全 文 ：祖师麻对巨噬细胞分泌 VEGF和表达 H IF - 1a的影响*
张文亮 , 王淑美 1** , 贾萍2 , 李荣亨 2
(重庆医科大学 , 1重庆医科大学中医药学院 , 2重庆医科大学附属第一医院中西医结合科 ,重庆　 400016)
　　提　要　目的:观察祖师麻注射液对巨噬细胞分泌血管内皮生长因子 (VEGF)的影响并探讨其机制。方法:将巨噬细胞
RAW 264. 7与脂多糖及不同浓度的祖师麻注射液共同培养 , MTT法检测细胞的增殖 , ELISA检测细胞培养液中 VEGF的含量 ,
W stern b lo t检测缺氧诱导因子 - 1a(H IF - 1a)的表达。结果:随着祖师麻浓度从 218. 7mg /m l下降至 0. 3m g /m l, 其对 RAW 264. 7细
胞增殖的抑制率也从 34. 04%下降至 2. 28%;经 218. 7mg /m l、72. 9mg /m l、24. 3m g /m l祖师麻处理后 , RAW 264. 7细胞分泌的 VEGF
从 1895±155 pg /m l分别减少至 1029±175 pg /m l、1575±186 pg /m l、1550±217 pg /m l,同时细胞内 H IF -1a的表达也明显降低。结
论:祖师麻注射液可抑制巨噬细胞 RAW 264. 7分泌 VEGF, 其机理与抑制 H IF -1a的表达密切相关。
　　关键词 　祖师麻;巨噬细胞;血管内皮生长因子;缺氧诱导因子 - 1a
　 　类风湿关节炎 (Rheum a to id A rthritis, RA)的主要病理特征
是滑膜的慢性炎症和异常的血管生成 (即血管翳)。祖师麻具
有祛风除湿 、活血止痛功效 [ 1] ,临床用于 RA的治疗具有疗效显
著 、低毒 、价格低廉的特点 [ 2]本实验观察了祖师麻注射液对巨
噬细胞分泌血管内皮生长因子 (vascu lar endothe lia l g row th fac-
tor, VEGF)的影响并从缺氧诱导因子 -1a(hypox ia- induced fac-
tor -1a, H IF -1a)途径探讨其作用机制。
1　材料与方法
1. 1　试验药物　祖师麻注射液为万荣三九药业有限公司 , 规
格:0. 5g生药 /m l,每毫升注射液含瑞香素不少于 0. 15m g,批号:
040812。
1. 2　 试剂 　LPS(Sigm a公司);噻唑兰(MTT)(均 Am resco公
司);DMEM培养基(Hyc lone公司);胎牛血清(FBS,杭州四季青
生物公司);H IF -1a抗体 (San ta C ruz公司 );VEGF ELISA试剂
盒购自深圳晶美生物工程公司。
1. 3 　细胞　RAW 264. 7细胞由重庆医科大学药学系徐晓玉教
授惠赠 , 用含 10%FBS的 DMEM培养液培养于 37℃、5%CO2条
件下。
1. 4　方法　
1. 4. 1　 M TT检测　96孔板每孔接种 5×103个细胞 , 培养 24h
后 , 将细胞分组如下:LPS组(10μg /m l LPS);按照每毫升注射液
的生药含量将祖师麻分为 7组 , 剂量分别为 218. 7m g /m l、 72.
9m g /m l、24. 3m g /m l、8. 1 mg /m l、2. 7 m g /m l、0. 9 m g /m l、 0. 3m g /
m l, 均与 10μg /m l LPS共同培养 48h后 , 加入 MTT至终浓度为
5m g /m l, 培养 4h, 弃培养液 ,每孔加入 100μl DM SO ,振荡 10m in。
590nm酶标仪检测各孔吸光度值。计算抑制率:抑制率 =(1 -
各组 OD值 /LPS组 OD值)。
1. 4. 2 　ELISA检测　24孔板每孔接种 5×104个细胞 , 培养
24h后 ,加入终浓度为 218. 7m g /m l、 72. 9m g /m l、24. 3mg /m l的祖
师麻 , LPS组(10μg /m l LPS), 培养 48h后收集培养液 , 离心 ,取
上清 , -80℃保存备用。 ELISA实验步骤按照试剂盒说明书操
作进行 , 酶标仪检测 450nm的吸光度。
1. 4. 3　W estern b lo t法检测　以每孔 1×106个细胞的密度接
种细胞于 6孔板 , 培养 24h后 , 分组与加药同 1. 4. 2, 培养 48h
后 , PBS洗 2次 , RIPA缓冲液溶解细胞 (50mmo l /L T ris - HC l
(pH7. 6)、 1% NP - 40、 0. 5%去氧胆酸钠 、 0. 1% SDS、1mm o l /L
PM SF、21μg /m l Apro tinin、 0. 5μg /m l Leupeptin), 4℃、 12000 rpm
离心 10m in,取上清 , Low ry法检测蛋白浓度。加入等体积 2 ×
SDS加样缓冲液(125 mm o l /L T ris -HC l(pH 6. 8)、20%甘油 , 0.
01%溴酚蓝 、 4% SDS、200 mm o l /L DTT),沸水浴中加热 5m in,
每孔加入 30μg总蛋白进行 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 转移蛋
白质至 PVDF膜 ,含 5%脱脂奶粉的 TBST缓冲液封闭 , H IF - 1a
抗体 、Ⅱ抗分别与膜孵育 , 显色 ,分析条带吸光值。
2　结果
2. 1　祖师麻对巨噬细胞增殖的影响 　如图 1所示 , 巨噬细胞
与不同浓度的祖师麻共培养 48h后 , 祖师麻对细胞增殖的抑制
率随着药物浓度的降低而下降 , 抑制率从 34. 04%(ZSM 218.
7mg /m l)下降至 2. 28%(ZSM 0. 3m g /m l)。
图 1　祖师麻对巨噬细胞 RAW 264. 7增殖的影响
1为 LPS 10μg /m l组 , 2 ～ 8分别为 ZSM 218. 7mg /m l、 72. 9m g /m l、 24.
3m g /m l、 8. 1m g /m l、2. 7m g /m l、0. 9 mg /m l、 0. 3m g /m与 LPS 10μg /m l共
同培养组
2. 2　祖师麻对巨噬细胞分泌 VEGF的影响　如表 1, RAW 264.
7细胞受到 LPS刺激后 ,其分泌的 VEGF的量显著增加 ,但如果
同时加入祖师麻 ,其 VEGF分泌量被显著抑制。
表 1祖师麻对巨噬细胞 RAW 264. 7分泌 VEGF的影响 (–x±s)
分组 　　　　　　　 浓度(m g /m l) VEGF含量(pg /m l)
空白对照 455±89
LPS 0. 01 1895±155
ZSM 218. 7 1029±175**
ZSM 72. 9 1575±186*
ZSM 24. 3 1550±217*
　　与 LPS组比较*P<0. 05, ** P<0. 01
39中药药理与临床 2007;23(2)
* 基金项目:重庆医科大学科 [ 2005] 8号　　　　**通讯作者
DOI牶牨牥牣牨牫牬牨牪牤j牣cnki牣zyy l牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牪牨
2. 3　 祖师麻对巨噬细胞表达 H IF - 1a的影响　如图 2所示 ,
祖师麻 72. 9mg /m l和 24. 3m g /m l均可抑制巨噬细胞 RAW264. 7
受 LPS刺激后表达 H IF -1a, 特别是 218. 7m g /m l的祖师麻抑制
作用非常明显。
图 2　祖师麻对巨噬细胞 RAW 264. 7表达 H IF -1 a的影响
3 　讨论
　　滑膜细胞异常增殖是 RA的重要特征 ,滑膜组织中大量的
新生血管则为滑膜细胞的异常增殖提供了养分 、氧气和带走代
谢废物 , 所以 ,滑膜的血管生成在 RA炎症的持续和关节的侵蚀
中起了重要作用 [ 3] 。 VEGF是一种强有力的促血管生成因子 ,
在 RA滑膜的血管生成中扮演了重要角色。 VEGF在 RA病人
的滑膜 、滑液和血清中均可以检测到高表达 , 滑膜细胞 、巨噬细
胞的炎性细胞是 VEGF的主要来源细胞 [ 4] 。在本实验中 , 巨噬
细胞 RAW 264. 7受到脂多糖刺激后 , 其表达的 VEGF明显增加 ,
而祖师麻可显著抑制该作用 , 提示祖师麻作为已经用于临床治
疗 RA的药物 [ 2] ,抑制巨噬细胞表达促血管生成因子是其治疗
RA的一个重要机制。
Lund -O lesen等研究发现 [ 5] , RA病人膝关节滑液的氧分
压低至 27 mmHg, 而正常人为 43 mmH g, 滑液中糖含量低 , 乳酸
浓度高 , 提示 RA病人膝关节局部处于缺氧状态。 H IF - 1a是
调节细胞应对缺氧环境的重要转录因子。缺氧可诱导巨噬细
胞内 H IF - 1a表达上调 , 增强 VEGF mRNA的稳定性和促进
VEGF基因的转录表达 ,最终促进组织血管生成 ,增加局部供血
供氧 [ 6, 7] 。在证实祖师麻可抑制巨噬细胞表达 VEGF后 , 我们
进一步深入探讨了其机制。我们发现祖师麻可以显著抑制 LPS
刺激后的巨噬细胞表达 H IF - 1a,以 218. 7m g /m l的祖师麻作用
最为明显 。综上 , 在本实验中 , 我们首次发现祖师麻治疗 RA的
机制与其可通过抑制 H IF - 1a的表达从而抑制 VEGF生成密切
相关。
参考文献
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ducib le factor 1a bym acrophages in the rheum atoid synovium:imp lications for
targeting of th erapeu tic genes to th e in flam ed join.t A rth ritis Rheum , 2001;44
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The effects ofZushmi a injection (祖师麻注射液 )on the expression ofVEGF and H IF - 1a in RAW 264. 7 cells
ZhangW en liang ,W ang Shum ei , Jia P ing, L i Rongheng
( Chongqing Medica lUniversity, Chongqing　 400016)
　　Objec tive:To investigate the e ffects o f Zush im a injection(ZSM)on the exp ression o f v ascu lar endothe lia l g row th factor(VEGF) in m ac-
rophages and exp lo re the m echanism. Methods:RAW264. 7 cells w ere co - incubated w ith lipopolysaccha ride(LPS)and va rious dose s o f
ZSM. MTT assay w as used to identify the pro life ra tion of ce lls. The secretion o f VEGF quantified by EL ISA test and the exp ression H IF - 1a
w as analyzed by weste rn b lo t assay. Resu lts:W hen the dose s o f ZSM reduced from 218. 7mg /m l to 0. 3mg /m l the inhibition ra te o f ZSM on
RAW 264. 7 ce lls decreased from 34. 04% to 2. 28%. A fte r added ZSM a t the doses o f 218. 7m g /m l, 72. 9mg /m l, 24. 3m g /m l to ce lls, the
secretion o fVEGF decreased from 1895±155 pg /m l to 1029±175 pg /m l, 1575±186 pg /m l, 1550±217 pg /m l sepa rate ly, and a t the sam e
tim e, the expression of H IF - 1a a lso decrea sed m a rkedly. Conc lu sion:ZSM can rem arkably reduce the secretion of VEGF, and its m echa-
nism m igh t be associa ted w ith inhibiting the expression of H IF - 1a.
　　K ey words　Zush im a(祖师麻);m acrophage;vascu lar endo the lial g row th factor;hypoxia - induced fac to r- 1
制附子及其不同配伍对小鼠实验性微循环障碍的影响
韩涛 , 程小丽 ,刘晓东 , 高丽丽 ,时贵云
(甘肃中医学院药学系 ,兰州 　 730000)
　　提 　要 目的:观察制附子及其不同配伍对实验性小鼠微循环障碍的影响。方法:采用活体微循环观测技术 , 观察制附子不
同配伍对小鼠耳廓局部滴加肾上腺素(Adr)所致微循环障碍的影响。结果:制附子不同配伍能明显扩张小鼠耳廓微血管 , 增加血流
40 中药药理与临床 2007;23(2)