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金腰带联合甲基强的松龙对脊髓损伤大鼠行为学及脑源性神经营养因子表达的影响



全 文 :doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2015.02.25 J South Med Univ, 2015, 35(2): 276-280
脊髓损伤(SCI)是中枢神经系统的严重损伤[1],致
死、致残率高,因此研究其修复机制、寻找有效的治疗策
略意义重大。
研究提示,神经损伤后不少细胞因子的表达发生了
明显改变[2-4],而这些改变可能是导致损伤神经形态结构
变化的分子基础。脑源性神经营养因子(BDNF)是神
经生长因子家族成员中的第2成员,其功能与神经元存
活、增殖、分化、诱导神经突起生长和对损伤后的神经再
生发挥促进作用有关[5-9]。将胚胎鼠脊髓移植入成年大
鼠脊髓后发现移植物周围BDNF的表达均明显增加[10],
可见BDNF在神经元发育和神经损伤修复中具有重要
作用。
甲基强的松龙(methylprednisolone, MP)用于急性
脊髓损伤的治疗已有数十年的历史,美国国立急性脊髓
损伤研究会(National Acute Spinal Cord Injury Study,
NASCIS)第Ⅱ、Ⅲ期的大量临床试验结果证实,于急性
Effect of Gold Belt combined with methylprednisolone on motor function and brain-derived
neurotrophic factor expression in rats following traumatic spinal cord injury
LI Cuiying1, XU Zhengguang2, WANG Tinghua3
1Department of Pathogen Biology and Immunology, 3Institute of Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500,
China; 2Yuxi Traditional Chinese Medicine Hospital , Yuxi 653100, China
摘要:目的 探讨金腰带和甲基强的松龙联合应用对脊髓损伤(SCI)大鼠的疗效及其对脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影
响,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法 将雌性SD大鼠30只随机分为:(1)假手术组;(2)脊髓挫伤组;(3)甲基强的松龙
治疗组(术后8 h内肌注50 mg/kg,此后每天甲基强的松龙肌注量减少10 mg/kg);(4)金腰带治疗组(50 mg/kg,每日1次灌胃);
(5)金腰带和甲基强的松龙联合治疗组(两种药物及给药方法相加)。采用BBB评分系统对后肢运动功能进行评分。对大鼠脊髓损伤
术后4周的脊髓切片进行BDNF免疫组化染色,观察阳性细胞定位、分布以及数量变化。用方差分析进行多个样本间比较。结
果 BDNF免疫反应阳性产物主要分布于脊髓灰质腹角和背角神经元。联合治疗组BDNF阳性神经元数量以及BBB评分分值
较假手术组、脊髓挫伤组、甲基强的松龙治疗组和金腰带治疗组均显著增高, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 甲基强的松龙
和金腰带联合治疗脊髓损伤的疗效优于单纯甲基强的松龙治疗组和金腰带治疗组,其发挥疗效可能与上调BDNF表达有关。
关键词:金腰带;甲基强的松龙;脊髓损伤;脑源性神经营养因子
Abstract: Objective To study the effects of a Gold Belt (GB, a traditional Chinese herbal medicine) combined with methyl-
prednisolone (MP) on the motor function and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in rats with contusive spinal
cord injury (SCI). Methods Thirty adult female SD rats were randomly divided into 5 equal groups, namely the sham-operated
group, SCI group, SCI with MP treatment group (MP group, with intramuscular injection of 50 mg/kg MP within 8 hours after
SCI and then dosage reduced 10 mg/kg daily), SCI with GB treatment group (GB group, with intragastric gavage of GB 50 mg/
kg once daily for 7 days), and combined GB and MP treatment group. The Basso, Beattie & Bresnahan (BBB) locomotor scale
was used to evaluate the hindlimb motor function of the rats on days 1, 3, 7, 14, 21 and 28 after the injury. After the last
evaluation the rats were sacrificed for immunohistochemistry to observe the localization of BDNF in the ventral and dorsal horn
of spinal cord. Results BDNF were distributed mainly in neurons in the spinal cord grey matter ventral horn and dorsal horn of
the rats. The number of BDNF-positive neurons and BBB scores in the combined treatment group were significantly higher than
those in the other 4 groups (P<0.05). Conclusion GB combined with MP produces better therapeutic effects for treating SCI than
GB or MP used alone, and such effects are probably related with enhanced BDNF expression in the spinal cord.
Keywords: Gold Belt; methylprednisolone; spinal cord injury; brain-derived neurotrophic factor
金腰带联合甲基强的松龙对脊髓损伤大鼠行为学及脑源性神经
营养因子表达的影响
李翠英 1,许争光 2,王廷华 3
昆明医科大学 1病原生物学与免疫学系,3神经科学研究所,云南 昆明 650500;2云南省玉溪市中医医院,云南
玉溪 653100
基础研究
收稿日期:2014-07-21
基金项目:云南省自然科学基金重点项目(2012F001),云南省科技厅-昆明
医科大学联合专项重点项目(2014FA009)
作者简介:李翠英,在读博士研究生,副教授,E-mail: licuiying2002@126.
com
通信作者:王廷华,博士,教授,博士生导师,E-mail: tinghua_neuron@263.net
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SCI后8 h内进行大剂量MP冲击疗法可明显促进损伤
后脊髓功能的恢复[11],MP是目前被明确肯定疗效的药
物,但其分子机制仍未完全阐明。金腰带为瑞香科植物
垂穗荛花的花、根或茎皮。垂穗荛花又名细轴荛花、野
棉花、地麻棉、野发麻,具有消坚破瘀,止血镇痛的功效,
实验表明可用于治疗大鼠SCI[12]。在上述工作基础上,
本实验旨在探讨金腰带与甲基强的松龙联合治疗SCI
的疗效及可能的分子机制,为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
脑源性神经营养因子(BDNF)多克隆抗体(美国
Santa Cruz Biotechnology 公司)、二抗 Streptavidin-
HRP复合物(美国sigma公司)、恒冷冰冻切片机(Leica
CM1900, Germany)、二氨基联苯胺(DAB,北京中杉公司)、
光学显微镜(Leica DMI 6000 B inverted microscope,
Germany)、显微照相系统(Leica, Germany)等。
1.2 实验动物及分组
清洁级成年雌性SD大鼠30只,体质量(250±10)g,
由昆明医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为5
组:假手术(sham)组,脊髓挫伤(SCI)组,甲基强的松龙
治疗(MP)组,金腰带治疗(GB)组,金腰带和甲基强的
松龙联合治疗(MP+GB)组。每组6只大鼠。
1.3 脊髓挫伤模型制备
用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经腹腔注射麻醉大
鼠,固定于手术台上,无菌条件下行背中段正中切口,分
离椎旁肌,咬除T8~T10棘突椎板,暴露脊髓硬膜,使用
Allens脊髓打击器,采用10 g重锤自距硬膜25 mm的
高度垂直落下,造成大鼠脊髓中度损伤。假手术组仅咬
除T8~T10棘突椎板,暴露脊髓硬膜,不予重锤打击。各
组大鼠分笼饲养,喂全价饲料,自由饮水,室温(24±
5 ℃),每日行人工膀胱排尿3次。术后5 d,各组均肌注
青霉素16万U/(kg·d)。
1.4 干预治疗组
金腰带治疗组,金腰带成分配方为:芫花根童便浸
泡1周后晒干醇提物,每克成药相当于原生药3 g。每日
1次胃内灌服金腰带营养方50 mg/(kg· d),共7 d[12]。甲
基强的松龙治疗组大鼠于术后8 h内肌注50 mg/kg,此
后每天甲基强的松龙肌注量减少10 mg/kg,共5 d[13];金
腰带和甲基强的松龙联合组将前2法相加进行。假手
术组和对照组大鼠灌服等量生理盐水。
1.5 神经行为学BBB评分
按文献报道采用BBB评分[14]于术后1,3,7,14,21,
28 d 对大鼠后肢运动功能进行评分。手术组和假手术
组大鼠的存活时间均符合对双侧后肢运动功能评测的
要求,为避免评分的人为误差,采用3人分别独立观察
记录(无手术操作相关知识),取平均值。所有行为学评
估实验均在相应观察日期的早上8~9点进行。
1.6 取材与固定
术后4周对大鼠完成行为学评分后,给予4%多聚
甲醛心内灌注固定,以损伤处为中心取8 mm长的损伤
脊髓置于含20%蔗糖的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)中
脱水,制作冰冻切片(厚20 μm),用于免疫组化染色。
1.7 BDNF免疫组化染色
按下列程序进行免疫组化染色:切片经0.1 mol/L
PBS中漂洗后用3%过氧化氢孵育30 min,于5%羊血
清(含0.3% Triton X-100)37 ℃反应30 min。加入Ⅰ抗
(兔多克隆BDNF抗血清,稀释倍数为1∶1000)4 ℃孵育
24 h。0.1 mol/L PBS漂洗3次,与Reagent Kit的试剂Ⅰ
和Ⅱ(Chemicon, Anti- Rabbit/Mouse Poly- HRP IHC
Detection Kit, USA)于37℃下分别反应30 min,漂洗后
DAB显色。水洗、脱水、透明、封片。光学显微镜观察,
显微照相系统采集图像。
阳性染色结果判定:按照McCarthy等[15]的方法,细
胞着色程度分为0、1、2、3四级,分别对应无着色、轻度着
色、明显着色和深度着色。其中达到1级为阳性(若用
灰度表示,一般染色深度至少比对照大5倍)。细胞计数:
每例动物取5张切片,每张切片取5个视野(×200),背角
由浅入深取3个视野,腹角取Ⅷ~Ⅸ板层和Ⅵ~Ⅶ板层两
个视野,用方测格计数BDNF阳性细胞数,最后将各组
照片数据换算成100个方格内的平均数,进行各组比较。
1.8 统计学分析
各组动物经造模和相应处理后,行单盲实验检测,
应用SPSS 17.0统计软件包采用单因素方差分析,以P<
0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BDNF 在脊髓的分布和细胞定位
BDNF免疫反应阳性产物呈棕黄色颗粒,主要分布
于大鼠脊髓灰质腹角(图1A)和背角(图1B)神经元。阳性
免疫反应物质主要定位于神经元胞浆中,着色深,神经
元突起着色较浅,胞浆与胞核的界线清楚,胞核未见染色。
2.2 SCI后BDNF在损伤脊髓腹角和背角的变化
SCI后28 d,腹角、背角BDNF阳性细胞数均较假
手术组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与SCI组比
较,甲基强的松龙治疗组及金腰带治疗组的BDNF阳性
神经元数量进一步增加,差异有统计学意义(P<0.05)。
且金腰带与甲基强的松龙联合治疗组腹角、背角BDNF
阳性神经元数量均较金腰带治疗组、MP组、SCI组增
加,差异有统计学意义(P<0.05,表1,图 2,3)。
2.3 动物行为学变化
假手术组大鼠BBB评分显示,术后1 d大鼠的运动
功能有所减弱,但术后3 d即恢复正常至21分。然而,
与假手术组比较,脊髓损伤大鼠的BBB评分从术后1 d
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即明显下降,动物后肢运动功能几乎完全丧失。但随着
时间推移,特别是术后7 d开始逐渐有一定恢复。甲基
强的松龙和金腰带单独治疗组大鼠显示了较好的运动
功能改进,而两者联合应用后大鼠的运动功能改善更明
显,各组间比较均有统计学意义(P<0.05,表 2)。
3 讨论
3.1 联合治疗对脊髓损伤大鼠神经行为学的影响和意义
本实验发现,与SCI组比较,甲基强的松龙、金腰带
单独治疗组BBB评分值均增加,且后者高于前者,提示
金腰带的疗效优于甲基强的松龙,这一结果与之前报道
的结果类似[12-13]。然而重要的是本实验新发现甲基强的
松龙和金腰带联合应用BBB评分值最高,两者联合应
用后大鼠神经功能恢复最快最好,表明两者联合应用可
更有利于损伤神经元的修复和残存神经元的存活、维
持,从而促进神经功能的恢复。文献报道[16-17],金腰带多用
于治疗菌痢、淋病、胃痛、食积、跌打损伤、风湿性关节炎、
难产、死胎、瘙痒症、疮疡、肠炎等。MP是目前治疗急性脊
髓损伤最为有效的甾类抗炎药物。虽然甲基强的松龙
和金腰带均能促进脊髓损伤后的神经功能恢复[12-13],
但联合应用的效果至今未见报道。本研究首次发现甲基
强的松龙和金腰带联合应用后对大鼠SCI的疗效更明显,
两者联合应用为临床进一步推广应用提供了实验依据。
A B
图 1 脊髓BDNF免疫组化染色
Fig.1 BDNF expression in the spinal
cord of rats (Immumohistochemical
staining, original magnification: ×200). A:
Ventral horn; B: Dorsal horn.
Group
Sham
SCI
MP
GB
MP+GB
Spinal ventral horn
7.86±0.31
9.54±0.51*
11.98±0.41#
11.78±0.32#
15.33±2.16▲#Δ
Spinal dorsal horn
12.90±0.97
17.16±0.46*
20.18±1.58#
20.58±0.89#
61.1±5.0▲#Δ
表1 挫伤后28 d损伤段脊髓BDNF阳性神经元数量变化
Tab.1 BDNF-positive neurons in the spinal cord of the rats on day
28 after SCI (Mean±SD, n=6)
*, compared with sham group (P<0.05); #, compared with SCI group (P<
0.05); ▲, compared with GB group (P<0.05); Δ, compared with MP
group (P<0. 05).
A B C
D E F
图 2 脊髓腹角BDNF免疫组化染色
Fig.2 BDNF expression in the spinal cord ventral horn of rats (Immumohistochemical staining, original magnification: ×200).
A: Sham group; B: SCI group; C: MP group; D: GB group; E: MP+GB group; F: Negative control group.
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3.2 联合治疗促进BDNF表达的功能意义
本文发现,BDNF免疫阳性反应物主要分布于脊髓
神经元,定位于胞浆,说明大鼠脊髓神经元存活需要
BDNF的营养支持。脊髓前角(腹角)脊髓运动神经元
是控制肢体骨骼肌运动行为的主要执行者,与动物行为
学关系密切,BDNF在前角(腹角)脊髓运动神经元表达,
提示BDNF可能参与运动功能的调节;文献报道,外源
性BDNF对大鼠胚胎胆碱能神经元[18]及红核脊髓神经
元存活有促进作用[19]。本实验中,BDNF免疫反应阳性
产物除了见于脊髓腹角的神经元内,还见于脊髓背角神
经元内,提示BDNF还可能参与痛觉的形成和传导。本
实验所显示的BDNF在脊髓的定位分布与孙玲[20]、伍校
琼等[21]报道的BDNF在成年猴脊髓的分布定位基本一
致,表明BDNF在维持脊髓神经元的存活或正常生理功
能上发挥重要作用。本实验发现SCI后28 d,治疗组
BDNF 阳性细胞数量较假手术组增多,尤其是背角
BDNF阳性神经元数增多更明显,其中金腰带、甲基强
的松龙两者联合应用组BDNF阳性神经元数量增加最
多,说明两者联合应用具有协同作用;提示内源性
BDNF可能参与了损伤感觉神经元的修复、损伤灶周围
受累神经元的存活及功能的恢复。金华等[22]用ELISA、
RT-PCR发现脊髓全横断大鼠术后14 d BDNF mRNA
较术后1 d、3 d表达上调,术后28 d BDNF含量高于假
手术组。李晓宁等[23]采用改良的Allens 捶击法制作大
鼠脊髓损伤模型并给予夹脊电针治疗,免疫组化染色检
测损伤段脊髓BDNF阳性细胞数,发现夹脊电针治疗组
在脊髓损伤后1、3、7、14d BDNF阳性细胞数较对照组
持续增高,高峰值在损伤后7 d。徐明珠等[24]采用成年
雄性Wistar大鼠于梨状肌下缘及其以远15 mm处分别
切断坐骨神经后再行两处断端神经外膜缝合,制成神经
移植模型,免疫组化染色发现术后3 d L4-L6节段脊髓
前角BDNF表达就开始升高,2周时达高峰,6~8周后逐
渐下降,至8周时仍高于对照组,说明外周神经的损伤
同样能刺激内源性BDNF的表达,提示在神经系统损伤
A B C
D E F
图 3 脊髓背角BDNF免疫组化染色
Fig.3 BDNF expression in the spinal cord dorsal horn of the rats (Immumohistochemical staining, original magnification: ×200).
A: Sham group; B: SCI group; C: MP group; D: GB group; E: MP+GB group; F: Negative control group.
表2 脊髓挫伤大鼠后肢运动功能BBB评分变化
Tab.2 BBB locomotor scores for hind limbs of the rats (Mean±SD, n=6)
Group
Sham
SCI
MP
GB
MP+GB
1 d
19.0±1.10
0.61±0.40
0.73±0.35
0.6±0.5
0.7±0.5
3 d
21.0±0.1
0.7±0.5a
0.8±0.6a
1.0±0.6a
1.0±0.6a
7 d
20.80±0.45
3.32±0.41b
4.98±0.25b, f
5.6±1.0b, f, g
4.6±1.1b, h
14 d
21.0±0.0
5.3±1.2c
7.5±1.5c,f
8.9±1.3c, f, g
10.2±1.5c, h
21 d
21.0±0.0
6.6±1.7d
10.3±1.2d, f
11.6±1.3d, f, g
12.9±1.6d, h
28 d
21.0±0.0
8.18±0.16e
12.10±0.37e, f
12.4±0.6e, f, g
15.9±1.5e, h
a, b, c, d, e, compared with sham group (P<0.05); f, compared with SCI group (P<0.05); g, compared with MP group (P<0.05); h,
compared with GB group (P<0.05).
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修复过程中BDNF表达增高可能是一个重要的机制。
综上,本实验中,各治疗组在SCI后28 d BDNF阳性细
胞数均较对照组增高,联合治疗组BDNF阳性细胞数最
多,推测BDNF可能参与了损伤感觉、运动神经元的修
复、损伤灶周围受累神经元的存活,进而有利于神经功
能的恢复。
3.3 大鼠行为学的改善与BDNF表达变化的关系
本实验发现,脊髓损伤后治疗组大鼠行为学的改善
伴随BDNF表达上调,尤其是甲基强的松龙和金腰带联
合组大鼠运动功能恢复最好,大鼠行为学的改善和
BDNF表达上调最为显著,提示脊髓损伤后神经功能的
恢复与BDNF表达增高有密切联系。文献报道大剂量
MP冲击是目前急性脊髓损伤公认治疗方法[13,25-27],金腰
带能减轻脊髓继发性损伤[12],本研究显示出两者联合应
用具有协同作用,对大鼠运动功能恢复明显改善,并引
起脊髓BDNF协同表达上调。
因此,本实验发现甲基强的松龙和金腰带联合治疗
SCI的疗效优于单纯甲基强的松龙治疗组和金腰带治
疗组,其发挥疗效与上调BDNF表达有关。该研究结果
可能为SCI治疗提供新的策略。
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(编辑:吴锦雅)
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