全 文 ：第 27卷第 2期
2009年 3月 干 旱 地 区 农 业 研 究Agricultural Research in the Arid Areas Vol.27 No.2M ar.2009
　
收稿日期:2008-09-04
基金项目:国家自然科学基金(30670372);霍英东青年教师基金(101029);高等学校博士点基金(20050712013);西北农林科技大学拔
尖人才支持计划
作者简介:位秀丽(1981—),女 ,硕士 ,主要从事根瘤菌多样性及其应用研究。
通讯作者:韦革宏。 E-mail:weigehong@yahoo.com.cn。
西北部分重金属矿区天蓝苜蓿根瘤菌生理生化特性
及 16S rDNA PCR-RFLP 分析
位秀丽 ,付芸芸 ,韦革宏
(西北农林科技大学生命科学学院 , 陕西杨凌 712100)
　　摘　要:对分离自西北地区 6 个矿区采样点的 68 株天蓝苜蓿根瘤菌进行了生理生化特性和 16S rDNA PCR-
RFLP分析。唯一碳源利用结果表明:供试菌株均能利用丁二酸钠等 7 种碳源 , 均不能利用马尿酸钠等 4 种碳源。
在苯酚作为唯一碳源的培养基上生长试验表明:所有菌株可以在 400 mg/ L 的苯酚培养基上生长;5 株菌可以在
700 mg/ L浓度下生长;所有菌株都不能在 800 mg/ L浓度以上的苯酚培养基上生长。重金属耐受性结果表明:供
试菌株对重金属有不同程度耐受性 , 筛选出 1 株具有优良重金属耐受性的菌株 CCNWGS0037。 16S rDNA PCR-
RFLP分析结果表明:所有菌株可以分为 3 种类型 ,全序列测定结果分析表明分别属于中华根瘤菌属(Sinorhizobi-
um)、根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(Agrobacterium)。综合分析 ,矿区天蓝苜蓿根瘤菌多样性比较单一。
关键词:天蓝苜蓿;根瘤菌;生理生化;16S rDNA PCR-RFLP
中图分类号:S154.34　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7601(2009)02-0223-04
　　天蓝苜蓿 , 别名黑荚苜蓿 , 什花苜蓿 ,米粒苜
蓿。是一年生或越年生豆科草本植物 ,分布广泛 ,生
长迅速 ,对环境适应性强 ,是一种优良的牧草植物 ,
全草可入药 ,可治毒蛇咬伤及蜂螫。同时也是少数
几个能在尾矿呈局部密集生长的豆科植物之一 ,成
为废弃地植被形成的先锋种或建群种 ,在废弃地植
被形成过程中起着十分重要的作用[ 1] 。各种矿床
在开采过程中 ,使地下一定深度的矿物暴露于地表
环境 ,经过选矿 、冶炼等过程 ,产生了多种污染物 ,对
矿区及其周边地区造成严重的污染[ 2] 。有关矿业
废弃地生态修复问题已刻不容缓。而矿业废弃地生
态修复的最重要的限制因子之一是重金属毒性和养
分不足 ,而 N 素的极端不足又是养分不足中的核心
问题[ 3] 。研究与其共生的根瘤菌特性 ,有利于为天
蓝苜蓿在矿区的应用提供理论基础 。
本文对采自西北地区六个重金属矿区的天蓝苜
蓿根瘤菌进行了生理生化特性测定及 16S rDNA
PCR-RFLP分析 ,确定了其系统发育地位 ,为天蓝苜
蓿根瘤菌的应用提供了重要的种质资源和理论基础。
1　材料和方法
1.1　材料
菌株:来源于陕西 、甘肃 6 个采样点的 68 株根
瘤菌 ,见表 1 。
6个采样点分别为:甘肃省成县城关镇邵总村
铅锌矿;甘肃徽县柳林镇青阳村铅锌矿;陕西省凤县
唐藏镇庞家河村金矿;陕西省宁强代家坝镇张家坝
村铁矿;陕西省略阳郭镇铧厂沟村金矿;陕西省太白
尾矿金矿区金矿。
铅锌矿引起的污染主要是开采过程中产生的一
些粉尘污染 ,铅和锌是主要的污染源;金矿和铁矿多
为伴生矿 ,产生的污染多为伴生金属污染和开采过
程中使用的一些试剂污染;综合这些矿区污染特点 ,
选择较为常见的铅 、锌 、铜 、铬四种金属离子进行特
性测定。
1.2　生理生化特性测定
采用 Chen WX等[ 4]的方法对供试菌株进行了
92项生理生化性状测定 ,包括唯一碳源利用 、脲酶 、
过氧化氢酶 、耐盐性 、生长温度范围 、对抗生素 、染
料 、重金属的抗性 、以及对苯酚的利用[ 5] 。
其中唯一碳源包括:L -树胶醛糖 、丁二酸钠 、
鼠李糖 、D-果糖 、半乳糖 、丙酮酸钠 、马尿酸钠 、L -
阿拉伯糖 、L -山梨糖 、L-山梨醇 、D-木糖 、赤丝草
醇 、糖原 、柠檬酸三钠 、乙酸钠 、葡萄糖 、蔗糖 、淀粉 、
海藻糖 、肌醇 、棉籽糖 、酒石酸钠 ,终浓度均为0.1%。
苯酚浓度为:400 、500 、600 、700 、800 和 900
mg/L。
表 1　供试菌株及 16S rDNA PCR-RFLP图谱类型
Table 1　Tested str ains and the types of 16S rDNA PCR-RFLP fingerprint patterns
菌株
S trains
地理来源
Geographic sources
16S rDNA 图谱类型
16S rDNA types
CCNWGS0026　CCNWGS0030-1　CCNWGS0034-2　CCNWGS0027　CCNWGS0032
　CCNWGS0036 - 1 　CCNWGS0028 - 1 　CCNWGS0033 　CCNWGS0037 　CCN-
WGS0029　CCNWGS0034-1
甘肃成县
Chengxian Gansu
Ⅰ
CCNWGS0040-1　CCNWGS0045　CCNWGS0050-1　CCNWGS0041　CCNWGS0046
-2　CCNWGS0051-1　CCNWGS0042-1　CCNWGS0047-1　CCNWGS0052-1　
CCNWGS0043-1　CCNWGS0048　CCNWGS0053-1　CCNWGS0044
甘肃徽县
Huixian Gansu
Ⅰ
CCNWSX0016　CCNWSX0018 - 1　CCNWSX0019 -1 　CCNWSX0017- 1　CCN-
WSX0018-2　CCNWSX0020　CCNWSX0017-2　CCNWSX0019-1
陕西凤县
Fenxian Shaanxi
Ⅰ
CCNWSX0021　CCNWSX0023-1　CCNWSX0024-1　CCNWSX0022　CCNWSX0023
-2　CCNWSX0024-2
陕西宁强
Ningqiang Shaanxi
Ⅰ
CCNWSX0025-1　CCNWSX0026 陕西略阳
Lueyang Shaanxi
Ⅰ
CCNWSX0028-1　CCNWSX0031-1　CCNWSX0036-2　BTB02-1　BTB51-1　
BTB58-2　CCNWSX0028-2　CCNWSX0032　CCNWSX0037-2　BTB02-2　BTB52
-1　BTB100-2　CCNWSX0029　CCNWSX0033-2　CCNWSX0038-1　BTB03-1
　BTB53-2　BTB101-1　CCNWSX0030　CCNWSX0035-1　CCNWSX0038-2　
BTB50-1　BTB55-1　BTB101-2
陕西太白
Taibai S haanxi
Ⅰ
CCNWGS0031-1　CCNWGS0035　CCNWGS0038 甘肃成县
Gansu Chengxian
Ⅱ
CCNWSX0025-2 陕西略阳
Lueyang Shaanxi
Ⅲ
　　抗生素种类:青霉素 、链霉素 、庆大霉素 、卡那霉
素 、氯霉素和阿奇霉素 ,设 4个浓度梯度:5 、50 、100
和 300 μg/mL 。
重金属盐种类和浓度:氯化铜(0.4 、0.6 、0.8 、
1.0 、1.2 mmol/L)、硝酸铅(0.8 、1.3 、1.8 、2.3 、2.8
mmol/L)、硫酸锌(1.4 、1.8 、2.2 、2.6 、3.0 mmol/
L)、硫酸铬(0.1 、0.6 、1.2 、1.8 、2.4 mmol/L)。
菌体制备:将供试菌株接入 5 mL TY培养基 ,
28℃,130 r/min振荡培养 3天 。4℃12 000 rpm离
心 5 min ,收集菌体 ,弃去上清液 ,双蒸水洗涤 3次 。
加入 600 μL 双蒸水 ,混匀待用 ,多点接种器接于待
测指标平板 ,3 d后观察结果。
1.3　16S rDNA PCR-RFLP分析
将供试菌株接入 5 mL TY 培养基 , 28℃, 130
r/min振荡培养 3 d;4℃下 12 000 rpm 离心 5 min ,
收集菌体。参照 Laguerre G.等的方法[ 6] 提取总
DNA ,进行 PCR扩增 , 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增结果。扩增用引物:
正向引物 P1:5′-CGGGATCCAGAGTTTGAT
CCTGGCTCAGAACGAACGCT -3′
反向引物 P6:5′-CGGGATCCTACGGCTACC
TTGTTACGACTTCACCCC-3′
RFLP分析选用 HaeⅢ、Hinf Ⅰ 、Msp Ⅰ三种限
制性内切酶消化[ 7] , 2.0%凝胶电泳 , Bio-Rad 凝胶
成像系统照相 。分析其酶切图谱类型 ,选择代表菌
株进行全序列测定 ,并构建系统发育树 。
2　结　果
2.1　唯一碳源利用
唯一碳源利用测试结果表明所有供试菌株均可
以利用丁二酸钠 、L -阿拉伯糖 、D-木糖 、蔗糖 、葡
萄糖 、肌醇 、海藻糖 7 种碳源;均可以在 400 mg/L
的苯酚作为唯一碳源的培养基上生长;均不能利用
马尿酸钠 、酒石酸钠 、淀粉和糖原;均不能利用 800
mg/L 和 900 mg/L 的苯酚;5 株菌可以利用 700
mg/L 的苯酚。
分别有 5株 、6株 、7株 、12株 、12株 、22株不能
利用 L-山李糖 、赤丝草醇 、丙酮酸钠 、棉籽糖 、柠檬
酸三钠和乙酸钠。
CCNWSX0026 不能利用半乳糖和 D-果糖;
CCNWSX0025-2和 BTB02-1不能利用 L-树胶
醛糖;CCNWGS0047-1 和 CCNWSX0026 不能利
用鼠李糖;CCNWGS0047-1 和 CCNWGS0052-1
不能利用 L -山梨醇 。CCNWGS0047 -1 、CCN-
WSX0026 、CCNWGS0052-1 和 CCNWSX0025-2
共 4株菌的碳源利用范围较窄 ,仅能利用 22种碳源
的 12种 、13种 、14种和 15种 。
224　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 27卷
2.2　抗生素抗性
55株菌能在 300 μg/mL的青霉素下生长;半数
的菌株能耐受 5μg/mL 的庆大霉素和链霉素;19株
菌可以耐受 100 μg/mL 的氯霉素。
2.3　重金属耐受性
6株菌可以耐受浓度高达 2.8 mmol/L 的硝酸
铅;3株菌可以耐受浓度为 3.0 mmol/ L 的硫酸锌;4
株菌能耐受 1.2 mmol/L 的氯化铜;1株菌可以耐受
1.2 mmol/L 硫酸铬。
菌株 CCNWGS0037表现出良好的重金属耐受
性 ,能分别耐受 3.0 mmol/L 的硫酸锌 、1.2 mmol/L
的氯化铜 、0.6 mmol/L 的硫酸铬以及 2.8 mmol/L
的硝酸铅 ,并能在 700 mg/L 的苯酚为唯一碳源的
培养基上生长 。
2.4　16S rDNA PCR-RFLP
经 16S rDNA PCR-RFLP 分析 ,供试菌株可分
为Ⅰ 、Ⅱ和 Ⅲ共 3种类型(见表 1),全序列测定结果
及系统发育树见图 1 。
图 1　依据 16S rDNA 全序列构建的系统发育树
Fig.1　Phylogenic tree based on the 16S rDNA sequences
　　从表 1和图 1可以看出 ,类型 Ⅰ共 64株菌 ,占
所有供试菌株的 94%;其代表菌株 CCNWSX0018
-1在系统分类地位上属于中华根瘤菌属(S inorhi-
zobium),与草木樨根瘤菌(S .meli lot i)亲缘关系最
近 ,序列相似性达到 100%。与中华根瘤菌属内各
已知种的模式菌株 16S rDNA相似性最小为97.8%,
225第2期　位秀丽等:西北部分重金属矿区天蓝苜蓿根瘤菌生理生化特性及 16S rDNA PCR-RFLP分析
大于划分属的标准(95%)[ 8] ;研究表明天蓝苜蓿根
瘤菌比较单一 ,与陈文新等的研究结果一致[ 9] 。
类型 Ⅱ的代表菌株 CCNWGS0031-1 与根癌
农杆菌 Ag.tumefaciens 的亲缘关系最近 ,序列相
似性达到 99.1%, 属于土壤杆菌属(Agrobacteri-
um)分支 。
类型 Ⅲ的代表菌 CCNWSX0025-2 序列测定
分析结果表明 ,该菌株属于根瘤菌属(Rhizobium),
和豌豆根瘤菌三叶草生物型的相似性为 100%,可
认为是同种菌。
3　结论和讨论
供试菌株在重金属耐受性实验中 ,供试菌株有
不同程度的重金属耐受性 。其中经 16S rDNA
PCR-RFLP 结果分析鉴定为中华根瘤菌属的菌株
CCNWGS0037的重金属抗性比较显著 ,该菌株来自
甘肃成县铅锌矿尾矿区 ,能分别耐受 3.0 mmol/ L
的硫酸锌 、1.2 mmol/L 的氯化铜 、0.6 mmol/L 的硫
酸铬以及 2.8 mmol/ L 的硝酸铅 ,并能在 700 mg/ L
的苯酚为唯一碳源的培养基上生长 。Carrasco 等在
黄铁矿溢出污染区 ,分离得到 41株耐 2.4 mmol/ L
Pb2+的菌株[ 10] 。聂湘平等人发现大叶相思的根瘤
菌 ,可以耐受小于 10.0 mmol/L 的 Zn2+离子浓度 、
可以耐受小于 0.80 mmol/L 的 Cu2+离子浓
度[ 11 , 12] ;朱毓华等[ 13] 从歪头菜中分离出一株根瘤
菌能耐受 0.2 mmol/ L的 Cd2+。通过和前人已有的
研究对比显示:该菌株对 Cu2+、Cd2+、Pb2+的抗性
比较显著 ,值得进一步研究。
本实验中 ,分离到 3株土壤杆菌 ,代表菌株 CC-
NWGS0031-1 与根癌土壤杆菌 Ag.tumefaciens
的相似性为 99.1%,可以认为是同种菌。国内外学
者也经常在分离根瘤菌的过程中可以分离到土壤杆
菌 ,现在已有学者证明土壤杆菌可以在根瘤菌的存
在下进入根瘤定殖 ,对宿主的生长和结瘤没有影响 ,
但不能引起结瘤[ 14] 。土壤杆菌和根瘤菌的关系和
分类一直是一个比较有争议的话题 ,在系统发育过
程中根瘤菌属与土壤杆菌属亲缘关系紧密 ,其中的
部分种在以 16S rDNA序列分析为基础的系统发育
树上互有交叉 ,形成一个分类群 ,故有些学者建议将
两属的界限打破 ,重新划分[ 15] 。因此关于土壤杆菌
和根瘤菌的分类还需要进一步研究 。
类型Ⅲ的代表菌株 CCNWSX0025-2 16S rD-
NA序列比对结果表明:该菌株属于根瘤菌属 ,与豌
豆根瘤菌的相似性达到 100%。目前已知的该种根
瘤菌共有豌豆 、三叶草 、菜豆三种生物型 ,尚未发现
有苜蓿生物型的报道。本课题组在来自另一采样地
的天蓝苜蓿根瘤中也分离出了 1株豌豆根瘤菌 ,因
此判断有可能是在进化过程发生了基因水平转移。
迄今未有人报道过豌豆根瘤菌可以在天蓝苜蓿上接
瘤 ,也未有人报道过豌豆根瘤菌的寄主涉及苜蓿 ,因
此有必要进行深入研究 ,如能与天蓝苜蓿回接成功 ,
则有可能是豌豆根瘤菌的一个新的生物型 。
参 考 文 献:
[ 1] 　王友保 ,张　莉 ,刘登义 , 等.铜陵铜尾矿库植被状况分析[ J] .
生态学杂志, 2004 , 2(1):135—139.
[ 2] 　廖国礼,吴　超 ,冯巨恩.矿坑废水污灌区河流重金属离子污
染综合评价实践[ J] .矿冶 , 2004 , 13(1):86—90.
[ 3] 　Li R W , Daniels W L.Nitrogen accumulation and form over t ime
in young mine soils[ J] .Journal of Environmental Quali ty , 1994 ,
23(1):166—172.
[ 4] 　Chen W X , Yan G L , Li J L.Numerical taxonomic study of fast
grow ing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be
assigned to Sinorhizobium gen nov[ J] .Int J Syst Bacteriol ,
1988 , 38(4):392—397.
[ 5] 　韦革宏,聂　刚 ,张宏昌 ,等.陕西部分地区胡枝子和草木樨根
瘤菌的数值分类研究[ J] .西北植物学报 , 2004 , 24:1697—
1701.
[ 6] 　Chen W P , Kuo T T .A simple and rapid method for the prepara-
tion of gram-negative bacterial genomic DNA[ J] .Nucleic Acids
Research , 1993 , 21(9):2260.
[ 7] 　Laguerre G , Mavingui P , Allard M R , et al.Typing of rhizobia
by PCR DNA fingerp rint ing and PCR-rest riction f ragment length
polymorphism analysis of ch romosomal and symbiot ic gene re-
gions:application to Rhizobium leguminosarum and it s dif ferent
biovars[ J] .Appl Environ Microbiol , 1996 , 62(6):2029—2036.
[ 8] 　TAN ZH Y , CHEN W X.S equencing the 16S rDNA of repre-
sentative strain of new rhizobia g roup and determining of it s phy-
logenetic relat ionship [ J] .Acta Microbiologica Sinica , 1997 , 37
(6):411—416.
[ 9] 　CHEN W X ,WANG E T , CHEN W F.The relationship betw een
t he symbiotic promiscui ty of rhizobia and legumes and t heir geo-
graphical envi ronments[ J] .S cient ia Agriculture Sinica , 2004 , 37
(1):81—86.
[ 10] 　Carrasco J A , Armario P , Pajuelo E , et al.Isolation and charac-
teri sation of symbiotically ef fective Rhizobium resi stant to arsenic
and heavy metals af ter the toxic spill at the Anal collar py rite
mine[ J] .Soi l Biology &Biochemist ry , 2005 , 37:1131—1140.
[ 11] 　聂湘平 ,蓝崇钰 ,束文盛 , 等.针对大叶相思-根瘤菌共生固
氮体系影响研究[ J] .植物生态学报, 2002 , 26(3):264—268.
[ 12] 　聂湘平 ,蓝崇钰 ,束文盛 , 等.针对大叶相思-根瘤菌共生固
氮体系影响研究[ J] .植物生态学报, 2002 , 13(2):137—140.
[ 13] 　朱毓华 ,韦革宏 ,陈卫民 ,等.陕西太白尾矿区根瘤菌多样性
及抗性菌株筛选[ J] .西北植物学报 , 2006 , 26(7):1443—
1448.
(下转第 238页)
226　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 27卷
Quantitative characteristics and germination dynamic variation of soil seed
bank during the course of restoration at Loess gully region
GUO M an1 ,2 , ZHENG Fen-li1 ,2 , AN Shao-shan1 , 2 , LIU Yu1 ,2 , BAI Wen-juan2
(1.College of Resources and Environment , Northwest A & F University , Yangling Shaan xi 712100 , China;
2.State Key Laboratory of Soil Erosion and Dry land Farming in Loess Plateau , I nstitute of
Soil and Water Conservation CAS & MWR Yangling Shaanx i 712100 , China)
　　Abstract:Taking the pasture zone of Loess gully region(Guyuan Area of Ningxia Hui Municipality)as a
case study , this paper selected eight research sites according to the dif ferent vegetation resto ration years(2 , 5 ,
12 , 24 , 35 , 55 , 75 a and cropland control)to study quanti tative characteristics and dynamic change of soil seed
bank germination through field survey and a labo ratory experiment of seed germinat ion.The research results
showed at the different vegetation resto ration years , average amount of seed sprout w as 3 542.5 seeds/m2 , and
the amount of discotyledon vegetation accounted for 90% of the total.The seed sprout amount in 0 ～ 5 cm soil
layer varied 166.7 to 9 100.0 seeds/m2 and in 5 ～ 10 cm soil layer changed 133.3 to 2 120.0 seeds/m2.At the
different resto ration years , an order of seed germination amount was increase before and decreases af ter;the
temporal pattern of seed germination amount w as approximate unimodal.Except cropland , the peak value of
seed germinat ion fo r dicotyledon appeared in 4 to 6 weeks;the peak value of seed germination for monocoty ledon
occurred in 5 to 6 weeks.This show that seed in the soil come into being a peak value of germination under the
appropriate condi tion of environment , climate and so on in the pasture zone of Loess gully region.
Key words:vegetat ion restoration years;soil seed bank;seed germination;quantitative characteristics;
germination dynamic variat ion
(上接第 226页)
[ 14] 　WANG L L , WANG E T , LIU J , et al.Endophytic occupation
of root nodules and root of Meli lotus dentatus by Agrobacte-ri-
um tumefaciens[ J] .Microbiol Ecol , 2006 , 52:436—443.
[ 15] 　De Lajudie P , Willems A , Pot B , et al.Polyphasic taxonomy of
rhi zobia:emendation of the genus Sinorhizobium and description
of Sinorhizobium meliloti comb.nov., Sinorhizobium saheli sp.
nov., and Sinorhizobium teranga sp.Nov[ J] .In t.J.Syst.
Bacteriol , 1994 , 44:715—733.
Physiological and biochemical characters and 16S rDNA PCR-RFLP of Rhizobia
isolated from Medicago lupulina in mining regions of Northwest China
WEI Xiu-li , FU Yun-yun , WEI Ge-hong
(College of Li fe Science , Northwest A & F University , Yangling , Shaan xi 712100 , China)
　　Abstract:68 rhizobia st rains isolated f rom Medicago lupulina in mining regions of Northwest China were
analy zed to study thei r physiological and biochemical characters and 16S rDNA PCR-RFLP , The only carbon
source use results show that all the tested strains can use 7 kinds of carbon sources including sodium succinate ,
but canno t use 4 kinds of carbon sources including sodium hippurate.When the phenol is used as the only carbon
source , all the tested strains can grow under 400 mg/L , but cann t g row under 800 mg/L or more than that , 5
strains can g row under 700 mg/L.The tested st rains have dif ferent resistibility to heavy metal.One isolate ,
CCNWGS0037 , w ith the best resistibility to heavy metal is obtained.All the 16S rDNA fingerprints are divided
into three types , and the full-length sequences and PCR-RFLP of 16S rDNA show that the tested strains belong
to Sinorhizobium and Rhizobium and Ag robacterium respectively.From this study , i t can be concluded that the
diversi ty of the tested strains is poor.
Key words:Rhizobia;16S rDNA;PCR-RFLP;Medicago lupulina
238　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 27卷