全 文 ：基金项目：国家自然科学基金(No. 31172252)
收稿日期：2014-06-12 接受日期：2014-07-01
铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择
孙亚丽 张德辉 赵亮 夏聪聪 丑敏霞*
西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，杨凌712100
*通讯作者，minxia95 @126.com
摘 要 豆科植物-根瘤菌共生体系因固氮能力卓越，肥土效应明显，常被作为先锋植物进行环境修复。
利用 qRT- PCR 分析铜胁迫下天蓝苜蓿 (Medicago lupulina L.)与根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti,
CCNWSX0020)共生固氮过程中差异基因时，由于环境中铜离子差异可能使持家基因表达不稳定，因此
需要筛选合适的持家基因作为内参。本研究选取8个天蓝苜蓿的持家基因 (肌动蛋白 (beta actin, ACT)、
组蛋白 (histone H2A, H2A)、核糖体蛋白18S (ribosomal 18S, 18S)、微管蛋白 (tubulin beta, TUB)、泛素连接
酶 (ubiquitin, UBI)、延伸因子 1 (elongation factor 1, EF1)、甘油醛 - 3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde- 3-
phosphate dehydrogenase, GAPDH)和亲环蛋白 (cyclophilin, CYP))作为候选内参基因，人工模拟不同水平
铜 (浓度分别为50、100、150和200 mg/kg)污染，以接种根瘤菌后30 d的天蓝苜蓿根为材料，筛选最佳内
参基因。经引物特异性及PCR扩增效率检测，各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求。荧光定量
PCR分析结果表明，8个候选内参基因的表达水平和稳定性随铜离子浓度不同而呈现差异。在线评估所
有样品中候选内参基因表达稳定性，结合geNorm软件分析最佳内参基因组合数目，结果发现，最适内参
基因组合为GAPDH和EF1；分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性，结果表明，低浓
度铜 (≤50 mg/kg) 处理下最佳内参基因为 GAPDH，中高浓度铜 (≥100 mg/kg) 处理时最佳内参基因为
UBI。本研究结果为铜胁迫下天蓝苜蓿共生结瘤过程中差异基因的表达分析提供了基础资料，同时为其
他重金属胁迫下内参基因的筛选提供了参考和借鉴。
关键词 天蓝苜蓿，内参基因，荧光定量PCR，geNorm软件
Reference Gene Selection for Real- time Quantitative PCR in Black
Medic (Medicago lupulina L.) Root Tissue Under Copper Stress
SUN Ya-Li ZHANG De-Hui ZHAO Liang XIA Cong-Cong CHOU Min-Xia*
State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Life Science, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling
712100, China
* Corresponding author, minxia95 @126.com
Abstract Legumes are often recognised as the pioneer plants in tailing areas because of their outstanding
symbiotic nitrogen fixation. As the copper ions in the environment may lead to unstable expression of
housekeeping genes, screening reference genes is important to identify the differentially expressed genes in
black medic (Medicago lupulina L.) during the symbiotic nodulation with Sinorhizobium meliloti
CCNWSX0020 under copper stress using qRT- PCR. In this study, the eight housekeeping genes(beta actin
(ACT), histone H2A(H2A), ribosomal 18S(18S), tubulin beta(TUB), ubiquitin(UBI), elongation factor 1(EF1),
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) and cyclophilin(CYP)) from black medic were selected
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(10): 1223~1231
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.10.005
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 引言
实时定量 PCR (Real- time quantitative reverse
transcription PCR, qRT-PCR) 具备高度敏感性、高
效性及专一性等特点，已成为基因表达研究的领衔
技术之一。然而，大量研究结果显示，选择的内参
基因不同，目的基因标准化后表达水平不同(Sel-
lars et al., 2007)，因此分析目的基因表达水平时，选
择合适的内参基因至关重要。
在植物 qRT-PCR研究中内参基因通常选自组
成型表达的持家基因 (housekeeping genes)，主要包
括 18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceral-
dehyde- 3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)、延伸
因子 1 (elongation factor 1, EF1)、多聚泛素酶基因
(polyubiquitin, UBQ)、泛素连接酶基因 (ubiquitin,
UBI)、肌动蛋白基因 (beta actin, ACT)、α微管蛋白基
因 (tubulin alpha, TUA)、β微管蛋白基因 (tubulin be-
ta, TUB)、亲环蛋白基因 (cyclophilin, CYP) 和组蛋
白基因 (histone H2A, H2A)等，这些基因是生物体
维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分
(ACT, TUA, TUB等)，或参与生物体的基本生化代
谢过程 (GAPDH、EF1、UBQ等)，因此理论上持家基
因在所有细胞和生理状态下都稳定地表达。然而
有研究报道表明，内参基因在不同非生物因子胁迫
下的表达并非持续稳定(Pombo-Suarez et al., 2008;
Infante et al., 2008; Spinsanti et al., 2006; Yan, Liou,
2006; Radoni et al., 2004)，并且其稳定性也受同一
非生物胁迫因子不同浓度水平的影响(Gutierrez et
al., 2008; Schmittgen, Zakrajsek, 2000; Thellin et
al., 1999)，因此利用qRT-PCR技术研究目的基因表
达水平需根据实验条件选择合适的内参基因。
豆科植物-根瘤菌共生体系具有重要的固氮价
值，是生态系统稳定与发展的关键因素之一，利用
共生体系不仅可以解决尾矿地土壤氮素含量不足
的问题，还可以吸收污染地中的重金属达到环境修
复的目的(聂湘平等, 2002)。本研究以能在重金属
尾矿地生长的天蓝苜蓿-苜蓿中华根瘤菌共生体系
为研究对象，挑选已报道的8个稳定表达的持家基
因作候选内参基因，通过实时定量 PCR技术检测
候选内参基因的表达水平，在线评估候选内参基因
表达的稳定性，筛选出适用于对铜处理下天蓝苜蓿
与根瘤菌共生互作过程中差异基因表达分析时的
最佳内参基因，为进一步研究铜离子影响天蓝苜蓿
共生结瘤相关基因的表达分析提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
供试根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti, CCNWSX0
020)由本实验室提供；供试天蓝苜蓿(Medicago lu⁃
pulina L.) 采自于西藏，由西北农林科技大学杨培
志教授提供。
1.2 方法
1.2.1 天蓝苜蓿培养和收集样品
天蓝苜蓿种子消毒之前用砂纸打磨脱皮，无菌
水冲洗6~8次，95%酒精浸泡1 min，30% NaClO处
理2 min，最后用无菌水冲洗6~8次，播种在2∶1(V/
and used to screen the optimal reference genes. The genes were generated from the roots of black medic
inoculated rhizobia at 30 d which were planted under the different levels of copper (50, 100, 150 and 200 mg/
kg, respectively). The analyses of primers specificity and PCR amplification efficiency showed that all the
primers were accordance with the requirements of the stability screening. The results of qRT-PCR indicated
that the expression level and stability of candidate genes were various along with the different concentration
of copper ion. With geNorm software and the online estimation of gene expression stabilities in all samples,
the optimal combination of reference genes was found to be GAPDH and EF1. The expressions of candidate
genes under different levels of copper were also online assessed separately and the results displayed that the
best reference gene was GAPDH at low concentration of copper (≤50 mg/kg) and UBI at moderate or high
copper level (≥100 mg/kg). The conclusions provide the appropriate reference genes for characterizing the
genes related to symbiotic nodulation and copper stress of Medicago lupulina L., and basic data for the plant
reference genes under other heavy metal stress.
Keywords Black medic (Medicago lupulina L.), Reference genes, qRT-PCR, geNorm software
1224
铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择
Reference Gene Selection for qRT-PCR Normalization in Black Medic Root Tissue Under Copper Stress
V)珍珠岩和蛭石的混合基质表面，盆栽培养，光
照/黑暗时间为 16 h /8 h、温度为 26 ℃/22 ℃培养。
对照组培养基中不加硫酸铜，实验组中加入不同
浓度的硫酸铜 (分别为 50、100、150和 200 mg/kg)
模拟铜污染，灭菌后平衡 7 d使铜离子均匀分布。
待天蓝苜蓿长出第一片真叶后接种根瘤菌，每隔
8 d浇适量的无氮营养液。取接菌第 30天的根保
存在-80 ℃的冰箱，每个处理重复3次。
1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成
取出保存在-80 ℃的样品，放入已预冷的装有
液氮的研钵中，Trizol试剂提取根中总 RNA。用
琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，并用 Nano-
drop ND-1000 紫外分光光度计测定RNA的浓度
和纯度。
使用 HiScriptTM Q RT SuperMix for qPCR (+
gDNA wiper)反转录试剂盒合成 cDNA，反转录体
系：模板 RNA 500 ng，4 × gDNA wiper Mix 2 μL，
RNase Free dH2O 补至 8 μL 体系，混匀，42 ℃ 2
min。再将 5×qRT Super Mix Ⅱ 加入 8 μL的反应
液，随后依次：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5
min。反转录产物保存于-20 ℃的冰箱中备用。
1.2.3 候选内参基因的选择和引物设计
选取常使用的8个内参基因，分别是肌动蛋白
基因 (beta actin, ACT)、组蛋白基因 (histone H2A,
H2A)、核糖体蛋白S18基因(ribosomal 18S, 18S)、微
管蛋白基因(tubulin beta, TUB)、泛素连接酶基因
(ubiquitin, UBI)、延伸因子 1(elongation factor 1,
EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase, GAPDH)和亲环蛋白基因
(cyclophilin, CYP)。参考 GenBank 中蒺藜苜蓿
(Medicago truncatula)相应基因的 cDNA序列，利用
Primer 5.0软件设计引物，扩增产物长度在 100~
300 bp之间，引物由上海生工生物工程有限公司合
成，引物信息见表1。
1.2.4 荧光定量PCR
各内参基因的荧光定量使用 SYBR® Primix
Ex TaqTM试剂盒 (Tli RNaseH Plus, 大连TaKaRa公
司)，反应在 CFX 96TM RealTime System (Bio-Rad)
荧光定量仪上进行。PCR反应体系 (20 μL)：稀释
的 cDNA 3 μL，上下游引物 (10 mmol/L)各 0.8 μL，
SYBR® Primix Ex TaqTM (2×) 10 μL，补灭菌去离子
水至 20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性 2 min；
95 ℃变性 5 s；60 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s；39个
循环。引物特异性检测温度为 65~95 ℃。每个内
参基因的 PCR扩增均含有不加模板的对照，实验
样品均重复3次。
在 CFX 96TM RealTime System (Bio-Rad)上进
行荧光定量PCR，扩增效率采用CFX96TM manag-
er分析。
1.2.5 数据分析
利用R软件分析候选内参基因在所用样品中
的表达水平，Sigma Plot 10.0软件分析候选内参基
因在不同铜浓度处理下的表达变化；采用 geNorm
软件计算 n (2≤n≤7) 个基因作为内参基因得出的
标准化因子的配对变异值Vn/n+1，确定最佳内参基因
组合数目；通过在线评估内参基因稳定性工具
(http://www.leonxie.com/referencegene.php/)检测候
选内参基因的稳定性，该工具包括常用的评估内参
基因稳定性软件 geNorm(Vandesompele et al.,
2002)、NormFinder(Andersen et al., 2004)、Best-
Keeper(Pfaffl et al., 2004) 和 The comparative ΔCt
(Silver et al., 2006)，经 4种软件分析得到候选内参
基因表达稳定值M，M值越小，稳定性越好。最后
结合 4种软件分析结果计算出候选内参基因稳定
性综合排名。
2 结果与分析
2.1 候选内参基因引物特异性检测
等量混合不同铜浓度处理下的天蓝苜蓿根组
织材料提取的RNA反转录合成的cDNA，以其为模
板PCR扩增8个候选内参基因，以检测8个候选内
参基因的引物特异性。扩增产物经凝胶电泳检测、
测序 (上海英潍捷基公司完成)，证实每对引物扩增
出的片段与目的片段大小吻合，扩增序列与目的产
物序列一致，说明引物具有较好的特异性和准确
性。同时对8个候选内参基因qRT-PCR，分析其溶
解曲线，发现除主峰以外没有其他杂峰，表明无非
特异性扩增及引物二聚体形成，说明所设计内参基
因的引物特异性良好，符合qRT-PCR分析要求。
2.2 候选内参基因扩增效率检测
等量混合不同铜浓度处理下的天蓝苜蓿根组
织材料提取的RNA反转录合成的cDNA，以其为模
1225
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
板PCR扩增8个候选内参基因，以检测各候选内参
基因的扩增效率。将扩增产物稀释 103倍，再将其
稀释液依次稀释 5、52、53、54和 55倍作为标准品，以
扩增产物的稀释浓度梯度为横坐标，循环阈值 (Ct
值)为纵坐标绘制各个内参基因的标准曲线，得到
各候选内参基因的相关系数 (R2)，其变化范围为
0.986~1.000，根据曲线斜率公式 (E=10(-1/slope)-1) 计
算各候选内参基因的扩增效率，结果见表1。如表
1所示，8个候选内参基因的扩增效率均分布在
90%~105%以内，因此所设计引物可用于荧光定量
PCR。
2.3 不同浓度铜处理下候选内参基因的表达水平
Ct值与基因表达水平成负相关，Ct值越小基因
表达丰度越高。本研究采用候选内参基因荧光定
量 PCR的Ct值评估候选内参基因的表达水平，结
果见图 1。结果显示，8个候选内参基因表达水平
分布于 9.61~32.91。其中 18S的Ct值最小，平均表
达丰度最高，而CYP的Ct值最大，表达丰度最低，
而ACT、H2A、TUB、UBI、EF1和GAPDH表达丰度变
化不明显，Ct值介于22~28之间。
2.4 铜处理下候选内参基因表达的变化
利用比较Ct值法分析各候选内参基因在不同
铜离子浓度处理下的表达变化，结果见图 2。图 2
显示，各候选内参基因总体变化趋势相似，当铜离
子浓度为50和150 mg/kg时，候选内参基因Ct值下
降，其表达量上升，而当铜离子浓度为 100和 200
mg/kg时，候选内参基因Ct值上升，其表达量下降，
因此不同铜离子浓度处理后各候选内参基因表达
水平不稳定，说明在非生物因子铜处理下候选内参
基因表达不稳定，很有必要筛选最佳内参基因。
2.5 最佳内参基因数量
单个内参基因表达不稳定，大量研究使用多个
内参基因来进行qRT-PCR的校正，从而得到更加准
确的结果。采用geNorm软件分析所有样品和不同
铜浓度处理下样品中最佳内参基因数目，其中配对
变异系数 (Vn/n+1)能够反映组合内参基因对校正结
果的影响程度，因此采用geNorm软件计算n(2≤n≤
基因
Genes
ACT
18S
H2A
CYP
UBI
TUB
GAPDH
EF1
GenBank登录号
GenBank accession No.
XM003621971
AF093506
XM003626292
AA660537
XM003595069
XM003631063
XM003595990
XM003591529
引物序列(5~3)
Primer sequences
F: GCCCTTCCACTTGCCATCCT
R: CACGAACAATCTCTCGCTCTGC
F: CCATAAACGATGCCGACCAG
R: TTCAGCCTTGCGACCATACTC
F: CGCCGTCCTTCAGTATCTCG
R: GGCAGCACACCACCATTAGC
F: CTTCCACCGTGTGTTCCCTC
R: CAAGCCATTCCGTCTTAGCG
F: CTCCATTTGCTGCTGCGTCTC
R: CCACCCCGAAGTCGCTACAC
F: ACAGCCTGAGCGGTGTTTAGAG
R: GTGGGACATCACAGATACTGGAC
F: TGGAAATCAATGGGAAGCAGG
R: ATAGGTGAATCAGCAGATGGAGC
F: ACCGAAGAGGGCATCAGATAAG
R: ACCAGTCATAACACGACCAACA
扩增长度/bp
Amplification length
124
112
171
212
257
139
190
100
扩增效率/%
qRT-PCR efficiency
91.8
103.1
94.9
91.6
91.5
90.1
90.3
97.2
表 1 候选内参基因的引物序列和扩增参数
Table 1 The primer sequences and amplification parameters of candidate reference genes
ACT：肌动蛋白基因；H2A：组蛋白基因；18S：核糖体蛋白基因；TUB：微管蛋白基因；UBI：泛素连接酶基因；EF1：延伸因子1
基因；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因；CYP：亲环蛋白基因。下同
ACT: Beta actin; H2A: Histone H2A; 18S: Ribosomal 18S; TUB: Tubulin beta; UBI: Ubiquitin; EF1: Elongation factor 1; GAPDH:
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; CYP: Cyclophilin. The same below
1226
89
10
11
30
32
34
0 50 100 150 200 250
铜浓度/(mg·kg-1)
Copper concentration
18S
CYP
Ct
值
Ct
va
lu
e
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8
配
对
变
异
系
数
P
ai
rw
is
e
va
ri
at
io
n
All samples
50 mg/kg
100 mg/kg
150 mg/kg
200 mg/kg
内参基因数目
Number of reference genes
7)个基因作为内参基因标准化因子的配对变异值，
结果见图3。以Vn/n+1为选择阀值，当Vn/n+1＜0.15时，
说明候选内参基因中有 n个适合作为 qRT-PCR的
内参基因，没必要引入第 (n+1) 个；若 Vn/n+ 1＞0.15
时，则需要添加内参基因的数目。由图 3可以看
出，全部样品或者不同铜浓度处理下的样品V2/3值
均小于0.15，表明最适内参数目为2个。
2.6 所有样品中候选内参基因表达稳定性分析
利用在线评估内参基因稳定性工具在线评估
所有样品中8个候选内参基因表达稳定性，该工具
包 含 geNorm、NormFinder 、BestKeeper 和 The
comparativeΔCt 4种常用的评估内参基因稳定性软
件，结果见图 4。如图 4所示，The comparative ΔCt
的 评 估 结 果 为 UBI=EF1=GAPDH＜CYP=H2A＜
ACT＜18S＜TUB (图 4A) ；BestKeeper的评估结果
为18S＜ACT＜UBI＜EF1＜CYP＜GAPDH＜H2A＜
TUB (图 4B)；NormFinder的评估结果为 GAPDH＜
EF1＜UBI＜H2A＜CYP＜ACT＜18S＜TUB (图4C)；
geNorm 评估结果为 EF1=GAPDH＜UBI＜CYP＜
ACT＜18S＜H2A＜TUB (图 4D)；综合 4种软件分析
结 果 为 EF1＜GAPDH＜UBI＜18S＜ACT＜CYP＜
H2A＜TUB (图 4E)。其中 The comparative ΔCt、
BestKeeper和 geNorm的分析结果一致，UBI、GAP⁃
DH和EF1是最稳定的内参基因；而BestKeeper分
析结果表明，18S、ACT和 UBI是最稳定的内参基
因；综合 4种软件分析结果表明，UBI、EF1和GAP⁃
DH是最稳定的内参基因，TUB是最不稳定的内参
基因。
2.7 不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性
分析
以不加铜处理为对照组，不同铜浓度处理为实
10
15
20
25
30
18S ACT CYP EF1 GAPDH H2A TUB UBI
Ct
值
Ct
va
lu
e
候选内参基因
Candidate reference genes
图 1 候选内参基因的表达水平
Figure 1 Expression level of candidate reference genes
20
22
24
26
28
30
0 50 100 150 200 250
铜浓度/(mg·kg-1)
Copper concentration
ACT
EF1
GAPDH
H2A
TUB
UBI
Ct
值
Ct
va
lu
e
图 2 不同铜浓度下候选内参基因表达变化
Figure 2 The expression changes of candinate reference genes under different concentrations of copper stress
图 3 geNorm软件分析最佳内参基因数目
Figure 3 Analysis of the optimal numbers of reference
genes by geNorm software
铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择
Reference Gene Selection for qRT-PCR Normalization in Black Medic Root Tissue Under Copper Stress
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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0.441 0.452
0.565
0.608
0.651
0.697
0.8600.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3 UBIEF1 GAPDH CYP H2AACT 18S TUB
0.441
D
稳定性低的基因
Least stable genes
← →稳定性高的基因
Most stable genes
M
值
M
va
lu
e
2.00 2.06 2.28
4.14 4.36 4.47
5.60
8.00
UBIEF1 GAPDH CYP H2AACT18S TUB
8
7
6
5
4
3
2
1
E
稳定性低的基因
Least stable genes
← →稳定性高的基因
Most stable genes
M
值
M
va
lu
e
0.18
0.26 0.27
0.54 0.57
0.65
0.76
1.28
UBIEF1GAPDH CYPH2A ACT 18S TUB
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
C
稳定性低的基因
Least stable genes
← →稳定性高的基因
Most stable genes
M
值
M
va
lu
e
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.34
0.48 0.57
0.59
0.73
0.89 0.97
1.65
UBI EF1 GAPDHCYP H2AACT18S TUB
B
稳定性低的基因
Least stable genes
← →稳定性高的基因
Most stable genes
M
值
M
va
lu
e
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.85M
值
M
va
lu
e
0.69 0.69 0.69
0.84 0.84
0.93
1.35
UBI EF1 GAPDH CYP H2A ACT 18S TUB
稳定性低的基因
Least stable genes
← →稳定性高的基因
Most stable genes A
图 4 在线评估所有样品中候选内参基因表达稳定性
Figure 4 The expression stability of candidate reference genes by an on-line tool in all samples
A~D：分别为The comparative ΔCt、BestKeeper、NormFinde和geNorm软件的分析结果；E：4种软件综合分析结果。M值：平
均表达稳定值
A~D: The results of comparative ΔCt, BestKeeper, NormFinde and geNorm algorithms; E: Comprehensive results of the 4 algo-
rithms. M value: Average expression stability
验组，分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基
因表达稳定性，结果见表2。由表2可以看出，当铜
浓度为50 mg/kg时，GAPDH是最稳定的内参基因，
CYP是最不稳定的内参基因；而铜浓度分别为100、
150和 200 mg/kg时，UBI是最稳定的内参基因，
TUB和CYP是最不稳定的内参基因。
3 讨论
目前，用于植物不同生长时期不同组织基因表
达分析的最佳内参基因已有大量报道 (Cassan-
Wang et al., 2012; Chaouachi et al., 2013; de Almei-
da et al., 2010; Dekkers et al., 2012; Scholtz, Visser,
2013; Serra et al., 2012)，但是，针对植物在重金属
胁迫下的持家基因稳定性评估报道尚属罕见，仅
Remnas等(2008)曾报道镉和铜胁迫下拟南芥(Ara⁃
bidopsis thaliana)中的最佳内参基因。在天蓝苜蓿
基因表达分析中，本研究对不同铜浓度胁迫下相关
内参基因的选择尚属首例。
1228
本研究中GAPDH和EF1被确定为所有样品根
组织中最稳定的内参基因，TUB为最不稳定的内参
基因。Iskandar等(2004)研究结果表明，GAPDH在
甘蔗(Saccharum officinarum)的不同组织器官中表
达最为稳定。然而，Maroufi等(2010)研究结果表
明，GAPDH在菊苣(Cichorium intybus)的叶子和根部
表达最不稳定；Jain等(2006)研究结果表明，25个水
稻(Oryza sativa)样品在不同发育时期和组织器官中
EF1稳定性最好，而黄雪玲等(2012)等研究结果表
明，在小麦(Triticum aestivum)条锈菌中EF1最不稳
定；蒋晓梅等(2014)研究结果表明，冷胁迫下 TUB
在柳枝稷(Panicum virgatum)根组织中最稳定，而
Reid(2006)等研究结果表明，TUB在马铃薯(Sola⁃
num tuberosum)中表达最不稳定。因此，没有一个
内参基因能在所有植物中稳定表达，应根据不同植
物种类进行内参基因的筛选。
现今大多数内参基因表达稳定性的评估均结
合或选用 geNorm和NormFinder软件中的一种(黄
雪玲等, 2012;魏毅东等, 2013;刘金泊等, 2014)，而
内参基因稳定性在线评估工具(Xie et al., 2012)不
仅给出 geNorm、NormFinder 、BestKeeper 和 The
comparative ΔCt的分析结果，而且通过计算候选内
参基因在4个软件中排名的几何平均数，给出综合
排名。本研究结合geNorm软件确定的最佳内参数
目，在所有样品中BestKeeper软件分析得出 18S和
ACT是最稳定的内参基因，而 geNorm、NormFinder
和 The comparative ΔCt的分析结果表明UBI、EF1
和 GAPDH是稳定的内参基因，与BestKeeper分析
结果不一致。因此，为了避免使用单个或者两个软
件分析产生的偏差，很有必要将4种软件的分析结
果综合，得出更为合理、全面的结果。
当铜浓度为50 mg/kg时，最稳定的内参基因为
GAPDH和 TUB；而铜浓度为 100、150和 200 mg/kg
时，UBI、GAPDH和EF1为最稳定的内参基因，TUB
却为最不稳定的内参基因，因此选择稳定的内参基
因时，需根据处理浓度的不同，合理选择最适内参
基因。TUB是细胞骨架中重要的组成蛋白，其稳定
表达是维持细胞结构的重要保证，因而TUB常作内
参基因用于基因表达的分析研究 (Nicot et al.,
2005; Czechowski et al., 2005)。已证实 TUB与钙
离子浓度密切相关(Serrano et al., 1986)，而钙峰形
成是豆科植物与根瘤菌共生信号通路的一个重要
标志。在所有样品中，4个软件的分析结果都表明
TUB是最不稳定的内参基因，推测可能由于铜对共
生体系的影响而导致TUB表达不稳定，因此在研究
植物共生结瘤相关基因时最好避免使用TUB作为
内参基因。
从各候选内参基因的表达量可以看出，18S的
Ct值最小，说明表达量最高。结合 18S表达稳定
性，发现其稳定性却低于UBI、EF1和GAPDH，并不
是很稳定的内参基因，表明基因表达稳定性与其表
达丰度之间并没有必然联系。
4 结论
本研究经在线评估内参基因稳定性工具和ge-
Norm软件分析得出，在所有样品中对天蓝苜蓿与
根瘤菌共生互作过程中差异基因表达分析时最适
内参基因组合为GAPDH和EF1；分别对不同铜浓
度处理下候选内参基因稳定性评估，表明在低浓
度 (≤50 mg/kg)时最佳内参基因为GAPDH，中高浓
度 (≥100 mg/kg)时为UBI。本研究为铜胁迫下天
蓝苜蓿与根瘤菌共生互作过程中相关基因的差异
表达分析提供基础资料，同时也为其他重金属胁迫
下内参基因的选择提供参考和借鉴。
铜胁迫浓度/(mg·kg-1)
Copper stress concentration
50
100
150
200
综合排名
Overall ranking
GAPDH(1.19)＞TUB(2.06)＞EF1(2.06)＞UBI(4.43)＞18S(5.20)＞ACT(5.96)＞H2A(6.09)＞CYP(8.00)
UBI(1.86)＞EF1(2.06)＞18S(2.38)＞GAPDH(3.60)＞ACT(3.98)＞H2A(5.00)＞CYP(6.48)＞TUB(8.00)
UBI(1.19)＞GAPDH(1.86)＞EF1(2.28)＞18S(4.00)＞H2A(5.00)＞TUB(6.00)＞ACT(7.24)＞ACT(7.74)
UBI(1.57)＞EF1(2.21)＞GAPDH(2.71)＞ACT(3.50)＞CYP(4.23)＞18S(4.74)＞H2A(6.44)＞TUB(8.00)
表 2 不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性综合排名
Table 2 The expression stability rank of candinate reference genes under different concentrations of copper stress
括号中数据表示内参基因表达稳定值(M值)
The data in brackets show expression stability(M value) of candinate reference genes
铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择
Reference Gene Selection for qRT-PCR Normalization in Black Medic Root Tissue Under Copper Stress
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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
参考文献
黄雪玲,冯浩,康振生. 2012.小麦条锈菌实时荧光定量PCR
分析中内参因的选择[J]. 农业生物技术学报, 20(2):
181- 187. (Huang X L, Feng H, Kang Z S. 2012.
Seletion of reference genes for quantitative Real- time
PCR normalization in Puccinia Striiformis f.sp. tritici[J].
Journal of Agricultural Biotechnology, 20(2): 181-187.)
蒋晓梅,张新全,严海东,等. 2014.柳枝稷根组织实时定量
PCR分析中内参基因的选择[J]. 农业生物技术学报,
22(1): 55-63. (Jiang X M, Zhang X Q, Yan H D, et al.
2014. Reference gene selection for Real- time
quantitative PCR normalization in switchgrass(Panicum
virgatum L.) root tissue[J]. Journal of Agricultural
Biotechnology, 22(1): 55-63.)
刘金泊,欧静,姚富姣,等. 2014.磷化氢诱导下赤拟谷盗实
时定量 PCR内参基因的筛选[J].农业生物技术学报,
22(2): 257- 264. (Liu J B, Ou J, Yao F J, et al. 2014.
Identification of appropriate reference genes for gene
expression studies by quantitative Real- time PCR in
Tribolium castaneum after exposure to phosphine[J].
Journal of Agricultural Biotechnology, 22(2): 257-264.)
聂湘平,蓝崇钰,张志权,等. 2002.铜对大叶相思-根瘤菌共
生固氮体系的影响[J].应用生态学报, 13(2): 137-140.
(Nie X P, Lan C Y, Zhang Z Q, et al. 2002. Effects of
copper on rhizobia- Acacia auriculaeformis symbiotic
association[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 13
(2): 137-140.)
魏毅东,陈玉,郭海萍,等. 2013.水稻缺素胁迫下实时荧光
定量RT-PCR的内参基因的选择[J].农业生物技术学
报, 21(11): 1302-1312. (Wei Y D, Chen Y, Guo H P, et
al. 2013. Selection of reference genes for Real- time
quantitative RT-PCR in rice(Oryza sativa L.ssp. japonica)
under nutrient deficiency[J]. Journal of Agricultural
Biotechnology, 21(11): 1302-1312.)
Andersen C L, Jensen J L, Ørntoft T F. 2004. Normalization
of Real- time quantitative reverse transcription- PCR
data: A model- based variance estimation approach to
identify genes suited for normalization, applied to
bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research,
64(15): 5245-5250.
Cassan-Wang H, Soler M, Yu H, et al. 2012. Reference genes
for high- throughput quantitative reverse transcription-
PCR analysis of gene expression in organs and tissues
of eucalyptus grown in various environmental conditions
[J]. Plant and Cell Physiology, 53(12): 2101-2116.
Chaouachi M, Alaya A, Ali I B, et al. 2013. Development of
Real- time PCR method for the detection and the
quantification of a new endogenous reference gene in
sugar beet (Beta vulgaris L.): GMO application[J]. Plant
Cell Reports, 32(1): 117-128.
Czechowski T, Stitt M, Altmann T, et al. 2005. Genome-wide
identification and testing of superior reference genes for
transcript normalization in Arabidopsis[J]. Plant
Physiology, 139(1): 5-17.
de Almeida M R, Ruedell C M, Ricachenevsky F K, et al.
2010. Reference gene selection for quantitative reverse
transcription- polymerase chain reaction normalization
during in vitro adventitious rooting in Eucalyptus
globulus Labill[J]. BMC Molecular Biology, 11: 73.
Dekkers B J, Willems L, Bassel G W, et al. 2012.
Identification of reference genes for RT- qPCR
expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds[J].
Plant Cell Physiology, 53(1): 28-37.
Gutierrez L, Mauriat M, Pelloux J, et al. 2008. Towards a
systematic validation of references in Real-time RT-PCR
[J]. The Plant Cell, 20(7): 1734-1735.
Infante C, Matsuoka M P, Asensio E, et al. 2008. Selection of
housekeeping genes for gene expression studies inlarvae
from flatfish using Real- time PCR[J]. BMC Molecular
Biology, 9: 28.
Iskandar H M, Simpson R S, Casu R E, et al. 2004,
Comparison of reference genes for quantitative Real-
time polymerase chain reaction analysis of gene
expression in sugarcane[J]. Plant Molecular Biology
Reporter, 22(4): 325-337.
Jain M, Nijhawan A, Tyagi A K, et al. 2006. Validation of
housekeeping genes as internal control for studying
gene expression in rice by quantitative Real- time PCR
[J]. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 345(2): 646-651.
Maroufi A, van Bockstaele E, De Loose M. 2010. Validation
of reference genes for gene expression analysis in
chicory(Cichorium intybus) using quantitative Real- time
PCR[J]. BMC Molecular Biology, 11: 15.
Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al. 2005.
Housekeeping gene selection for Real- time RT- PCR
normalization in potato during biotic and abiotic stress
[J]. Journal of Experimental Botany, 56(421): 2907-
2914.
Pfaffl M W, Tichopad A, Prgomet C, et al. 2004.
Determination of stable housekeeping genes,
differentially regulated target genes and sample
integrity: BestKeeper- Excel- based tool using pair- wise
1230
correlations[J]. Biotechnology Letters, 26(6): 509-515.
Pombo- Suarez M, Calaza M, Gomez- Reino J J, et al. 2008.
Reference genes for normalization of gene expression
studies in human osteoarthritic articular cartilage[J].
BMC Molecular Biology, 9: 17.
Radonic A, Thulke S, Mackay I M, et al. 2004. Guideline to
reference gene selection for quantitative Real-time PCR
[J]. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 313(4): 856-862.
Remans T, Smeets K, Opdenakker K, et al. 2008.
Normalisation of Real- time RT- PCR gene expression
measurements in Arabidopsis thaliana exposed to
increased metal concentrations[J].Planta, 227(6): 1343-
1349.
Reid K E, Olsson N, Schlosser J, et al. 2006. An optimized
grapevine RNA isolation procedure and statistical
determination of reference genes for Real-time RT-PCR
during berry development[J]. BMC Plant Biology, 6:
27.
Schmittgen T D, Zakrajsek B A. 2000. Effect of experimental
treatment on housekeeping gene expression: Validation
by Real- time, quantitative RT- PCR[J]. Journal of
Biochemical and Biophysical Methods, 46: 69-81.
Scholtz J J, Visser B. 2013. Reference gene selection for
qPCR gene expression analysis of rust- infected wheat
[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 81:
22-25.
Sellars M J, Vuocolo T, Leeton L A, et al. 2007. Real-time RT-
PCR quantification of Kuruma shrimp transcripts: A
comparison of relative and absolute quantification
procedures[J]. Journal of Biotechnology, 129(3): 391-
399.
Serra I A, Lauritano C, Dattolo E, et al. 2012. Reference
genes assessment for the seagrass Posidonia oceanica in
different salinity, pH and light conditions[J]. Marine
Biology, 159(6): 1269-1282.
Serrano L, Valencia A, Caballero R, et al. 1986. Localization
of the high affinity calcium- binding site on tubulin
molecule[J]. Journal of Biological Chemistry, 261(15):
7076-7081.
Silver N, Best S, Jiang J, et al. 2006. Selection of
housekeeping genes for gene expression studies in
human reticulocytes using Real- time PCR[J]. BMC
Molecular Biology, 7: 33.
Spinsanti G, Panti C, Lazzeri E, et al. 2006. Selection of
reference genes for quantitative RT- PCR studies in
striped dolphin(Stenella coeruleoalba)skin biopsies[J].
BMC Molecular Biology, 7: 32.
Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, et al. 1999. Housekeeping
genes as internal standards: Use and limits[J]. Journal of
Biotechnology, 75(2-3): 291-295.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. 2002. Accurate
normalization of Real-time quantitative RT-PCR data by
eometric averaging of multiple internal control genes[J].
Genome Biology, 3(7): research0034.1-0034.11.
Xie F, Xiao P, Chen D, et al. 2012. miRDeepFinder: A
miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small
RNAs[J]. Plant Molecular Biology, 80(1): 75-84.
Yan H Z, Liou R F. 2006. Selection of internal control genes
for Real- time quantitative RT- PCR assays in the
oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica[J].
Fungal Genetics and Biology, 43(6): 430-438.
(责任编辑 靳晓霞)
铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择
Reference Gene Selection for qRT-PCR Normalization in Black Medic Root Tissue Under Copper Stress
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