全 文 ：微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1123−1129
Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：四川省科技厅应用基础研究项目(No. 07JY029-001); 宜宾学院青年基金项目(No. 2003Q17); 国家自然科学基金资助项目(No.
30660004, 30460004)
* 通讯作者：Tel: 86-831-3545069; : asdfgwt@yahoo.com.cn
收稿日期：2010-01-08; 接受日期：2010-04-30
研究报告
香樟产芽孢内生细菌的系统发育多样性
王松 1 游玲 2 李涛 3 魏琴 2 王涛 1*
(1. 宜宾学院生命科学与食品工程学院 四川 宜宾 644000)
(2. 宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室 四川 宜宾 644000)
(3. 五粮液集团有限公司 四川 宜宾 644000)


摘 要: 为了解香樟产芽孢内生细菌的多样性, 采用改良的 NA 培养基分离、去除冗余及芽孢染
色, 得到 40 株产芽孢内生细菌, 占分离所得内生细菌总数的 29.9%, 其中根、茎、叶中分别分离
到 25、5 和 10 株。16S rRNA 序列系统发育分析结果表明, 这 40 株菌分属于 Bacillus、Lysinibacillus、
Paenibacillus 和 Brevibacillus 属的 12 个种; 7 株菌的 16S rRNA 部分序列与数据库中模式菌株对应
序列相似性小于 97%, 代表着潜在新类群的存在。同时, 3 个部位分离出的产芽孢内生细菌既呈现
出一定程度的细菌区系相似性, 又表现出细菌区系的器官特异性。
关键词: 香樟, 产芽孢内生细菌, 多样性, 16S rRNA
Phylogenetic Diversity of Spore-forming Endophytic
Bacteria Isolated from Cinnamomum camphora (Linn.) Presl
WANG Song1 YOU Ling2 LI Tao3 WEI Qin2 WANG Tao1*
(1. College of Life Science & Food Engineering, Yibin University, Yibin, Sichuan 644000, China)
(2. Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan, Yibin University,
Yibin, Sichuan 644000, China)
(3. Wuliangye Group Co., Ltd., Yibin, Sichuan 644000, China)
Abstract: Improved NA medium was used to study the diversity of endophytic spore-forming bacteria
of Cinnamomum camphora (Linn.) Presl. After spore staining and removing of the redundant isolates,
40 non-redundant spore-forming bacterial isolates were ascertained, which accounted for 29.9% of all
the endophytic bacterial isolates, and 25 strains of the 40 were from roots, 5 strains from stems, 10
strains from leaves. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA sequences showed that the 40 strains at-
tributed to 12 species of the genera Bacillus, Lysinibacillus, Paenibacillus and Brevibacillus; 7 strains
with under 97% sequence similarities respectively to their closely related member were presumed to be
potential novel species. Furthermore, microflora of endophytic spore-forming bacteria in roots, stems
and leaves of C. camphora showed that some bacteria distributed in different organs, others were or-
gan-specific.
Keywords: Cinnamomum camphora, Spore-forming bacteria, Diversity, 16S rRNA
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2010.08.025
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香樟[Cinnamomum camphora (Linn.) Presl]是亚
热带长绿阔叶乔木 , 其枝叶茂密 , 树姿雄伟 , 有很
强的吸尘和抗煤烟能力, 能抗氯气、二氧化硫、臭
氧及氟气等有害气体 , 能驱蚊蝇 , 是优良的绿化
及环保树种。工业上 , 樟树根茎、枝叶提炼出来的
樟脑和樟脑油 , 是制造胶卷、胶片、赛璐珞的重要
原料 [1]。
产芽孢细菌是一类重要的微生物类群, 植物尤
其是药用植物内生芽孢细菌定殖于植株内部, 在植
物病害生物防治和促进植物生长方面有着重要的应
用价值 [2], 还因其生存环境特殊 , 不仅有助于植物
活性成分的形成 [3−5], 还有助于植物适应并修复受
到污染的环境[6]。植物内生菌中的很多种属对宿主
植物并不重要, 如热带雨林植物内生菌中的大多数
对宿主植物来说都无关紧要 [7], 但多方面的研究表
明产芽孢细菌无论是作为根际微生物在植物病害发
生过程中起着通讯及协同免疫作用 [8], 还是作为内
生菌降解植株从环境中富集到的毒素 [9], 都体现出
与植物更紧密的联系 , 而且产芽孢细菌抗逆性好 ,
多数能够在植株外人工培养 , 具有较好的应用价
值。通过对香樟产芽孢内生细菌的研究, 不仅可以
找到香樟产芽孢内生细菌在植株各部位的定殖规
律, 进一步探索产芽孢细菌与香樟的联系, 还可为
更好地开发利用香樟这种我国特有的经济树种奠定
一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集: 香樟采自四川宜宾县隆兴乡, 采
样时间为 2007 年 5 月下旬。在 50 m2 范围内, 选取
无明显植物病害而且树龄(胸径 20 cm−30 cm)接近
的香樟树 20 棵分别采集根、茎、叶。采集后马上回
实验室进行分离。
1.1.2 分离培养基 : 改 良 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基
(NA)。1000 mL NA 培养基中含 20 mL 无菌香樟根
茎叶水浸液和 5 万单位制霉菌素。香樟根茎叶水浸
液的制备方法为: 取健康植株的根(直径约 1 mm−
5 mm)、 茎 (1 至 2 年 生 的 枝 条 , 直 径 约 5 mm−
10 mm)、叶(随机选取)分别打碎后等重量混合, 称取
80 g 加入 200 mL 水, 115°C 灭菌 20 min 后无菌纱布
过滤。
1.1.3 主要试剂和仪器: PCR 仪为 Bio-Rad 公司产
品; 菌株 DNA 提取、16S rDNA 片段扩增所用的各
种酶、Marker、dNTPs、Buffer 等试剂为上海生物工
程技术服务有限公司产品(Sangon); 其余试剂均为
国产分析纯。
1.2 内生芽孢杆菌的分离及保藏
香樟叶内生细菌的分离: 随机挑选树叶 20 片,
洗净风干, 75%乙醇浸泡 60 s, 无菌水冲洗 6 次, 无
菌滤纸吸干, 0.1%升汞浸泡 40 s, 无菌水冲洗 6 次,
加无菌石英砂研磨, 梯度稀释至 10−3, 每一稀释梯
度涂布 10 个分离平板。茎(5 g)和根(5 g)的乙醇和升
汞处理的时间分别为 2 min 和 3 min, 50 s 和 1 min,
其余步骤与叶内生细菌的分离相同。每个样品都取
最后一次无菌水洗液涂于相应平板上, 以检测表面
消毒是否彻底。定期观察分离平板, 挑取单菌落划
线纯化于常规 NA 斜面上。
根据菌落的颜色、大小、突起特征、边缘特征、
表面光滑与否和透明度等肉眼可辩的特征对从同
一分离器官内分离到的菌株去除冗余。按照东秀珠
等 [10]的方法进行芽孢染色观察(长出明显菌落后连
续染色观察 7 d, 已经观察到芽孢的菌株不再进行芽
孢检测)。通过以上方法分离 , 去除冗余后共获得
134 株内生细菌, 其中产芽孢内生细菌 40 株(过程
略), 选择出的产芽孢的培养物分别转接到甘油管存
于−50°C 及试管斜面存于 4°C 备用。
1.3 培养物 DNA 提取和 16S rDNA PCR 扩增
根据 Rainey 等[11]的方法, 并适当修改。提取培
养物基因组 DNA 后, PCR 扩增 16S rDNA。细菌引
物 27f: 5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′和 1541 r:
5′-AAGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′[12]。PCR 反应
体系和反应条件参照东秀珠等的方法进行。
1.4 16S rRNA 部分序列分析
扩增的 PCR 产物送上海生物工程技术服务有限
公司(Sangon Biotech Co., Ltd.)纯化并测序, 测定序
列长度 1000−1100 bp。测定的序列用 EzTaxon server
2.0[13]在线进行相似性分析。用 ClustalX 按照最大同
源性的原则进行排序, 采用 Kimura-2[14]计算核苷酸
差 异 值 , 并 用 BioEdit 5.0.9 进 行 检 验 , 最 后 用
Neighbor-joining 法 [15] 构 建 系 统 进 化 树 , 自 展 数
(Bootstrap)为 1000。
1.5 多样性的计算
将与该种模式菌株 16S rRNA 部分序列相似
性> 97%的分离菌视为同种, < 97%的视为新种, 采
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用 Shannon-Weiner 公式[16]计算产芽孢内生细菌多
样性。
2 结果与分析
2.1 香樟内生芽孢杆菌的分离
从根、茎、叶分离所得菌落经表观特征去除冗
余后进行芽孢染色的结果如表 1, 可以看出从根、
茎、叶中分离出的产芽孢细菌数量占各自分离出细
菌总数的比例大致相当。

表 1 香樟产芽孢内生细菌分离情况
Table 1 The number of spore-forming isolates
分离部位
Plant tissue
内生细菌数量
Number of
isolates
产芽孢内生
细菌数量
Number of
spore-forming
isolates
产芽孢内生细菌
所占比例
Proportion of
spore-forming
isolates (%)
根 Roots 84 25 29.8
茎 Stems 16 5 31.3
叶 Leaves 34 10 29.4
合计 Total 134 40 29.9

2.2 系统发育分析
对分离得到的 40 株产芽孢细菌的 16S rRNA 进
行测序, 得到 40 条有效序列(全部在 GenBank 注册,
序列号见图 1)。经 16S rRNA 序列相似性分析和系
统发育分析(表 2, 图 1), 发现 40 株产芽孢内生细菌
体现出较为丰富的多样性。
根中分离得到的 25 株产芽孢内生细菌中, 有 10
株属于 Bacillus 属, 其 16S rRNA 部分序列分别与该
属中 6 个种的典型菌株对应序列最为接近(表 2), 其
序列与模式菌株对应序列相似性高于 97%, 可视为
与模式菌株同种。有 8 株属于 Lysinibacillus 属, 其
序列分别与该属中 2 个种的典型菌株的序列相似性
最高, 且相似性均在 97%以上, 所以此 8 株菌可能
分属于 Lysinibacillus 属中的 2 个种。有 2 株菌属于
Paenibacillus 属, 其序列与该属中 2 个种的典型菌
株相似性为 98.7%和 99.4%, 故此 2 株菌可能属于该
属中的 2 个种。所以, 香樟根中分离出的 25 株产芽
孢内生细菌至少可能属于 3 个属中的 10 个种。
茎中分离得到的 5 株产芽孢内生细菌中, 3 株的
序列与 Bacillus 属中 2 个种的典型菌株对应序列最
为相似(均大于 97.8%), 2 株的序列与 Lysinibacillus
属中 2 个种的典型菌株对应序列相似性分别为 99.3%
和 99.7%, 所以茎中分离得到的产芽孢内生细菌可
能分属于 Bacillus 属和 Lysinibacillus 属的 4 个种。

表 2 产芽孢内生细菌的 16S rRNA 序列相似性分析
Table 2 Analysis of partial 16S rRNA sequences of spore-forming endophytic bacteria
最接近的属
Nearest related genus
最接近的典型菌株
Closest related type strain
根
Roots
相似性
Similarity (%)
茎
Stems
相似性
Similarity (%)
叶
Leaves
相似性
Similarity (%)
Bacillus Bacillus anthracis ATCC 14578T 3 98.6, 99.6 3 98.0−99.6
Bacillus altitudinis 41KF2bT 1 99.7 1 99.7
Bacillus drentensis LMG 21831T 1 98.0 1 97.8
Bacillus aryabhattai B8W22T 2 98.8, 99.3 1 98.5
Bacillus tequilensis NRRLB-41771T 1 99.9
Bacillus methylotrophicus CBMB205T 4 99.3−99.9
Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T 5 97.5−99.6 1 99.3
Lysinibacillus xylanilyticus XDB9T 3 99.3−99.9 1 99.7 1 99.5
Paenibacillus Paenibacillus barcinonensis BP23T 1 98.3
Paenibacillus cineris LMG 18439T 1 98.7
Paenibacillus chitinolyticus IFO 15660T 1 99.4
Brevibacillus Brevibacillus brevis NBRC 15304T 1 98.3
相似度小于 97%菌株
Under 97% sequence
similarity
Paenibacillus amylolyticus
NRRL NRS-290T 1 93.5
Paenibacillus chitinolyticus IFO15660T 2 93.1, 96.0
Paenibacillus terrigena A35T 1 94.9
Bacillus aryabhattai B8W22T 1 94.2
Bacillus anthracis ATCC 14578T 1 93.2 1 92.3
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图 1 香樟产芽孢内生细菌的 16S rRNA 系统发育树
Fig. 1 Dendrogram for spore-forming endophytic bacteria isolated from Cinnamomum longepaniculatum based on partial
16S rRNA gene sequences
Note: Data in parentheses are the GenBank accession numbers of the isolates represented by the number out of the parentheses. The number
on the node represents the similarity level of the following strain. Bootstrap value showed on the branch means the support for a specific
branch.

叶中分离得到的 10 株产芽孢内生细菌中有 5 株
属于 Bacillus 属, 其序列分别与该属中 3 个种典型菌
株序列最为相似, 且相似性均在 98%以上, 此 5 株菌
可能分属于该属的 3 个种。1 株菌属于 Paenibacillus
属, 且与 Paenibacillus barcinonensis BP-23T 的序列
相 似 性 为 98.3%, 可 能 属 于 该 种 ; 1 株 菌 属 于
Lysinibacillus 属 , 与 Lysinibacillus xylanilyticus
XDB9T 的序列相似性为 98.5%, 加上 1 株与模式菌
王松等: 香樟产芽孢内生细菌的系统发育多样性 1127

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株 Brevibacillus brevis JCM 2503T 对应序列相似性为
98.3%的 Brevibacillus 属细菌, 叶中分离出的 10 株
菌至少属于 4 个属 6 个种。
另 外 还 有 7 株 菌 (GenBank 注 册 号 分 别 为
FJ174601-FJ174605、FJ174620、FJ174621)与已知属
种模式菌株对应序列的最高相似性低于 97% (表 2),
代表着可能有潜在的新分类单位。
综合系统发育分析并结合表 2 和图 1 可以看出,
分离出的产芽孢内生细菌至少分属于 4 个属的 12 个
种, 其中还有 7 株菌的对比结果表明可能有潜在的
新分类类群。从 3 个部位分离得到的产芽孢内生细
菌的多样性来看, 根、茎、叶中分离出的产芽孢内
生细菌的 Shannon 指数(H)分别为−3.0147、−1.4575
和−2.6464 (与模式菌株相似性低于 97%的菌株按新
分类类群计算), 可见根中分离到的产芽孢内生细菌
多样性最大, 叶次之, 而茎最小。
从根、茎、叶产芽孢内生细菌 16S rRNA 序列
与数据库中各模式菌株对应序列相似性来看, 仅有
与 Lysinibacillus xylanilyticus 的模式菌株序列最为
接近的产芽孢内生细菌在 3 个部位均有分布, 共有 5
株(根 3、茎 1、叶 1), 占总数的 12.5% (占根内分离
所得产芽孢内生细菌的 12%、茎的 20%、叶的 10%)。
与 Bacillus 属的 2 个种、Paenibacillus 属的 2 个种模
式菌株对应序列最为接近的产芽孢内生细菌只在根
内分离到 7 株, 占根内分离到的产芽孢内生细菌的
28%; 与 Paenibacillus barcinonensis、Brevibacillus
brevis 模式菌株序列最为接近的产芽孢内生细菌各
在叶部分离到 1 株, 表明这 2 株细菌为叶独有的内
生细菌。
3 个部位分离出的产芽孢内生细菌中 , 属于
Bacillus 的菌株均最多(根 10 株, 占根中分离出的产
芽孢内生细菌的 40.0%；茎 3 株, 占 60.0%；叶 5 株,
占 50.0%)。Bacillus 属细菌常用作生防菌剂及动植
物益生菌, 曾在棉花、黄瓜、柑橘树、马尾松等多
种植物中作为内生菌被分离到, 而且大多属于优势
属[17　−18]。根中分离到的产芽孢细菌 16S rRNA 部分
序列与 Bacillus 属多个种的模式菌株接近, 推测是
由于 Bacillus 属细菌是土壤中的优势属, 偶然进入
植 株 内 部 作 为 内 生 菌 定 殖 下 来 。 与 常 见 病 源 菌
Bacillus anthracis 模式菌株对应序列相似的 3 株产
芽孢内生细菌则揭示了内生菌的另一常见来源: 某
些病源菌在植株内部由于某些原因失去了致病能
力, 从而作为内生菌保留下来。
根、茎、叶中分别有 8 株、2 株和 1 株产芽孢
内生细菌属于 Lysinibacillus 属。目前该属菌株主要
从土壤和水体等环境样品中分离得到, 检索数个数
据库中有关内生细菌的文献, 均未发现从植物中分
离出该属菌株的报道。但本研究从香樟 3 个部位共
分离出了 11 株可能属于该属的菌株, 关于这 11 株
菌是否为香樟特有内生细菌或是否为 Lysinibacillus
属菌株, 尚需开展进一步的试验加以确认。其中与
Lysinibacillus xylanilyticus 的模式菌株对应序列相似
性均超过 99%的 5 株产芽孢内生细菌在根、茎、叶
中均有分布, 推测这类细菌在香樟植株内具有较好
的迁移能力, 且 Lysinibacillus xylanilyticus 属产芽孢
细菌可利用二甲酚, 曾在沼气池中分离到, 同时与
Bacillus methylotrophicus 对应序列相似性最高的 3
株 Bacillus 属芽孢杆菌也是甲基营养型, 这种巧合
说明这类产芽孢细菌更容易适应香樟内环境 , 与
香樟植株细胞代谢可能存在某种联系 , 尚待进一
步研究。
根、叶中各分离到的 2 株 Paenibacillus 属产芽
孢内生细菌也曾在黑松[19]和高丽人参[20]根部被分离
到。与根中分离到的 2 株 Paenibacillus 属 16S rRNA
部分序列最接近的模式菌株所在的 4 个种当中 ,
P. chitinolyticus 可产几丁质酶, 有助于植物抗真菌
病害, 另一种则是土壤中常见芽孢菌。叶中分离到
的 1 株 Paenibacillus 属细菌 16S rRNA 部分序列
与模式菌株 P. barcinonensis 对应序列相似性最高 ,
P. barcinonensis 可产木聚糖酶, 可能有助于细菌在
含木聚糖的树叶中成功定殖。
在香樟叶中分离到的 Brevibacillus 属产芽孢内
生细菌曾在多种植物中作为内生细菌被分离到 [3],
可用作动物益生菌及植物生防菌, 可在以纤维素为
唯一碳源的平板上生长良好, 在香樟根、茎中均无
该属细菌, 推测该菌不是来源于土壤, 而是偶然进
入叶中并成功定殖成为内生菌的。
3 讨论
3.1 香樟产芽孢内生细菌的来源
目前有关植物内生细菌的来源有 2 种假说: 一
种是认为内生细菌来源于植物的表面; 另一种认为
内生细菌来源于根际, 并由此进入植物组织内部[21],
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直接或间接促进植物生长 , 协助植物抵抗不利环
境。而且也有多项研究表明内生细菌能够在植物体
内不同部位转移[22]。我们的研究发现根中产芽孢内
生细菌明显比茎、叶中多, 说明土壤是产芽孢内生
细菌的主要来源, 产芽孢细菌较难从环境中进入香
樟茎内, 茎内生菌自根、叶中迁移而来的可能性较
大。此次分离得到的绝大多数产芽孢内生细菌其可
能归属的种群在其他多种植物中均有发现[23−25], 说
明芽孢细菌抗逆性强, 更容易通过偶然途径进入植
物内部并定殖成为内生菌。茎中分离到的 5 株内生
菌中 3 株为根、茎共有, 2 株为茎、叶共有, 说明茎
内生产芽孢细菌可能来源于根、叶, 而叶独有的 2
株产芽孢内生细菌则可能是由空气和雨水通过气孔
和昆虫等从叶表面进入植物内部。实验还发现, 在
以纤维素为唯一碳源的平板培养基上, 多数产芽孢
内生细菌都能生长, 说明这些细菌能够降解利用纤
维素, 这显然有助于其顺利定殖于植物内部。
3.2 香樟产芽孢细菌的作用
虽然并非所有植物内生菌都对植物有贡献 [26],
但对香樟等多年生木本植物来说, 其内生菌与植物
的联系显然更稳定, 这种稳定性与芽孢的抗逆性可
能有一定联系。李建勇等[27]的研究发现香樟对多种
蔬菜有较强的化感作用, 樟油制品樟脑有明显驱虫
作用, 可见香樟林及香樟植株内环境均存在明显的
选择压力, 抗逆性强的产芽孢细菌在其中定殖生长,
可能对香樟产樟油及抗污染能力有积极影响。香樟
根、茎、叶中共有的产芽孢内生细菌可能更活跃, 特
别是在 N、C、P、K 等营养元素的代谢及维护植株
内环境等方面可能有积极作用, 这些推测尚待进一
步研究证实。我们还发现香樟非芽孢内生细菌在未
添加植物组织浸提液的普通培养基上很难生长, 说
明非芽孢内生细菌对香樟内环境的依赖性更大, 可
能对植物影响也更大, 但不易人工培养, 通常侧重
于理论研究, 如 Wang 等[28]曾利用 nifH 基因特异扩
增来证明内生菌的固氮作用。此次分离到的香樟产
芽孢内生细菌虽然仅占首次分离到的细菌总数的
29.9%, 但在不断转接传代过程中 , 均能够生长良
好, 具有较好应用价值。
本 文 首 次 对 香 樟 中 产 芽 孢 内 生 细 菌 的
16S rRNA 的系统发育开展了研究。从香樟3个部位
分离出的产芽孢内生细菌存在明显的遗传多样性 ,
而且3个部位分离出的产芽孢内生细菌呈现出相似
性和器官特异性。16S rRNA 做为生物系统发育的
主要分子标尺 , 是目前研究细菌多样性主要使用
的方法 , 常用于对大量菌株进行快速初步鉴定。
但该方法也存在偏保守和多操纵子等问题 , 有些
16S rRNA 序列相似性大于97%的菌株仍然属于不
同的分类类群 [29], 如我们的研究发现图1中位于垂
直线上的各株菌在外观形态、革兰氏染色, 鞭毛、
荚膜等方面仍存在明显差异, 不宜视为同种菌, 因
此在此基础上, 如有必要, 还需结合多种生理生化
指标检测及 BOX-PCR、全序列杂交等遗传指标检测
结果进行准确鉴定。
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稿件书写规范
论文中计量单位的表示方法
为执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》的规定, 计量单位和单位符号按国家
技术监督局发布的《量和单位》GB3100-3102-93 执行。单位符号均用英文小写(正体), 不允许随便对单位符
号进行修饰。现将本刊常用计量单位和符号介绍如下, 希望作者参照执行。
时间: 日用 d; 小时用 h; 分钟用 min; 秒用 s 等表示。
溶液浓度: 用 mol/L, 不用 M (克分子浓度)和 N (当量浓度)等非许用单位表示。
旋转速度: 用 r/min, 不用 rpm。
蒸汽压力: 用 Pa 或 kPa、MPa 表示。
光密度: 用 OD (斜体)表示。
生物大分子的分子量: 蛋白质用 D 或 kD, 核酸用 bp 或 kb 表示。
图表中数值的物理量和单位: 物理量符号采用斜体, 单位用正体并用括号括起, 例如: t (h) (表示时间,
单位是小时)。带数值的计量单位: 计量单位不能省略, 跟数字之间加一空格(%除外)，例如: 20 cm × 0.3 cm,
不能写成 20 × 0.3 cm; 3 °C−5 °C 不可写成 3−5 °C; 3%−6%不可写成 3−6%等。