ,经继代培养后 BA 培养基中的茎丛基
部仍有许多不定芽点或芽周围膨大。在离
体培养条件下细胞分裂素诱导细胞壁松驰
度两者相照 , KT 产生的黄色愈伤组织更
多。因此在综合以上因素的比照下选择
NAA+BA 组合作为下一步试验的培养
基, 其中 NAA 0.06 mg/ L+BA0.8 mg/ L
效果最佳。
方差分析结果表明:对于平均芽分化
率而言 ,分裂素成分与养殖体分化率的交
互作用极显著 , 可见 , 不同的分裂素对不
定芽的增殖有明显的效果。
2.2　不同光照对温度和 pH 值的影响
选出 NAA 0.06 mg/ L+BA 0.8 mg/ L
组合中的瓶苗做为下一步试验的材料 ,
按照确定好的因素位级 ,均匀设置不同的
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PRACTICAL FORES TRY TECHNOLOGY 7　
二★一★年第十二期　林业实用技术
表 1　不同培养基中黄波罗组培苗发芽和分化率的比较 (单位:%)
试验指标 NAA+BA NAA+KT
不经过愈伤组织
阶段的分化率/ %
均值
变幅
变异系数
57.11
51.00 ～ 63.22
8.12
47.00
13.00 ～ 81.00
34.15
愈伤组织
分化率/ %
均值
变幅
变异系数
34.61
25.00 ～ 44.22
14.75
37.00
11.00 ～ 63.00
30.55
平均芽分
化率/ %
均值
变幅
变异系数
72.66
54.20 ～ 91.11
22.68
47.48
10.38 ～ 84.57
32.30
表 2　黄波罗瓶苗温度 、pH 值和生物量 L8(24)正交设计与结果
试
验
号
光照
时间
/ h
暗培养
/ h
光照
强度
lx
实验结果
温度
/ ℃ pH 值
生物量
/g
C1 12 10 1 000 20.10 6.10 13.25
C2 12 8 1 000 20.30 5.90 10.37
C3 10 8 1 000 20.80 6.00 11.58
C4 10 10 1 000 22.50 5.80 16.54
C5 12 8 2 000 23.10 5.30 11.02
C6 12 10 2 000 22.60 5.50 9.58
C7 10 10 2 000 21.50 5.90 17.81
C8 10 8 2 000 22.50 5.40 16.84
温度/ ℃ pH 值 生物量/ g 温度/ ℃ pH 值生物量/ g 温度/ ℃ pH 值生物量/g
T 1 21.53 5.70 11.06 21.68 5.83 14.30 20.93 5.95 12.93
T 2 21.83 5.78 15.69 21.68 5.65 12.45 22.43 5.53 13.81
R 0.30 0.08 4.63 0 0.28 1.85 1.50 0.42 0.88
试验条件(见表 2)。
极差分析表明 , 暗培养基本不影响温
度 , 极差为 0;光照强度对温度和 pH 值的
影响最大 , 极差分别为 1.5 和 0.42;光照
时间是影响生物量的最大因素 , 极差为
4.63;实验得出10 h 的光照时间+10 h 的
暗培养+1 600 lx 的光照强度是最有利于
生物量的增长的。
2.3　温度和 pH 值与瓶苗玻璃化的关系
分别按照 D1-D8 的实验顺序量得
平均温度和 pH 值与瓶苗玻璃化的关系 ,
我们对转瓶时间从第 22 天起每 2 d 递增
的顺序转瓶并记录温度 , 计算平均玻璃化
率结果见表 3。
表 3　不同温度和 pH 值对瓶苗
玻璃化的影响
试验
号
培养天
数/d
温度
/ ℃ pH 值
玻璃化
率/ %
D1 22 20.10 5.80 8.12
D2 24 20.30 5.90 9.02
D3 26 20.80 5.70 9.57
D4 28 22.50 5.80 8.34
D5 30 23.10 5.40 11.02
D6 32 25.60 5.50 37.01
D7 34 24.50 5.40 12.35
D8 36 26.50 4.80 56.24
试验范围内的黄波罗瓶苗均有不同
程度的玻璃化现象 , 设置温度最好控制在
23 ℃以下应该可以有效降低玻璃化瓶苗
发生率。
我们以温度为因变量 , 其它因素不变
的情况下 ,对瓶苗玻璃化发生率作了线性
回归分析 ,得出玻璃化率的最佳分析模型
为:Y=0.011 2+0.003 2x 。
对模型回归分析结果可以看出 , 温度
和玻璃化发生率呈显著性相关。 同时我
们得出相同外植体的黄波罗瓶苗在接种
初期对温度等比较敏感 , 当培养温度达到
23 ℃时是瓶苗生长关键期 , 此期生长促进
激素消耗量大 , pH 值逐步酸化。 因为日
光光源在培养物的正上方 ,随着组培苗的
生长 ,被上层叶片遮断拦截的光不断增
加 ,只有少量的光能到达下层叶片 , 降低
组培苗的光合 , 引起光合午休 , 加之试管
苗采用乙烯膜封口 , 使管内的氧 、乙烯 、水
势随着培养时间的延长 , 氧气胁迫和水分
胁迫带来的副作用越来越强 , 产生玻璃化
苗的数率也就越来越大。
3　小结与讨论
(1)不同的植物激素种类及浓度对苗
木离体培养的发芽势 , 发芽率 , 分化率及
苗木品质等指标的影响不一样。 仅就本
次黄波罗的离体培养而言 , 在设置 BA 和
KT2种分裂素组合下 ,明显地看出 BA 组
合的分化率要好于 KT 组合 , 虽然 KT 组
合在诱导过程中更易产生愈伤组织 , 但愈
伤组织较松散 ,较 BA 刺激下产生的分化
效果要差 ,且 BA 组合产生的茎丛基更易
分化 ,不经过愈伤组织的分化率明显地好
于 KT 组合。
(2)试验发现相同黄波罗外植体的幼
芽在诱导初期对光照强度 、光照时间等比
较敏感。光强是温度和 pH 值的敏感因
素 ,生物量的增加与光照时间和暗培养有
关 ,但也与其它因子有关。 毛秀红等发
现 ,在植物生长的不同时期光照可以起到
促进作用 ,如蓝光对小苍兰的愈伤组织诱
导率 、叶绿素含量以及试管苗的干质量或
生物量有明显的促进作用[7]等。
(3)温度和玻璃化发生率呈显著性相
关 ,培养温度到 23 ℃时玻璃化苗的发生
率便有显著性提高。有报道提出 , 设置调
节光照度的组培装置 , 通过调节亮灯数达
到调节光量子能量 ,可有效防止玻璃化苗
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8　 PRACTICAL FORES TRY TECHNOLOGY
二★一★年第十二期　林业实用技术
基于均匀设计优化无梗五加种子快速萌发条件＊
顾地周1 　高捍东2
(1.通化师范学院生物系　吉林　通化　134002;2.南京林业大学森林资源与环境学院　南京　210037)
[ 摘要] 　应用均匀设计法对影响无柄五
加种子萌发的主要因素及水平的作用进
行了实验。结果表明 , 无梗五加种子最佳
萌发条件:经改良的液体 MS 培养基浸泡
60 h ,在—14 ℃的冰箱中进行层积 100 d ,
再将种子在质量分数为 3.00 mg/ L 的
GA3 中浸泡 24 h 后即播种 , 萌发率达
99.7%以上。 无梗五加种子需经人工后
熟 、层积和打破休眠等处理后才能在当年
快速萌发。
[ 关键词] 　无梗五加　种子　快速萌发
　均匀设计　中草药　国家三级保护
植物
无梗五加 Acanthopanax sessili f lorus
(Rupr. et Maxim.)Seem.又称短柄五
加 、短梗五加 , 五加科五加属多年生落叶
灌木。其根皮 、茎及叶均可入药 , 主治风
湿痿痹 、虚劳不足 、脚气肿湿 、骨节及皮肤
疼痛 、小儿行迟 、益气健脾 、补肾安神 、心
脑血管疾病和人体免疫力低下等症。长
白山区是无梗五加主产地 , 科研 、食用和
药用的无梗五加大多来源于自然采掘 ,使
得自然资源遭到严重破坏 , 该物种已处于
濒危状态 , 被列为国家三级保护植物 , 《中
国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》中定
＊国家科技部“国家科技攻关计划引导项
目”资助项目(2005BA741C)。
作者简介:顾地周(1973—),讲师 ,主要从事
长白山区珍稀濒危和珍稀濒危药用植物研究。
为渐危种 ,《中国物种红色名录》定为易危
种[1] ,《吉林省野生动植物保护管理暂行
条例》中定为省级一类重点保护植物 , 为
急需保护植物。经多处实地考察可知 , 未
见无梗五加灌木丛下有实生苗 , 说明种群
自然更新较难。 扦插生根率和移栽率极
低 ,种子发芽极其困难 , 当年播种发芽率
极低 ,大多隔年发芽 , 给种苗繁殖带来诸
多不便。为解决人工繁殖中种子萌发率
低的难题 , 本试验采用营养液结合低温处
理等方法对无梗五加种子萌发进行探索 ,
同时 ,应用均匀设计对无梗五加种子萌发
的条件进行筛选 , 以期获得其种子最佳萌
发条件。目前 ,关于无梗五加种子萌发的
报道较多[ 2-6] , 但采取营养液结合低温处
理方面的研究尚未见报道。
1　材料与方法
1.1　种子采集与处理
10 月末于吉林省哈尼河湿地国家级
自然保护区阔叶林林缘采无梗五加成熟
果实 ,在实验室内将果粒脱下 , 水泡至果
肉腐烂 ,手搓使果肉与种子完全脱离 , 水
漂洗 3 次取沉于水底的种子晾干后备用。
1.2　方法
将种子在改良的液体 MS 培养基(1/ 4
大量元素 、1/ 4 微量元素 、1/2 铁盐和 1/ 6
有机成份)中浸泡 7 d 后捞出沥干水, 与河
沙 1∶2 混合均匀后 ,在阴暗处放置 75 d ,
温度控制在 10 ～ 15 ℃。然后在冰箱中进
行低温处理(由预试验可知 ,温度范围控制
在-10±2～ 0±2 ℃之间)一定时间(30 ～
86 d 之间)后, 从冰箱中取出种子在 GA3
(0.50 ～ 2.50 mg/ L)中进行打破休眠处理
24 h , 将无梗五加种子(含有河砂)均匀播
种到田园土∶细河沙(3∶1)的基质中进
行发芽试验。
1.3　数据分析与处理
为了提高无梗五加种子的萌发率和
萌发速度 , 采用均匀设计法[7-9] , 选用
U 9(93)均匀表 , 每个处理种子数为 100
粒 ,重复 3 次 ,同时考察了处理温度 、处理
时间及赤霉素 GA3 浓度的交叉配比对无
梗五加种子萌发率的影响 , 60 d 后统计发
芽率。数据分析与处理采用均匀设计(U-
nifo rm Design)软件。
2　结果与分析
所得数据(见表 1)经均匀设计软件处
理 , 得回归方程 Y =48.0 -3.14X1 +
0.148X2 +3.13X3 , 样本容量 N=9 , 显著
性水平α=0.05 , 复相关系数 R=0.993
2 , 检验值 Ft=122.2 , 临界值 F(0.05 , 3 ,
5)=5.409 , F t>F(0.05 , 3 , 5), 回归方程
显著。对各方程项进行显著性检验可知 ,
各方程项对 Y 影响均显著。根据回归方
程求出 Y 的最优组合为:X1 =-10 , X2 =
86 , X3 =2.50 , 在此组合基础上求得最低
萌发率:y=100 , 此解为方程的解析解 , 需
按公式 Y=y ±uα·s(其中 y 为最优组合
基础上求得的最优解 , uα为正态分布的双
侧分位数 , s 为剩余标准差)计算出优化值
的发生;如果在繁殖过程中采取透气性封
口膜 , 在传统光照的基础上增加侧向光
照 , 提高空间和有效辐射的利用率 , 对玻
璃化的发生有预防的作用;也有提出设置
新型光源 , 如发光二极管(LED)作为植物
生长的光源 , 对预防玻璃化的发生也有积
极的预防作用。
参考文献:
[ 1] 　傅立国 ,金鉴明.中国植物红皮书———稀
有濒危植物.第 1册[ M ].北京:科学出
版社 , 1992.
[ 2] 　王　蒂,王玉国.植物组织培养[ M].北京:
中国农业出版社 , 2004.
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殖影响的研究[ J] .植物研究 , 28(6):
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株再生[ J].林业科技 , 1990(3):4-7.
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