全 文 ：第 40卷第 1期
2010年 2月 　　　　　　　　　　 　　　 日用 化 学工 业ChinaSurfactantDetergent＆Cosmetics　　　　　　 　　　　　Vol.40 No.1Feb.2010
收稿日期:2009-07-10;修回日期:2009-09-24
作者简介:王庆华(1969-),男 ,瑶族 ,广西人 ,副教授 , E-mail:wqhwj@ 163.com。
荔枝壳提取物对酪氨酸酶的抑制作用
王庆华 1 ,邓志刚 2 ,刘　山 2 ,卢汝莲 3 ,林燕飞 3
(1.广东药学院 基础学院 ,广东　广州　510006;2.广州雅纯化妆品制造有限公司 , 广东　广州　510425;
3.广东药学院 药科学院 , 广东　广州　510006)
摘要:通过对酪氨酸酶催化 L-多巴氧化速率的测定 , 研究了荔枝壳粉的乙醇萃取液对体外酪氨酸酶活性的抑制作用。
结果表明 , 酶抑制率达到 50%(酪氨酸酶活力下降 50%)时所需的澄清液中多酚的质量浓度为 0.052 mg/mL。复合抑制
剂的酶抑制作用的 Lineweaver-Burk线特点的分析结果显示 , 荔枝壳粉提取物对酪氨酸酶的抑制作用不是单一成分的
抑制作用 , 而可能是多种抑制成分共同作用的结果。
关键词:化妆品添加剂;荔枝壳提取物;酪氨酸酶;复合抑制成分;抑制作用
中图分类号:TQ658.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-1803(2010)01-0031-04
Inhibitorymechanismofextractsfromlitchishelonmushroomtyrosinase
WANGQing-hua1 , DENGZhi-gang2 , LIUShan2 , LURu-lian3 , LINYan-fei3
(1.TheSchoolofBasicCoursesofGuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou, Guangdong　510006, China;
2.GrandwayInternationalB.C.CosmeticsManufacturer, Guangzhou, Guangdong　510425, China;
3.PharmaceuticalCollogeofGuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou, Guangdong　510006, China)
Abstract:Theinhibitoryefectof50% ethanolextractsfromlitchishelontheactivityoftyrosinasewere
studiedbymeasuringtheoxidationrateofL-dopathatcatalyzedbytyrosinase.Resultsindicatedthatthemass
concentrationofpolyphenolintheextractneededforinhibitoryefectof50% (50% depressionoftyrosinase
activity;IC50)is0.052 mg/mL.ThecharacteristicsofLineweaver-Burkgraphforcomplexinhibitorwere
studied.Resultsindicatedthatthetyrosinaseinhibitoryactiononthelitchishelethanolextractiscausedby
combinedactionofmultipleingredientscontaininginthelitchishelinsteadofactionofsingleingredient.
Keywords:additivesofcosmetics;litchishelextract;tyrosinase;complexinhibitors;inhibitorymechanism
　　目前市场上的化妆品中酪氨酸酶抑制剂多为氢
醌 、熊果苷和曲酸等 ,但研究发现这些物质或多或少存
在安全问题 [ 1, 2] 。从植物提取物中寻找安全的酪氨酸
酶抑制剂是美白化妆品的一个趋势 ,我国研究人员对
中药材提取物进行分离筛选 ,发现了至少上百种酪氨
酸酶抑制成分 [ 3] 。荔枝是我国华南地区的资源性农
产品 ,荔枝壳提取物含有丰富的植物多酚类物质 ,如黄
酮 、原花青素 、根皮素等 [ 4 -6] ,此类物质具有良好的抗
氧化活性 ,如能开发荔枝壳中的酪氨酸酶抑制成分则
意义更大。作者研究了荔枝壳提取物对酪氨酸酶的抑
制作用并对其抑制机理进行了探讨。
1　实验部分
1.1　试剂与仪器
荔枝壳样品 ,市售荔枝经剥壳烘干后粉碎;蘑菇酪
氨酸酶 ,美国 Worthington公司;L-多巴 ,美国 Sigma
公司;水为重蒸水;其他试剂均为国产分析纯 。 721分
光光度计 ,上海第三分析仪器厂;5804R高速离心机 ,
德国 Eppendorf公司;RE-52A旋转蒸发仪 ,上海青浦
沪西仪器厂;HH-1恒温水浴锅 ,江苏金坛环宇科学
仪器厂 。
1.2　实验方法
1.2.1　荔枝壳粉澄清液的制备
称取一定质量的荔枝壳粉 ,加入体积分数为 50%
的乙醇水溶液(按 m(荔枝壳粉)∶m(乙醇水溶液)=
1∶10),在 70℃加热回流 2 h,所得提取液在室温下于
10 000 r/min离心 10 min得上清液 ,上清液经减压旋
转蒸发溶剂后得到膏状荔枝壳提取物 ,使用时以一定
量的重蒸水溶解 ,经 10 000r/min离心 10 min得到澄
清液。
·31·
DOI :10.13218/j.cnki.csdc.2010.01.021
研究与开发 　　　　　　　　　　　　日　用　化　学　工　业　　　　　　　　　　　　　　　　第 40卷　
1.2.2　荔枝壳粉澄清液中植物多酚质量浓度的测定
采用普鲁士蓝法 [ 7] ,以没食子酸为标准品 ,作标
准曲线测定荔枝壳粉澄清液中植物多酚质量浓度。
1.2.3　酪氨酸酶活力测定
按参考文献 [ 8]进行 ,酪氨酸酶活力以催化 L-多
巴氧化反应生成多巴醌的二酚酶活力衡量 。试管中加
入 L-多巴 0.4 mL(1.0 mg/mL), pH=6.8磷酸缓冲
液 2.4mL, 30 ℃水浴保温 10 min后 ,加入酪氨酸酶
0.2mL(250 U/mL)混匀 ,酶促反应将 L-多巴转化为
红色产物多巴醌 ,在 475 nm处有最大吸收。读取从混
匀开始 2 min时在 475 nm处的吸光度 A,以每分钟
A475增加 0.001为 1个酶活力单位 ,酶促反应的速度用
每分钟 A475增加值来表示 。
1.2.4　不同浓度荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶活力的
影响
不同 试 管 中 加 入 底 物 L-多 巴 0.4 mL
(1.0mg/mL),然后加入不同体积的澄清液 ,酪氨酸酶
0.2mL(250 U/mL),以磷酸缓冲液补足反应液总体积
为 3mL,测定反应开始 2min时的吸光度 ,按如下两式
计算相对酶活力和酶抑制率:
相对酶活力 =A3 -A4A1 -A2 ×100%
酶抑制率 = 1-A3 -A4A1 -A2 ×100%
式中 A1为无澄清液有底物时的吸光度;A2为无
澄清液无底物时的吸光度;A3为有澄清液与底物时的
吸光度;A4为有澄清液无底物时的吸光度 。
1.2.5　不同质量浓度的 L-多巴底物酶促反应速度
变化的测定
向试管中加入不同体积的 L-多巴溶液和荔枝壳
粉澄清液 ,酪氨酸酶 0.2 mL(250 U/mL),保持试管反
应液的总体积为 3.0 mL,使 L-多巴在试管中的终质
量浓度分别为0.133mg/mL, 0.200mg/mL, 0.267mg/mL,
0.333mg/mL, 0.400mg/mL和 0.533mg/mL,多酚最终的
质量浓度分别为 1.3×10-2 mg/mL, 2.6×10-2 mg/mL,
3.9×10-2 mg/mL和 6.5 ×10-2 mg/mL,测定相应的
酶促反应速度(实验所涉及底物和澄清液质量浓度值
均以在试管中的终浓度来表示)。采取 Lineweaver-
Burk作图 ,根据酶促反应的米氏常数 Km和表观最大
反应速率 Vm的变化分析荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶
抑制作用。
2　结果与讨论
实验测得的荔枝壳粉澄清液中植物多酚的质量浓
度为 0.389 mg/mL。
2.1　酪氨酸酶促反应产物的 A475随时间的变
化关系
　　酶促反应将 L-多巴转化为红色产物多巴醌 ,试
管中红色的深浅与产物的浓度成正比 。考察反应产物
的 A475随反应时间变化 ,实验结果见图 1。由图 1可
知 ,随着时间的延长 ,体系的吸光度增大 ,即产物浓度
增大 ,但反应速度(斜率)降低。这是因为每一瞬间的
反应速度不同 ,越接近初速度 ,越能反映酶的活力。反
应时间过短 ,不便操作 ,实验选取反应 2 min吸光度的
变化来计算酶促反应速度 。
图 1　酪氨酸酶催化 L-多巴氧化反应的进程曲线
　　Fig.1　ProgressofoxidationofL-dopacatalyzedby
tyrosinasevs.time
2.2　荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶活力的影响
保持反应体系中底物 L-多巴的质量浓度为
0.133mg/mL,保持试管中反应液的总体积为 3.0 mL,
改变反应体系中澄清液体积 ,考察酪氨酸酶的相对酶
活力 ,实验结果见图 2。由图 2可知 ,酶抑制率为 50%
(酪氨酸酶活力下降 50%)时所需的澄清液中多酚的
质量浓度为 0.052 mg/mL。
图 2　荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶的抑制作用
Fig.2　Inhibitoryefectofextractsfromlitchishelonactivityof
tyrosinase
·32·
　第 1期　　　　　　　　　　王庆华等:荔枝壳提取物对酪氨酸酶的抑制作用　　　　　　　　　　　　研究与开发
2.3　底物质量浓度对酶抑制率的影响
考察底物 L-多巴质量浓度在 0.133 mg/mL～
0.533mg/mL内对酶抑制率的影响 ,实验结果见图 3。
由图 3可知 ,随着底物质量浓度的增加 ,酶抑制率稍有
降低 ,表明抑制率与测定体系的底物质量浓度相关 ,不
符合单一非竞争抑制剂的特点 [ 9] 。
图 3　L-多巴质量浓度与酪氨酸酶抑制率的关系
Fig.3　RelationshipbetweenL-dopasubstrateofdiferentmass
concentrationandinhibitionrate
2.4　荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶活力抑制作
用机理
　　在含不同质量浓度多酚的荔枝壳粉澄清液反应体
系中 ,改变底物多巴质量浓度 ,测定酶促反应的速度 ,
采用 Lineweaver-Burk双倒数作图 ,得到一组相交于
第二象限的直线 ,结果见图 4。图 4中横坐标为底物
L-多巴的质量浓度的倒数 ,纵坐标为反应速度(每分
钟 A475增加值)的倒数 ,直线与纵轴的截距为 1/Vm,与
横轴的截距为 -1/Km。由图 4可知 ,随着提取液多酚
质量浓度的增大 ,表观米氏常数 Km增大 ,最大反应速
率 Vm减小 ,而且各直线并不相交于同一坐标点上。
在典型单一化合物酶抑制剂(竞争性抑制剂 、非
竞争性抑制剂或混合型抑制剂)的 Lineweaver-Burk
双倒数图中 ,不同抑制剂质量浓度的直线相交于一
点 [ 9] ,图 4结果显示 ,各直线虽交于第二象限 ,但交点
并不重合 ,交点坐标随提取液质量浓度的不同而改变 ,
不属于典型的单一抑制剂的直线类型 。荔枝壳提取液
成分复杂 ,据报道荔枝壳含有黄酮 、根皮素和原花青素
等物质 [ 4-6] 。在其他一些植物提取物中此类成分被发
现具有抑制酪氨酸酶活性的作用 [ 8, 10, 11] ,荔枝壳提取
物对酪氨酸酶的抑制作用可能是复合抑制成分共同作
用的结果。
图 4　荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶催化氧化 L-多巴
抑制作用的 Lineweaver-Burk曲线
　Fig.4　Lineweaver-Burkplotsforinhibitionofextractsfrom
litchishelontyrosinaseforcatalysisofL-dopa
为分析荔枝壳粉澄清液酪氨酸酶抑制剂可能存在
的抑制作用类型 ,以一种竞争性抑制剂 A和一种非竞
争抑制剂 B与酪氨酸酶 E同时作用为例 ,根据如下复
合抑制剂作用机理:
其中 P为产物;E, EA, EB, ES, EAB, EBS分别代
表酶与底物和抑制剂的不同结合状态;KS, KA, KB分别
代表各步反应的解离常数 ,单位 mmol· L-1。为便于
推导速度方程 ,以 KS代替米氏常数 Km。
根据快速平衡态理论推导得到复合抑制剂共同作
用的反应动力学方程(1)[ 12] :
　v= Vm[ S]
KS 1+[ A]KA +
[ B]KB +
[ A] [ B]KAKB +[ S] 1+
[ B]KB
(1)
公式推导涉及的浓度单位统一为 mmol·L-1。式
中 [ S]为底物浓度;[ A]为竞争性抑制剂 A的浓度;
[ B]为非竞争性抑制剂 B的浓度;v为反应速度 ,
mol· L-1·min-1;Vm为最大反应速度 , mol· L-1 ·
min-1。等式两边同时取倒数 ,得 Lineweaver-Burk双
倒数方程(2):
　 1v=
KSVm 1+
[ A]
KA +
[ B]
KB +
[ A] [ B]
KAKB
1
[ S] +
1
Vm 1+
[ B]
KB (2)
通过列出方程组(3)求各浓度抑制剂的双倒数直
线与无抑制剂直线的交点坐标 。
1
v=
KSVm 1+
[ A]
KA +
[ B]
KB +
[ A] [ B]
KAKB
1
[ S] +
1
Vm 1+
[ B]
KB
1
v=
KSVm[ S] +
1
Vm
(3)
·33·
研究与开发 　　　　　　　　　　　　日　用　化　学　工　业　　　　　　　　　　　　　　　　第 40卷　
因为在同一澄清液中 ,若同时存在一种竞争性抑
制剂成分 A与一种非竞争抑制剂成分 B,则两者的浓
度分别与澄清液的总浓度之比应为常数。令 [ A] =
m[ I] , [ B] =n[ I] , m、n为常数 , [ I]为澄清液的总浓
度 ,单位 mmol· L-1。求得含澄清液的双倒数直线与
无抑制剂直线的交点坐标方程式(4):
1
[ S] =
-KAKS
m
nKB+KA+m[ I]
-1
1
v=
-KAVm ·
mnKB+KA+m[ I]
-1 +1Vm
(4)
交点坐标方程式显示各浓度澄清液的双倒数直线
与无提取液抑制剂的直线的交点在第二象限 ,且各直
线交点不在同一坐标点上 ,交点坐标与提取液的浓度
[ I]大小相关 ,与实验结果一致(虽然公式中的底物和
抑制剂成分浓度 、反应速度及 Km所采用的单位与实
验结果中不一致 ,但并不影响对结果的分析),表明荔
枝壳粉澄清液中可能同时含有一种竞争性抑制剂成分
和一种非竞争性抑制剂成分。
若只有竞争性抑制剂 ,不论是一种还是两种及以
上 ,从推导出的速度方程得知 ,最大反应速度 Vm应不
变;若只有非竞争性抑制剂 ,不论是一种还是两种及以
上 ,表观米氏常数 Km减小或不变 [ 12] ,荔枝壳粉澄清液
的双倒数作图直线的类型与上述两种情况都不符合。
若同时含两种或两种以上的竞争性抑制剂和非竞争性
抑制剂成分 ,则推导出的速度方程更复杂 ,但也不能排
除荔枝壳粉澄清液的酪氨酸酶抑制作用存在此种情况 。
3　结论
1)荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶具有明显的抑制
作用 ,酶抑制率为 50%时所需的澄清液中多酚的质量
浓度为 0.052 mg/mL。
2)荔枝壳粉澄清液对酪氨酸酶的抑制作用不符
合单一非竞争抑制剂的特点。澄清液中酶抑制成分应
不止一种 ,可能包括一种竞争性抑制成分和一种非竞
争性抑制成分的共同作用 ,有待进一步研究。
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　　(上接第 30页)
3　结论
1)自由基引发氟代丙烯酸酯类单体直接在交联
的聚氨酯预聚体中聚合 ,然后进行亲水基扩链 ,利用相
转化法制备 FPUA水分散液 ,工艺简单。采用红外光
谱 、电子能谱和乳液粒子形态分析表明 ,实验所制备的
产物为预期的目标产物 ,即具有强疏水的含氟丙烯酸
酯链段及亲水的聚醚链段 ,形成稳定的水分散体系 。
2)由 FPUA膜材料表面的接触角数据可知 , FA的
引入可使 FPUA乳胶膜与水的接触角提高至 98°,与对
比样品 PUA相比显著提高了材料的疏水性 ,达到了实
验的预期应用目标。
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·34·