全 文 ：第 45 卷第 9 期
2015 年 9 月
日 用 化 学 工 业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 45 No． 9
Sept． 2015
收稿日期:2015 － 07 － 24;修回日期:2015 － 08 － 21
作者简介:冯 冰(1981 －)，女，河北人，博士，电话:(021)25012304，E － mail:hbbfb@ 163． com。
通讯联系人:马来记，博士，E － mail:malaiji@ jahwa． com． cn。
牛肝菌提取液在细胞水平的抗衰老功效研究
冯 冰，马来记
(上海家化联合股份有限公司，上海 201702)
摘要:通过水提取法分离提取得到牛肝菌提取液，生药质量浓度为 60 g /L。采用 XTT 比色法检测牛肝菌提取液对表皮
角质细胞的线粒体活性、观察细胞增殖并检测其对细胞 DNA含量的影响;利用 DCFH － DA等方法检测牛肝菌提取液对
人皮肤成纤维细胞内活性氧(ＲOS)及抗氧化元件(AＲE)的影响;利用免疫荧光法检测牛肝菌提取液对成纤维细胞Ⅰ型
前胶原蛋白表达的影响。结果表明:牛肝菌提取液在终质量浓度为 1. 5 g /L时，较对照组可以显著提升角质细胞的线粒
体活性及 DNA的含量，能够明显促进细胞的增殖;牛肝菌提取液可以明显减少细胞内 ＲOS的含量、提高细胞内 AＲE激
活水平;同时牛肝菌提取液还可以促进Ⅰ型前胶原蛋白的表达。
关键词:化妆品添加剂;牛肝菌提取液;抗衰老;抗氧化
中图分类号:TQ658 文献标识码:A 文章编号:1001 － 1803(2015)09 － 0509 － 04
DOI:10． 13218 / j． cnki． csdc． 2015． 09． 007
Study of anti － aging efficacy of bolete at cell theory level
FENG Bing，MA Lai － ji
(Shanghai Jahwa United Co．，Ltd．，Shanghai 201702，China)
Abstract:Bolete extract with mass concentration of 60 g /L was obtained by water extraction method． Effects of
bolete in the extract on mitochondrial activity of epidermal keratinous cells were detected with XTT
colorimetry，as well as cell proliferation observed and effect on cellular DNA content of cell detected． Effects of
bolete in the extract on cellular ＲOS content of human dermal fibroblast and AＲE activation were detected with
DCFH － DA assay，et al． Effects of bolete in the extract on expression of procollagen of type I in human dermal
fibroblast was detected with immuno － fluorescence method． Ｒesults showed that the extract of bolete with mass
concentration of 1. 5 g /L can significantly increase the mitochondrial activity of epidermal keratinous cells and
cellular DNA content as comparing with that of the control group and can apparently promote proliferation of
cell． Further，ＲOS content in human dermal fibroblast is significantly reduced and AＲE activation is promoted．
Meanwhile，the extract of bolete can promote the expression of procollagen of type I too．
Key words:cosmetic additive;extract of bolete;anti － aging;antioxidation
皮肤组织是人机体重要的屏障器官，因长期暴露
于外界环境中，受外界环境活性氧、射线的直接刺激和
体内不断产生活性氧的影响而很容易受到氧化损伤，
导致皮肤衰老。皮肤组织由表皮、真皮及皮下结缔组
织构成。表皮的主要细胞是角质细胞，其与皮肤的新
陈代谢密切相关;真皮的主要细胞是皮肤成纤维细胞，
其具有分泌胶原保持细胞弹性、支持表皮细胞的作用。
因此，角质细胞和成纤维细胞已逐渐成为人们进行抗
衰老体外研究的对象。近年来，应用活性物来干预皮
肤细胞的损伤成为抗皮肤衰老的重要研究方向之一，
特别是如何在天然产物尤其是植物及中草药中寻找抗
衰老、抗氧化物质，已成为目前研究的热点。食用菌作
为一种天然产物，具有提高人体免疫力、抗氧化等多种
功效［1，2］，而目前食用菌主要应用于食品领域，在化妆
品中的研究应用鲜有报道。牛肝菌是世界珍贵的食用
菌，具有很高的食用价值和药用价值［3］。现代药理研
究表明，牛肝菌内含氨基酸、维生素、蛋白质、活性多糖
等丰富的营养物质，并且牛肝菌的提取物能够增强机
体清除自由基的能力，在体内具有明显的抗氧化作用。
笔者从牛肝菌的内在机理出发，通过细胞平台来探索
·905·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 45 卷
牛肝菌提取液在抗衰老方面的功效，以期为其在美容
护肤品中的应用提供科学依据。
1 实验部分
1. 1 主要试剂与仪器
牛肝菌，四川省绵阳市食用菌研究所;表皮角质细
胞(HaCaT)，第二军医大学;真皮成纤维细胞
(Fibroblast)，由术后废弃皮肤分离得到;293T 细胞
(ATCC Number:CＲL － 3216TM)，ATCC 公司;DK －
SFM细胞培养液、DMEM 细胞培养液，Gibco 公司;新
生牛血清，PAA 公司;胰蛋白酶、3，3 －［1 －(苯氨酰
基)－ 3，4 －四氮唑］－二(4 －甲氧基 － 6 －硝基)苯磺
酸钠(XTT，纯度不小于 90%)、吩嗪硫酸甲酯(PMS，
纯度不小于 90%)、辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X －
100)、4，6 －二脒基 － 2 －苯基吲哚(DAPI，纯度不小
于 98%)、CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit 试剂
盒、2，7 －二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH － DA)，Sigma
公司;荧光素酶报告基因检测试剂盒，碧云天生物技术
研究所;大鼠抗人Ⅰ型前胶原蛋白(human pro －
collagen Ⅰ)一抗，Millipore公司;大鼠抗异硫氰酸荧光
素(FITC)标记的羊抗大鼠免疫球蛋白 G(IgG)二抗，
上海翊圣生物科技有限公司;实验用水为去离子水。
荧光 /化学发光酶标仪、1300 系列Ⅱ级 A2 型生物安全
柜、CO2 恒温培养箱，Thermo Fisher公司;TDL － 5 台式
离心机，上海安亭科学仪器厂;OLYMPUS IX50 倒置显
微镜、OLYMPUS BX60 － 32 荧光显微镜，OLYMPUS 公
司;MUA －165 紫外线照射装置，北京奥博迪光电技术
有限公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 牛肝菌提取液的制备
采用通用方法，称取粉碎的牛肝菌 100 g，倾入提
取罐内，加入 20 倍去离子水于 80 ℃下进行煎煮提取，
充分搅拌混匀后密闭、保温。在浸提 2 h 后间断性重
复进行搅拌、过滤、弃去滤渣，再将滤液离心 10 min，上
清液即牛肝菌提取液，于 － 20 ℃保存，生药质量浓度
为 60 g /L。
1. 2. 2 细胞培养与实验分组
将表皮角质细胞(HaCaT)接种于含 DK － SFM 培
养液的培养瓶中，置于 37 ℃的 CO2(CO2 体积分数为
5%)恒温培养箱中培养 6 d。将细胞培养瓶取出，在
其中加入胰蛋白酶消化 4 min，然后将细胞接种于 96
孔板，孵育 24 h，对照组每孔加 200 μL细胞培养液，加
药组每孔加 200 μL不同质量浓度牛肝菌提取液，培养
箱中培养 48 ～ 72 h。分别用作细胞线粒体活性、细胞
增殖和 DNA含量的检测。
将人皮肤成纤维细胞培养于含体积分数 10%新
生牛血清的 DMEM 培养基中，并置于37 ℃ 的 CO2
(CO2 体积分数为 5%)恒温培养箱中，传代培养后的
人皮肤成纤维细胞呈球形，培养 4 h 后细胞开始贴壁
生长，逐渐变为梭形，24 h 细胞基本贴壁，采用第 7 代
的细胞进行实验，培养 48 ～ 72 h，分别作活性氧及Ⅰ型
前胶原蛋白的表达检测。
将 293T 细胞接种于含 DMEM 培养液的培养瓶
中，置于 37 ℃的 CO2(CO2 体积分数为 5%)恒温培养
箱中培养 1 d。先在 96 孔板每孔加入 150 μL DMEM
细胞培养液，再分别加入 50 μL 293T细胞悬液。置于
37 ℃的 CO2(CO2 体积分数为 5%)恒温培养箱中培养
24 h，实验设对照组及加药组，药物孵育 16 h，作抗氧
化反应元件激活水平的检测。
1. 2. 3 XTT比色法检测细胞线粒体活性
加药处理 72 h 后，配制质量浓度为 0. 2 g /L XTT
水溶液及浓度为 5 mmol /L 的 PMS 水溶液，PMS 水溶
液与 XTT水溶液以体积比 1∶ 1 000 混合，将 96 孔板中
的细胞培养液移除，每孔加入 125 μL XTT 和 PMS 的
混合液，于 37 ℃细胞培养箱孵育 2 h;使用酶标仪在
450 nm 处测定吸光度，吸光度越高，表明细胞线粒体
活性越高，反之亦然。
1. 2. 4 细胞增殖及 DNA含量检测
加药处理 72 h 后，将 96 孔板直接在倒置显微镜
下拍照，显微镜放大倍数为 200 倍。细胞内 DNA含量
采用 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit 试剂盒检
测，操作方法按照试剂盒说明书进行。
1. 2. 5 抗氧化反应元件(AＲE)水平检测
加药处理 16 h 后，细胞内 AＲE 激活水平采用碧
云天荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，操作方法按
照试剂盒说明书进行。
1. 2. 6 细胞活性氧(ＲOS)检测
加药处理 48 h 后，将 96 孔板中的细胞培养液移
除，每孔加入 100 μL浓度为 20 μmol /L DCFH － DA溶
液，于 37 ℃培养箱内孵育 40 min。吸掉 DCFH － DA
溶液，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞 3 次，以充分去除
未进入细胞内的 DCFH － DA，最后每孔加入 50 μL
PBS 覆盖细胞，进行 UVA 辐照。用辐照能量为
15 J /cm2 UVA照射后，立即使用荧光酶标仪检测，检
测使用 488 nm激发波长和 525 nm 发射波长，检测结
果越高，表明细胞内 ＲOS含量越高，反之亦然。
1. 2. 7 成纤维细胞合成Ⅰ型前胶原蛋白能力检测
加药处理 72 h 后，将培养板中的细胞培养液移
·015·
第 9 期 冯 冰，等:牛肝菌提取液在细胞水平的抗衰老功效研究 开发与应用
除，并加入丙酮于 － 20 ℃ 下固定 10 min，再加入
200 μL质量分数为 1%的 Triton X － 100 水溶液，室温
静置 1 h。加入一抗 human pro － collagen I，于 4 ℃下
过夜，再加入对应的二抗，室温避光孵育 2 h。用 DAPI
染色 10 min，加入封片剂封片，荧光显微镜下观察、
拍照。
1. 2. 8 数据统计与分析
实验结果采用 Microsoft Excel 统计软件进行分析
处理。组间均数比较采用 t 检验，P ＜ 0. 05 表示有统
计学差异。
2 结果与讨论
2. 1 牛肝菌提取液对角质细胞 HaCaT 活性
的影响
皮肤衰老的一个显著特征是皮肤表皮层逐渐变
薄，这主要是由于角质细胞活力降低等因素所致［4］;
另外，当角质细胞代谢缓慢，活力减退时，皮肤还会出
现老化、暗沉、敏感等现象。因此，提高角质细胞的活
力对于延缓皮肤衰老是十分必要的。细胞的活力主要
反映在其新陈代谢水平和细胞增殖水平，由于线粒体
是细胞氧化代谢的关键部位，其活性可以直接反映细
胞的新陈代谢能力。实验主要通过 XTT 比色法来检
测线粒体活性。细胞的增殖水平则通过检测 DNA 含
量反映细胞数量，从而评价细胞的增殖活性，同时也可
以通过拍摄细胞生长状况的照片来得到直观反映。实
验分别验证牛肝菌提取液对 HaCaT 细胞线粒体活性、
细胞增殖的影响。
用牛肝菌提取液处理 HaCaT 细胞 72 h 后，采用
XTT比色法检测牛肝菌提取液对 HaCaT 细胞线粒体
活性的影响，实验结果见表 1。由表 1 可知，牛肝菌提
取液可增强 HaCaT 细胞线粒体活性，质量浓度为 3，
1. 5 和 0. 75 g /L 时与对照组相比均具有显著性差异
(P ＜0. 05)，较对照组分别提高 35. 5%，38. 5%和 32. 9%。
表 1 牛肝菌提取液对 HaCaT细胞线粒体活性的影响
Tab. 1 Effect of the bolete extract on mitochondrial
activity in HaCaT cells
ρ(牛肝菌)/(g·L －1)
3 1. 5 0. 75
提升率 /% 35. 5 38. 5 32. 9
用牛肝菌提取液处理 HaCaT 细胞 72 h 后，采用
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit 试剂盒检测
HaCaT细胞的 DNA含量，实验结果见表 2。由表 2 可
知，牛肝菌提取液在质量浓度为 1. 5 和 0. 75 g /L 时能
够显著增加 HaCaT 细胞中 DNA 的含量，较对照组分
别提高了 14. 8% 和 12. 0% (P ＜ 0. 05)。通过检测
HaCaT细胞内 DNA的含量进一步验证牛肝菌提取液
能够促进 HaCaT细胞增殖。
表 2 牛肝菌提取液对 HaCaT细胞内 DNA含量的影响
Tab. 2 Effect of the bolete extract on DNA content in HaCaT cells
ρ(牛肝菌)/(g·L －1)
1. 5 0. 75
提升率 /% 14. 8 12. 0
图 1 为在倒置显微镜下观察 HaCaT 细胞数量的
照片，由此可知，用终质量浓度为 1. 5 g /L 牛肝菌提取
液处理 HaCaT细胞 72 h后，其细胞数量明显多于对照
组。这表明牛肝菌提取液能够明显促进 HaCaT 细胞
的增殖。
阴性对照 牛肝菌提取液
图 1 牛肝菌提取液对 HaCaT细胞活力的影响
Fig. 1 Effect of the bolete extract on viability of HaCaT cells
以上结果表明，牛肝菌提取液不仅能提升表皮细
胞的新陈代谢水平还能提高细胞的增殖能力，从而提
高细胞的活力。牛肝菌提取液显著增强 HaCaT 细胞
活力，显示出其在抗衰老功效上的潜力，为进一步开发
牛肝菌在抗衰老护肤品中的应用提供了理论依据。
2. 2 牛肝菌提取液对成纤维细胞抗氧化能力
的影响
皮肤衰老学说有很多种，其中最为人们熟知的是
自由基学说，正常的新陈代谢过程、外界环境有害因素
的影响，都会使人体产生自由基。自由基是一种化学
性质非常活泼的原子或基团，破坏性很大，特别是会破
坏细胞膜、大分子物质(包括遗传物质等)，最终导致
机体衰老［5，6］。抗氧化即抗氧化自由基，所以抗氧化
能力与抗衰老息息相关。
抗氧化反应元件(AＲE)在生物体内分布广泛，是
抗氧化酶基因的顺式作用元件，对维持细胞氧化还原
状态和防御氧化损伤有重要作用［7］。实验采用 AＲE
表达水平检测方法，将编码 luciferase 荧光酶的一段报
告基因转染到 293T细胞的 AＲE序列之后，当 AＲE 激
活时，其下游的报告基因就会表达 luciferase 荧光酶。
通过检测细胞中 luciferase的表达量变化，可以反映出
细胞内 AＲE的激活水平。最终可以了解到 AＲE 调控
·115·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 45 卷
的抗氧化蛋白的表达情况，体现其自身的抗氧化
能力［8］。
活性氧自由基(ＲOS)过多的积累，会对皮肤造成
氧化损伤，因此，清除皮肤中的 ＲOS 能有效帮助皮肤
抵御环境压力造成的损伤。实验采用 UVA 辐照成纤
维细胞，模拟外界环境压力对皮肤造成的损伤。借助
检测试剂盒，能够有效测量在 UVA辐照后成纤维细胞
内产生的 ＲOS 的量，从而判断样品是否具有减少细胞
中 ＲOS的功效。
用牛肝菌提取液处理 293T 细胞 16 h 后，采用试
剂盒检测细胞内 AＲE 的激活水平，实验结果见表 3。
由表 3 可知，用不同质量浓度的牛肝菌提取液处理细
胞，细胞内 AＲE 激活水平明显高于对照组(P ＜
0. 05)，即细胞内抗氧化蛋白的表达多于对照组。在
终质量浓度为 15，7. 5 和 3. 75 g /L 时，分别较对照组
提高约 2. 7，1. 8 和 1. 4 倍，这说明牛肝菌提取液能够
显著提高细胞内 AＲE的激活水平。
表 3 牛肝菌提取液对细胞 AＲE激活水平的影响
Tab. 3 Effect of the bolete extract on activation level of AＲE
ρ(牛肝菌)/(g·L －1)
15 7. 5 3. 75
提升率 /% 270 180 140
用牛肝菌提取液处理人真皮成纤维细胞 48 h 后，
进行 UVA 辐照实验，实验分为空白对照组(即不加
药、加入探针 DCFH － DA、不照 UVA)，UVA 对照组
(即不加药、加入探针并辐照 UVA)以及样品组(加药、
加探针、辐照 UVA)。实验结果表明，牛肝菌提取液在
质量浓度为 1. 5 g /L时，较 UVA对照组的 ＲOS含量有
显著差异(P ＜ 0. 05)，降低细胞内 ＲOS 的量为
28. 2%，同时 UVA对照组较空白对照组有显著性差异
(P ＜ 0. 05)，这说明牛肝菌提取液能够显著减少细胞
内活性氧的含量，具有一定的抗氧化功效。
2. 3 牛肝菌提取液对成纤维细胞合成前胶原
蛋白能力的影响
细胞的胶原蛋白占到皮肤成分的 70%，皮肤内胶
原蛋白主要是由成纤维细胞制造［8］。然而随着皮肤
衰老进程的逐渐发展，成纤维细胞制造胶原蛋白的能
力逐渐也随之下降，这是导致皮肤内胶原蛋白含量下
降的一个主要原因。胶原的合成以Ⅰ型胶原的合成过
程最为经典:在成纤维细胞内，Ⅰ型胶原基因转录成相
应的 mＲNA，在粗面内质网上各翻译成相应的 α 链，3
条前 α链经脯氨酸和赖氨酸羟化等化学修饰后组装
成Ⅰ型前胶原分子(procollagen of type I collagen)。前
胶原是成熟胶原的前体分子，因此检测其水平可以反
应胶原的生物合成活性［9］。
为了进一步研究牛肝菌提取液的抗衰老功效，在
体外评估了其对成纤维细胞合成前胶原蛋白能力的影
响。实验用终质量浓度为 1. 5 g /L 牛肝菌提取液处理
细胞，采用细胞免疫荧光法检测上述蛋白的变化情况，
用荧光显微镜拍照，荧光部分显示的是蛋白表达情况，
实验结果见图 2。由图 2 可知，Ⅰ型前胶原蛋白在成
纤维细胞中的表达上调，与对照组相比牛肝菌提取液
处理后的细胞荧光强度明显增强，且含荧光细胞的数
量有所增加。以上实验结果表明，牛肝菌能促进人皮
肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原蛋白的表达，为其在护肤品
中的应用提供了理论依据。
阴性对照 牛肝菌提取液
图 2 Ⅰ型前胶原成纤维细胞的免疫荧光表达
Fig. 2 Immuno － fluorescence expression of pro － collagen I
fibroblast cells
3 结论
通过细胞平台研究了牛肝菌提取液的抗衰老功
效。牛肝菌提取液具有提高 HaCaT 细胞线粒体活性、
DNA含量及促进角质细胞增殖的功效;牛肝菌提取液
还可减少成纤维细胞的活性氧含量并提升细胞的抗氧
化元件 AＲE的激活水平;此外，通过细胞免疫荧光的
方法可知，牛肝菌提取液还能够促进人皮肤成纤维细
胞合成更多的Ⅰ型前胶原蛋白。
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(下转第 517 页)
·215·
第 9 期 苏学军，等:植物广谱紫外吸收剂的优选及其性能研究 开发与应用
表 3 紫外光照射对复合紫外吸收剂吸光度的影响
Tab. 3 Effect of ultraviolet irradiation on the ultraviolet
absorbance of the blended absorbent
t /h
珔A
280 ～ 400 nm UVB UVA
0 1. 436 1. 876 1. 245
1 1. 400 1. 843 1. 203
5 1. 367 1. 802 1. 180
10 1. 358 1. 798 1. 173
表 3 显示紫外光照射对复合紫外吸收剂的稳定性
有一定影响，随着光照时间的延长，吸光度值略微下
降，当照射时间达 10 h，平均吸光度值与初样相比下降
了 5. 4%，说明吸收剂对紫外光照射敏感度低。
3 结论
通过对 27 种中草药进行筛选和复配，优选出具有
广谱防晒作用的复合紫外吸收剂，该吸收剂由槐米、藏
红花、黄连、苦丁茶、月季和紫罗兰提取液按体积比
2∶ 2∶ 0. 5∶ 5∶ 1. 5∶ 1复配而成。复合紫外吸收剂在抗紫
外线的同时，还具有抗衰老、抗氧化能力，多效复合紫
外吸收剂作为功效化妆品的优选原料必将具有更广阔
的应用前景。
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87 － 92．
(上接第 512 页)
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binding of CCAAT － binding factor (CBF /NF － Y)at the proximal
promoter［J］． Journal of Biological Chemistry，2002，277(8) :6153 －
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本刊继续入编《中文核心期刊要目总览》(2014 年版)
接《中文核心期刊要目总览》2014 年版编委会通知:依据文献计量学的原理和方法，经研究人
员对相关文献的检索、统计和分析，以及学科专家评审，《日用化学工业》(国际标准连续出版物号:
ISSN 1001 － 1803，国内统一连续出版物号:CN 14 － 1320 /TQ)入编《中文核心期刊要目总览》2014
年版(即第七版)之化学工业类的核心期刊。这是本刊继 1992 年以来，一次不落的连续 7 次入编
《中文核心期刊要目总览》。
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