全 文 ：云南省南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤菌 BOX-PCR分析
张斌1 , 2 , 李乔仙3 , 刘晓云2＊　(1.西南林学院资源学院 ,云南昆明 650224;2.河北大学生命科学学院 ,河北省微生物多样性研究与应
用实验室 ,河北保定 071002;3.云南省草地动物科学研究院 ,云南昆明 650212)
摘要　[目的]进行南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤菌的 BOX-PCR分析 ,为苜蓿高效固氮根瘤菌的筛选和接种剂的研究提供理论依据。[方法] 采
用 boxA1R单引物对 90株根瘤菌供试菌株及 5株标准菌株进行BOX-PCR分析 ,并进行聚类分析。[结果] 经过扩增得到了较多的条带 ,90
株供试菌株共有 31种BOX图谱类型。聚类分析结果显示 ,所有菌株在 40%相似性水平上聚为一群;而在 69%的相似性水平上 , 供试菌
株可细分为 7个遗传群 ,群 1的菌株全部分离自云南省江川县路居镇天蓝苜蓿的根瘤 ,群 3内的菌株都分离自德宏州盈江县的南苜蓿根
瘤 ,并与标准菌株Enisfer meliloti USDA 1002T 聚在一群 ,在群 4、5、6中 ,除 SWF67340的宿主为南苜蓿外 ,其他菌株的宿主都为天蓝苜蓿 ,群
7中 ,除 SWF66320、SWF67343、SWF65116和 SWF67370 4株菌的宿主为天蓝苜蓿外 ,其余菌株的宿主都为南苜蓿。[结论]供试菌株具有丰
富的遗传多样性 , BOX-PCR能够区分它们之间的差异;大多数菌株按宿主及采集地聚群 ,但也有交叉。
关键词　根瘤菌;BOX-PCR;苜蓿;南苜蓿;天蓝苜蓿
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)12-05395-03
Study on the BOX-PCR Analysis of Rhizobium in the Bur Clover and Black Medic in Yunnan Province
ZHANG Bin et al　(College of Resource, Southwest Forestry College, Kunming , Yunnan 650224)
Abstract　[ Objective] The theoretical basis of the research on the screening and inoculants of high-efficient nitrogen-fixing alfalfa rhizobium was provided
through the BOX-PCR analysis of bur clover and black medic.[Method] 90 experimental rhizobium strains and five standard rhizobium strains were tested
with boxA1R single primer by means of BOX-PCR analysis and cluster analysis.[ Results] More bands were produced after the strains were amplified and
therewere 31 kinds of BOX type mappings in 90 experimental rhizobium strains.The results from cluster analysis showed that at the similarity level of
40%, all strains could be in a group , and at the similarity level of 69%, the strains could be divided into seven genetic groups.All of the strains in
Group 1 were isolated from the black medic rhizobium from Luju township of Jiangchuan County;all of the strains in Group 3 were isolated from the bur
clover rhizobium from Yingjiang County of Dehong State in Yunnan Province , which were clustered in same group as standard rhizobium strain-Enisfer
meliloti USDA 1002T;the strains in Group 4 , Group 5 and Group 6 , except the strain-SWF67340, were isolated from the bur clover rhizobium;4 strains
in Group 7 , with the exception of SWF66320 , SWF67343 , SWF65116 and SWF67370 , were isolated from the black medic rhizobium , and the other
strains , from bur clover rhizobium.[ Conclusion] The experimental strains had a wealth of genetic diversity.BOX-PCR analysis could distinguish the dif-
ferences between them.The majority of strains were clustered by the host and collected location, but there was also cross among the strains .
Key words　Rhizobium;BOX-PCR;Alfalfa;Bur clover;Black medic
　　南苜蓿(M.polymorpha)和天蓝苜蓿(Medicago lupulina)是
两种重要的豆科牧草 ,研究与它们结瘤的根瘤菌有助于研制
相应的接种剂及扩大其种植面积 。
　　BOX-PCR是利用根据 BOX重复因子设计的引物进行
PCR扩增以得到细菌指纹图谱信息的一种方法 。BOX重复
因子散布于细菌基因间 ,长度为 154 bp ,分为 boxA 、boxB和
boxC 3个亚因子 ,其中长为 59 bp的 boxA最为保守[ 1] ,因此根
据 boxA设计的引物 boxA1R可用于对不同菌株进行 PCR以
获得不同的图谱 ,能够方便快捷地在种及种以下水平上揭示
菌株基因组间的差异及其遗传多样性[ 2] 。
笔者选择分离自云南省楚雄州 、德宏州 、玉溪市 、文山州
及红河州部分地区南苜蓿及天蓝苜蓿根瘤的 90株根瘤菌及
5株标准菌株进行 BOX-PCR分析 ,对它们进行初步分群 ,并
研究它们的遗传多样性与地域 、寄主的关系 ,旨在为南苜蓿
及天蓝苜蓿高效固氮根瘤菌的筛选和接种剂的研究提供理
论依据。
1　材料与方法
1.1　供试菌株　野外采集南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤时 ,挑选
饱满健壮的根瘤存入装有变色硅胶的 5 ml冻存小管干燥以
短期保存根瘤。干燥的根瘤在分离之前 ,于蒸馏水中浸泡复
基金项目　云南省应用基础研究计划面上项目(2007C067M)。
作者简介　张斌(1984-),男 ,云南江川人,硕士研究生 ,研究方向:植物
与微生物固氮。 ＊通讯作者, 博士 , 副教授 , E-mail:liuxi-
aoyunly@126.com。
收稿日期　2009-02-13
苏过夜后参照Vincent的方法进行分离[ 3] ,经稀释纯化后得
到了 189株纯培养物 ,根据菌落特征 、菌体显微形态及采集
地点的差异选择了 90株菌作为供试菌株进行 BOX-PCR
分析 。
　注:M , 100 bp DNA Marker;1 , SWF65100;2 , SWF65103;3 ,
SWF65105;4 , SWF65107;5 , SWF65112;6 , SWF65114;7 ,
SWF65115;8 , SWF65116;9 , SWF67397;10, SWF67398;11 ,
SWF67400。
　Note:M , 100 bp DNA Marker;1 , SWF65100;2 , SWF65103;3 ,
SWF65105;4, SWF65107;5, SWF65112;6 , SWF65114;7 ,
SWF65115;8, SWF65116;9, SWF67397;10, SWF67398;11 ,
SWF67400.
图1　部分菌株 BOX-PCR图谱
Fig.1　BOX-PCR electrophoretogram of partial strains
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 , 37(12):5395-5397　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　李菲菲　责任校对　况玲玲
图 2　BOX-PCR图谱聚类分析
Fig.2　Clustering dendrogram of BOX-PCR
1.2　BOX-PCR分析　将各菌株分别接种至 TY斜面培养基
于 28 ℃培养 3～ 4 d后收集菌体 ,照林万明的方法[ 4]提取基
因组 DNA 。使 用 单 引 物 boxA1R:5′-CGTCAGCGTCGC-
CTTGCCGTAG-3′进行扩增 ,25μl反应体系为:10×PCR Buffer
2.5μl ,25 mmol/LMgCl2 3.5μl , 10mmol/L dNTPs 1.0 μl ,DMSO
2.5μl ,10 mg/ml BSA 0.5 μl ,25 mmol/L boxA1R 0.5μl ,5 U/μl
Taq 酶 0.3 μl ,无菌超纯水补足 25 μl;扩增程序为 95 ℃预变
性 2 min ,94 ℃变性 1 min ,52 ℃退火 1min , 65 ℃延伸 8min ,30
个循环 ,65 ℃最终延伸 18 min。所得PCR产物于 1%琼脂糖
凝胶中 ,60 V电压下电泳 5～ 6 h ,使用凝胶成像系统拍照保
存图像以备分析。
1.3　聚类分析　分析所保存的 BOX-PCR琼脂糖凝胶电泳
图 ,在某一分子量上 ,有条带的泳道计为“1” ,没有的计为
“0” ,所得结果输入MVSP软件包(Demo版)中 ,采用 UPGMA
5396 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
算法生成聚类图。
2　结果与分析
2.1　BOX-PCR扩增情况　各供试菌株经过 BOX-PCR后 ,获
得了较多的遗传谱带 ,条带数在 10 ～ 20条 ,分子量大小分布
在 0.4 ～ 3.0 kb ,菌株之间的差异能够被区分开来;90株供试
菌株共有 31种 BOX-PCR图谱类型 ,表明与南苜蓿和天蓝苜
蓿共生的根瘤菌具有丰富的遗传多样性 ,部分菌株的 BOX-
PCR图谱如图 1。
2.2　聚类分析结果　采用UPGMA算法对 BOX-PCR指纹图
谱进行聚类 ,获得聚类树状图(图 2)。聚类图显示 ,在 40%的
相似性水平上 ,所有供试菌株及标准菌株聚为一群;而在
69%的相似性水平上 ,供试菌株则更细地分为 7个遗传群 ,
除分离自楚雄州禄丰县金山镇天蓝苜蓿的根瘤菌 SWF67371
单独成群外 ,其余菌株基本上按宿主及采集地聚在一起 ,但
也有交叉。群 1的菌株全部是分离自玉溪市江川县路居镇
天蓝苜蓿根瘤的根瘤菌;群 3的 10株菌与标准菌株 Enisfer
meliloti USDA 1002T聚在一群 ,它们都分离自德宏州盈江县的
南苜蓿根瘤;群 7 包含 64 株菌 ,除 SWF66320、SWF67343、
SWF65116和 SWF67370 4株菌的宿主为天蓝苜蓿外 ,其余 60
株菌的宿主都为南苜蓿;在 4、5、6遗传群中 ,除 SWF67340的
宿主为南苜蓿外 ,其他菌株的宿主都为天蓝苜蓿 ,但群 4、5、
6 、7中按采集地聚群的情况并不明显;采自不同地域的菌株
能够聚为一群 ,表明这类菌株的分布范围较广;标准菌株
162K68(R.leguminosarum bv .Trifolii)及 CCBAU2609T(Mesorhi-
zobium huakuii)聚为一群 ,而USDA6T(Bradyrhizobium japonicum)
和USDA2370T(R .legunimosarum bv.viceae)则单独分开 。
3　讨论
在该研究中 ,BOX-PCR能够很好地区分与南苜蓿及天蓝
苜蓿共生的根瘤菌菌株间的差异性 ,供试的 90株菌中 ,绝大
多数按宿主及采集地聚群 ,未按宿主聚群的菌株往往是来源
于同一采集地或距离相近采集地。南苜蓿和天蓝苜蓿在不
同地理环境中会与不同种的根瘤菌菌株结瘤 ,而在同一地理
区域内 ,分别与它们结瘤的根瘤菌菌株却可能极为相似。该
研究中 ,南苜蓿在德宏州盈江县主要与群 3内的菌株结瘤 ,
而在楚雄州则主要与群 7 内的菌株结瘤;群 2中的菌株
SWF67340和 SWF67344以及群 7中的SWF67343和 SWF67347 ,
虽然宿主植物不同 ,但它们之间的 BOX-PCR图谱相似性都
为 100%,这说明宿主及生态地理环境对根瘤菌的影响深刻 ,
也更加证实了陈文新等[ 5]的观点。
此外 ,采自两个相距较远的地点的菌株间也有会具有较
高的 BOX-PCR图谱相似性。SWF66437 和 SWF67487两株菌
的采集地直线距离 320 km左右 ,并且两地的海拔 、气候类型
等均有显著差异 ,但它们的 BOX-PCR图谱相似性却为 90%,
同时聚在了群 6中 ,表明这种类型的菌株的适应性较强 ,分
布范围较广。
由于 BOX-PCR技术的性质 ,所揭示的各供试菌株间的
差异仅在种及种以下水平上适用。在该试验中 ,标准菌株
162K68(R.leguminosarum bv.Trifolii)及 CCBAU2609T(Mesorhi-
zobium huakuii)聚在一起 ,而分属于不同属的标准菌株之间也
表现出了较高的相似性 ,这都表明仅靠 BOX-PCR来进行种
以上的分群是不准确的。该研究中供试菌株在种 、属以上分
类单元上的差异性还有待进一步研究。
云南省多样的生态地理环境及众多的豆科植物种类孕
育了丰富的根瘤菌资源 ,先从采集不同生态环境的苜蓿根瘤
开始 ,并分离保存根瘤菌 ,再针对不同苜蓿品种筛选出固氮
效率高的根瘤菌 ,研制根瘤菌接种剂 ,将具有巨大的生态和
经济效益。
参考文献
[ 1] THEARITH KOEUTH, JAMES VERSALOVIC , LUPSKI JAMES R.Differential
subsequence conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae
BOX Elements in diverse bacteria[ J] .Genome Research, 1995 ,5:408-418.
[ 2] 杨凤环 ,李正楠,姬惜珠,等.BOX-PCR技术在微生物多样性研究中的
应用[ J] .微生物学通报, 2008 ,35(8):1282-1286.
[ 3] VINCENT J M.AManual for the practical study of root nodule bacteria[M] .Ed-
inburgh:Blackwell Scientific Pubilications , 1970.
[ 4] 林万明.细菌分子遗传学分类鉴定法[M] .上海:上海科学技术出版社 ,
1990:58-59.
[ 5] 陈文新 ,汪恩涛,陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的
关系[ J] .中国农业科学, 2004 ,37(1):81-86.
(上接第 5394页)
3　结论与讨论
笔者通过调节发酵罐内混合料的初始温度 、水分含量 、
pH值 、C/N 、C/P等特性参数 ,对物料进行了厌氧发酵试验。
检测结果表明 ,发酵初始液化阶段时 ,C/N值控制在 26～ 28 ,
C/P值为 46 ～ 48 ,温度控制在 45 ℃左右 ,水分含量为 60%～
65%,pH值为 6.8 ～ 8.3 。温度视发酵阶段的不同 ,发酵罐应
该调节到相应的温度 。该方法得到的物料养分 N 、P 、K含量
分别为 1.78%、1.69%和 1.86%,均高于农用控制标准 ,具有
十分明显的资源化利用价值。发酵过程中 ,采取了适时放气
降温 ,缩短物料停留时间 ,可以多出肥少产气 ,提高肥效。
本次厌氧发酵试验 ,方法简单 ,操作方便 ,物料反应周期
短 ,有助于禽畜粪便的无害化处理和农村生态环境的改善。
试验中所产生的沼液与砻糠 、草木灰或其他植物梗 、茎 、叶混
合配制成营养土 ,可广泛应用在花卉 、园林 、草坪植被等方
面。为了达到有机肥料出厂的国家标准[ 5](制粒含水量应≤
20%),在制粒前 ,增加了一台HTA 型转鼓浓缩一体脱水机 ,
先脱去约 30%左右的水分后 ,然后放入 KY3510型制粒机蒸
汽糊化制粒 ,用 SKLN2.5型逆流式冷却器 ,将颗粒料冷却至 3
～ 5 ℃,使出厂的有机肥颗粒达到国家标准。有关混合气体
的甲烷分离 ,有待于今后设备的进一步完善 ,目前暂时与沼
液一起由回收塔收集 、冷却液化后 ,用于营养土的配制。
参考文献
[ 1] 李国学 ,张福锁.固体废物堆肥与有机肥生产[M] .北京:化学工业出
版社, 2000.[ 2] 魏振枢 ,杨永杰.环境保护概论[M] .北京:化学工业出版社, 2003.
[ 3] 金维续.中国有机肥[M] .北京:农业出版社, 1991.
[ 4] 贾小红 ,黄元芳,徐建堂.有机肥料加工与施用[M] .北京:化学工业出
版社, 2002.
[ 5] 沈其荣.土壤肥料概论[M] .北京:中国农业出版社 ,2000.
539737卷12期　　　　　　　　　　　　　　　　张斌等　云南省南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤菌 BOX-PCR分析