全 文 ：第３８卷第２期
２０１５年３月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２ ０ １ ５
文章编号：１０００－１５７３（２０１５）０２－００１９－０６ ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１５．００２８
干旱－溃疡病菌胁迫下北京杨水通道蛋白基因
表达特征分析
刘文鑫１，２， 马长明１， 赵嘉平２， 万贤崇２
（１．河北农业大学 林学院，河北 保定 ０７１００１；２．中国林业科学研究院 林业新技术研究所／林木遗传育种国家
重点开放试验室，北京 １０００９１）
摘要：为揭示杨树溃疡病发生进程中的水分生理学机制，本研究以１年生北京杨为材料，对干旱－溃疡病菌胁迫
下的杨树管家基因表达稳定性、与植物水分运输密切相关的杨树水通道蛋白基因家族的表达特征进行了实时
定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）分析。结果表明：１２个管家基因的表达稳定性不同，ＴＵＢ、ＵＢＱ、ＥＩＦ４β－Ｌ、ＣＹＰ、ＥＦ１α２
表达稳定性最高，ＡＣＴ２和ＡＣＴ１１稳定性最差；配对分析显示ＴＵＢ、ＥＩＦ４β－Ｌ和ＵＢＱ 为干旱胁迫－溃疡病菌胁
迫下基因表达检测的最优内参基因组合；干旱及溃疡病菌胁迫下，水通道蛋白基因的表达模式并不相同，说明
这两种胁迫对杨树水分代谢具有不同的影响；干旱－溃疡病菌双重作用下，ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ１；５、ＰＩＰ２；４、
ＰＩＰ２；７等５个基因的表达显著高于干旱、溃疡病菌两种胁迫的单独作用，揭示这两种环境胁迫对水通道蛋白
基因表达具有一定的协同作用。
关 键 词：北京杨；干旱胁迫；溃疡病菌；内参基因；ＲＴ－ｑＰＣＲ；水通道蛋白基因
中图分类号：Ｓ７９２．１１ 文献标志码：Ａ
收稿日期：２０１４－１０－２０
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（ＣＡＦＩＮＴ２０１３Ｃ１５）资助．
作者简介：刘文鑫（１９９０－），女，吉林省通化人，在读硕士生，研究方向为森林培育．Ｅ－ｍａｉｌ：１０３１５４６６５８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：马长明（１９８０－），男，河北省邯郸人，博士，副教授，主要研究方向为森林培育．Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｃｈａｎｇｍｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
赵嘉平（１９７０－），男，陕西省富平人，博士，副研究员，从事植物病理生理学研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｊｉａｐｉｎｇ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｇｅｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ－Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｄｏｔｈｉｄｅａｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ
ＬＩＵ Ｗｅｎ－ｘｉｎ１，２，ＭＡ Ｃｈａｎｇ－ｍｉｎｇ１，ＺＨＡＯ Ｊｉａ－ｐｉｎｇ２，ＷＡＮ Ｘｉａｎ－ｃｈｏｎｇ２
（１．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｅｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ；
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ
Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２ｐｏｐｌａｒ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ
９ｐｏｐｌａｒ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＩＰ）ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａ－
ｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）ｉｎ ｏｎｅ－ｙｅａｒ－ｏｌｄ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂｅｉ－
ｊｉｎｇｅｎｓｉｓ ｃｕｔｔｉｎｇｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＴＵＢ，ＵＢＱ，ＥＩＦ４β－Ｌ，ＣＹＰａｎｄ ＥＦ１α２ｗｅｒｅ ｔｈｅ
ｔｏｐ ５ｓｔａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ （ｏｒ）ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｗｈｉｌｅ ＡＣＴ２ａｎｄ
ＡＣＴ１１ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ．Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ
ｔｈａｔ ＴＵＢ，ＥＩＦ４β－Ｌａｎｄ ＵＢＱ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｐｏｐｌａｒ ＰＩＰｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｆｕｎｇａｌ
河 北 农 业 大 学 学 报 第３８卷
ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｍｐｌｉｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗａ－
ｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅ ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ５ ＰＩＰｇｅｎｅｓ（ＰＩＰ１；１，ＰＩＰ１；３，ＰＩＰ１；５，ＰＩＰ２；４，ＰＩＰ２；７）ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ－ｐａｔｈｏ－
ｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｗｈｉｃｈ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ ｏｒ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｏｍｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｐｌａｒ；ｄｒｏｕｇｈｔ；ｃａｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ；ＲＴ－ｑＰＣＲ；ａｑｕａｐｏｒｉｎ
水通道蛋白（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ）广泛分布于动物、植物
和微生物不同组织亚细胞器结构，属 ＭＩＰ（Ｍａｊｏｒ
ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白家族，其主要生物学功能是参
与水分及其他小分子物质的跨膜运输［１］，以及植物
木质部导管栓塞修复［２－３］。因此，水通道蛋白基因在
跨膜运输及长距离运输两个方面参与植物水分代
谢，对植物水分生理学研究具有极其重要的意义。
杨树溃疡病是普遍发生于我国各杨树适生区的
主要病害。早期研究表明，杨树溃疡病的自然发病
强度与降雨量、相对湿度、树皮相对膨胀度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｔｕｒｇｉｄｉｔｙ，ＲＴ％）、树皮含水量呈负相关［４－６］，干旱胁
迫加重了杨树溃疡病病情发展［６］。另外，在杨树溃
疡病发生进程中，枝干部水泡型症状、植株枯萎或顶
梢枯死等水分代谢紊乱性状相继出现，因此，研究者
推测杨树溃疡病的发生与杨树体内的水分运输障碍
存在必然联系。因此，本研究以１年生北京杨植株
为材料，构建干旱及溃疡病菌胁迫下杨树基因表达
检测体系，并对９个杨树水通道蛋白基因的表达特
征，进行分析，以期初步揭示溃疡病菌胁迫下杨树的
水分运输特征。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本研究以１年生北京杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ
Ｗ．Ｙ．Ｈｓｕ）为材料，植株高度０．９～１．０ｍ，基部直
径５～７ｍｍ。溃疡病菌为葡萄座腔菌（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａ－
ｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ Ｓａｃｃ．）ＣＺ０６０菌株（保存于中国林业
科学研究院林业新技术研究所），以２％ＰＤ（２０％马
铃薯，２％葡萄糖）培养基，在２５℃下避光震荡培养
（１２０ｒ／ｍｉｎ）２１ｄ，培养液过滤后作为粗毒素处理北
京杨植株。
１．２ 方法
本研究采用称重法控制土壤体积含水量，同时
结合叶片气孔导度测定控制植物水分。试验期间，
水分正常植株气孔导度为２００～３００ｍｏｌ／（ｍ２·ｓ），
土壤体积含水量为３５％～４０％ ；干旱处理植株气孔
导度小于１００ｍｏｌ／（ｍ２·ｓ），土壤体积含水量５％～
１０％。用Ｌｅａｆ Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ ＳＣ－１气孔导度仪测定植株
顶部的第４或５片叶片的气孔导度，每日测定１次；
用Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＭＰ－１６０土壤水分测定仪测定土壤体积
含水量，每日测定１次，测定时间为上午１０：００—
１１：００。
在北京杨枝干距基部１０，１５ｃｍ 处，以直径
４ｍｍ打孔器在树皮上打孔，去除树皮，每个枝条打
孔２个，深度至露出木质部。用灭菌脱脂棉包裹打
孔处，Ｐａｒａｆｉｌｍ膜密封底部形成接种室，每１２ｈ接
种５００μＬ粗毒素（或无菌水）共４次。
同时，分别对北京杨进行干旱（ＤＮ）、溃疡病菌
（ＮＩ）及干旱－溃疡病菌（ＤＩ）处理，每种处理北京杨５
株，以非干旱－未接种植株（ＮＮ）作为对照。接种处理
后４８，９６ｈ，取北京杨枝干接种孔上部３０ｃｍ长度树
皮，液氮处理后，置于－８０℃冰箱保存备用。
１．３ ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成、ＲＴ－ｑＰＣＲ反应
采用Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ提取北京杨韧
皮 部 薄 壁 组 织 总 ＲＮＡ。 以 Ｐｒｏｍｅｇａ Ｓｕｐｅｒ－
ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ⅲ第一链合成试剂盒反转录合成ｃＤＮＡ
第一链。ｃＤＮＡ溶液稀释２０倍用于 ＲＴ－ｑＰＣＲ分
析。ＲＴ－ｑＰＣＲ反应采用ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
ＴａｑＴＭ试剂盒，ｃＤＮＡ模板１．０μＬ，每个样品重复４
次。ＡＢＩ ７５００荧光定量ＰＣＲ仪上进行两步法ＰＣＲ
扩增程序：９５℃预变性３０ｓ，然后９５℃变性５ｓ，６０℃
延伸３４ｓ，循环４０次。
１．４ 干旱－溃疡病菌胁迫下，北京杨管家基因表达
稳定性分析及基因表达内参基因的选择
根据不同处理下实时定量反应的定量循环值
（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｖａｌｕｅｓ，Ｃｑ），采用 ＢｅｓｔＫｅｅｐ－
ｅｒ、Ｄｅｌｔａ ＣＴ、ｇｅＮｏｒｍ、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ以及在线分析
工具 ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｏｎｘｉｅ．ｃｏｍ／ｒｅｆｅｒ－
ｅｎｃｅｇｅｎｅ．ｐｈｐ）对１２个管家基因（ＵＢＯ－Ｌ、ＥＦ１β、
ＣＹＰ、ＴＵＢ、αＴＵＢ、ＡＣＴ２、ＵＢＱ、ＥＩＦ４β－Ｌ、ＥＦ１α２、
ＥＦ１α３、ＡＣＴ１、ＡＣＴ１１、ＵＢＱ－Ｌ）表达稳定性特征进
行评价，并确定该实验体系下的最适内参基因（或内
参基因组合）。
１．５ 水通道蛋白基因的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析
ＲＴ－ｑＰＣＲ反应体系及反应条件见１．３，基因相
０２
第１期 刘文鑫等：干旱－溃疡病菌胁迫下北京杨水通道蛋白基因表达特征分析
对表达强度计算采用２－△△ＣＴ方法，根据１．４分析结
果确定内参基因。
２ 结果与分析
２．１ 干旱－溃疡病菌双重胁迫下北京杨管家基因的
表达稳定性分析
２．１．１ Ｃｑ ｖａｌｕｅ的可变性分析结果 ＲＴ－ｑＰＣＲ反
应的结果表明（图１），１２个管家基因的Ｃｑ值介于
２２．６５至３２．２２之间，其中ＡＣＴ１的Ｃｑ值最高（平
均值３０．６７，中值３０．８４），而ＵＢＱ 的Ｃｑ值最低（平
均值２４．１５，中值２４．２５）。说明在本研究中，ＵＢＱ
表达水平最高，而ＡＣＴ１则反之。
注：用Ｅｘｃｅｌ计算Ｃｑ值的四分位数。上竖线和下竖线代表Ｃｑ
值的最大值和最小值，箱的上边缘和下边缘代表第一四分位数和第
三四分位数，箱内线代表中位数。
图１ 不同处理下的北京杨树皮中１２个候选内参基因
Ｃｑ值的可变性分析
Ｆｉｇ．１ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ １２ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｂａｒｋ ｏｆ ｐｏｐｌａｒ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
ＡＣＴ２的Ｃｑ值在不同样品之间的变异最大，而
ＥＦＩ４β－Ｌ的Ｃｑ值波动最小，因此ＥＩＦ４β－Ｌ 是表达
最稳定的基因，而ＡＣＴ２则是表达稳定性最差的管
家基因（图１）。
２．１．２ 北京杨管家基因的表达稳定性分析 应用
ｇｅＮｏｒｍ软件对１２个北京杨管家基因的表达稳定
性进行排序：ＴＵＢ＝ＵＢＱ ＞ ＥＩＦ４β－Ｌ ＞ＣＹＰ ＞
ＥＦ１α２＞ＵＢＱ－Ｌ ＞αＴＵＢ ＞ＥＦ１α３＞ＥＦ１β＞
ＡＣＴ１＞ＡＣＴ１１＞ＡＣＴ２。其中ＵＢＱ 和ＴＵＢ 稳
定性值（Ａｖｅｒａｇｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｍ）为０．５５２，
是最为稳定表达的管家基因，而ＡＣＴ－２基因表达稳
定性最差，其 Ｍ 值为１．２２４（表１）。ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ、
ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ、以及Ｄｅｌｔａ ＣＴ的分析结果与ｇｅＮｏｒｍ
并不完全相同。Ｄｅｌｔａ ＣＴ、Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ和 Ｇｅｎｏｒｍ
分析显示ＴＵＢ表达稳定性最高，而ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ分
析显示ＡＣＴ１是稳定性最高的基因。然而，以上４
个软件分析均显示ＡＣＴ１１、ＡＣＴ２具有最低的表达
稳定性。应用ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ对管家基因表达稳定性综
合分析，ＴＵＢ、ＵＢＱ、ＥＩＦ４β－Ｌ、ＣＹＰ、ＥＦ１α２是表达
稳定性最高的５个管家基因，均可以应用于干旱－溃
疡病菌胁迫下杨树基因表达的定量分析（表１）。
表１ 干旱－溃疡病菌胁迫下北京杨管家基因的表达稳定性分析
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｏｐｌａｒ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ－Ｂ．ｄｏｔｈｉｄｅａｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
基因名称
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ
ｇｅＮｏｒｍ
排名
Ｒａｎｋ
稳定值
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｖａｌｕｅ
Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ
排名
Ｒａｎｋ
稳定值
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｖａｌｕｅ
ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
排名
Ｒａｎｋ
稳定值
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｖａｌｕｅ
Ｄｅｌｔａ ＣＴ
排名
Ｒａｎｋ
稳定值
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｖａｌｕｅ
ＲｅｆＦｉｎｄｅｒ
排名
Ｒａｎｋ
综合排名
Ｆｉｎａｌ ｒａｎｋ
ＴＵＢ １ ０．５５２ １ ０．３２５ ５ ３．２６±０．８６ １ ０．９４ １．５０ １
ＵＢＱ １ ０．５５２ ６ ０．６４２ ９ ４．０８±１．００ ５ １．０５ ３．８１ ３
ＥＩＦ４β－Ｌ ３ ０．５７９ ５ ０．６４０ ３ ３．１２±０．８６ ３ １．０４ ３．６６ ２
ＣＹＰ ４ ０．５９１ ８ ０．８７５ ４ ３．１３±０．７７ ７ １．１７ ３．８７ ４
ＥＦ１α２ ５ ０．６２０ ４ ０．６０４ ６ ３．７２±１．０６ ２ １．０３ ４．３６ ５
ＵＢＱ－Ｌ ６ ０．７０４ ３ ０．５８３ ７ ３．８０±０．９４ ６ １．０７ ５．０５ ７
αＴＵＢ ７ ０．７６８ ２ ０．４９２ ８ ３．８９±１．０５ ４ １．０４ ４．６０ ６
ＥＦ１α３ ８ ０．８２９ ７ ０．８５５ １０ ４．９５±１．２７ ８ １．２２ ８．１８ １０
ＥＦ１β ９ ０．９４６ １１ １．２１５ ２ ２．７４±０．８３ １１ １．４８ ６．８３ ８
ＡＣＴ１ １０ １．０２８ ９ １．１２４ １ ２．６９±０．８３ ９ １．４３ ７．０２ ９
ＡＣＴ１１ １１ １．１１３ １０ １．１８５ １１ ５．４７±１．５４ １０ １．４５ １０．４９ １１
ＡＣＴ２ １２ １．２２４ １２ １．６２１ １２ ６．２６±１．７２ １２ １．７８ １２．００ １２
２．１．３ 荧光实时定量ＰＣＲ实验中最适内参基因数
目分析 本研究通过ｇｅＮｏｒｍ软件对管家基因的配
对差异性（Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）进行分析以确定基因
表达定量检测所需的最佳内参基因数目。研究结果
显示：除Ｖ２／３＝０．１７５外，其他的配对差异值均小于
０．１５。在ｇｅＮｏｒｍ中，Ｖｎ／ｎ＋１＝０．１５被用来作为确
定内参基因最适数目的阈值，因此，本研究最适内参
基因数目为３。基于１２个管家基因表达稳定分析
１２
河 北 农 业 大 学 学 报 第３８卷
的结果，确定ＴＵＢ、ＵＢＱ 和ＥＩＦ４β－Ｌ 为干旱－溃疡
病菌双重胁迫下北京杨基因表达检测的最适内参基
因组合。
图３ 北京杨１２个候选内参基因的配对差异性分析
Ｆｉｇ．３ Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ １２ｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ
２．１．４ 韧皮部薄壁细胞质膜内在蛋白基因表达量
分析 本研究对干旱－溃疡病菌胁迫下，９个杨树
水 通 道 蛋 白 基 因 （ＰＩＰ１：１、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ１；
５、ＰＩＰ２；１、ＰＩＰ２；２、ＰＩＰ２；３、ＰＩＰ２；２、ＰＩＰ４；
７、ＰＩＰ２；８）的表达特征进行了ＲＴ－ｑＰＣＲ分析，以
ＴＵＢ、ＥＩＦ４β－Ｌ和ＵＢＱ 基因作为内参基因。
研究结果显示，干旱－溃疡病菌互作下水通道蛋
白基因呈现出复杂的表达特征见图４。１）水通道蛋
白基因对溃疡病菌、干旱胁迫及干旱－溃疡病菌双重
胁迫的响应机制并不相同：在处理后４８ｈ，溃疡病菌
诱导ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ２；１、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ２；３ 基因的
表达，抑制ＰＩＰ２；２、ＰＩＰ２；４、ＰＩＰ２；７、ＰＩＰ２；８基
因的表达，ＰＩＰ１；５基因表达与对照无显著差异，并
且其中ＰＩＰ２；３ 基因表达强度是对照的７．８０倍。
然而，干旱、干旱－溃疡病菌诱导除ＰＩＰ２；８之外的
８个水通道蛋白基因的上调表达。２）干旱－溃疡病
菌双重作用下，ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ１；５、ＰＩＰ２；
４、ＰＩＰ２；７等５个基因的表达显著高于干旱、溃疡
病菌两种胁迫的单独作用，显示这两种胁迫对水通
道蛋白基因表达具有一定的协同作用。例如，溃疡
病菌胁迫、干旱胁迫下，ＰＩＰ１；１基因的表达分别是
对照的２．７４倍、３．３３倍，而干旱－溃疡病菌胁迫下的
基因表达是对照的５．０９倍。３）处理后９６ｈ水通道
蛋白基因的表达特征与处理后４８ｈ显著不同。从
图４可以看出，３种胁迫处理下，水通道蛋白各基因
的表达相比较于处理后４８ｈ变化幅度显著减少。
除ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ２；３外，溃疡病菌胁迫并
不能诱导水通道蛋白基因的差异表达，对于这３个
基因，虽然相比对照处理上调，但是其表达强度仅仅
为对照的２．００倍。在以上９个水通道蛋白基因中，
干旱和（或）溃疡病菌胁迫诱导ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ１；３、
ＰＩＰ１；５、ＰＩＰ２；１、ＰＩＰ２；３，而ＰＩＰ２；２ 基因在各
种不同胁迫处理中均相对稳定表达。
注：水分正常－无溃疡病菌处理ＮＮ，干旱－无溃疡病菌处理ＤＮ、水分正常－溃疡病菌处理ＮＩ、及干旱－溃疡病菌处理ＤＩ。
图４ 干旱和溃疡病菌处理下韧皮部细胞内在水通道蛋白基因表达特征
Ｆｉｇ．４ Ｎｉｎｅ ＰＩＰｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｐｏｐｌａｒ ｂａｒｋ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ－Ｂ．ｄｏｔｈｉｄｅａｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
３ 结论与讨论
采用合适的内参基因对基因表达数据进行标准
化处理是基因实时定量分析的首要工作。研究者对
不同实验体系下的杨树管家基因表达稳定性进行了
系统的分析：ＵＢＱ 和ＴＵＡ 是杂交杨花序和营养芽
２２
第１期 刘文鑫等：干旱－溃疡病菌胁迫下北京杨水通道蛋白基因表达特征分析
中最为稳定表达的管家基因，而ＣＹＰ 和ＥＩＦ４β－Ｌ
稳定性最差［７］；ＥＦ１α和１８Ｓ ＲＮＡ 是杨树扦插植
株根系中表达最为稳定的基因［８］，另外，ＥＦ１α也是
铬胁迫下杨树叶片的最适内参基因［９］。本研究对干
旱－溃疡病菌双重胁迫下，北京杨管家基因的表达稳
定性进行了检测，确定ＴＵＢ、ＥＩＦ４β－Ｌ和ＵＢＱ 可以
作为干旱－溃疡病菌双重胁迫下北京杨基因表达数
据标准化的最适内参基因组合。再一次揭示植物生
理状态或环境胁迫影响管家基因表达的稳定性［７－９］，
因此，对于杨树或者其他植物的基因表达分析来说，
通过管家基因表达稳定性分析筛选最适内参基因（或
内参基因组合）是获得准确实验结果的最佳策略。
２０世纪９０年代初，通过对植物质膜水通道的
研究，揭示了水通道蛋白在植物水分跨膜运输中具
有决定性作用，近年来的研究进一步证实水通道蛋
白参与导管栓塞修复过程［２］，也有研究显示水通道
蛋白与植物逆境胁迫调控有关，特定水通道蛋白基
因的上调表达或者超表达有助于植物抗逆境（耐盐、
耐寒）能力的提高［１０－１２］。水通道蛋白基因ＰＩＰ１；１
和ＰＩＰ１；３的上调表达有助于杨树木质部栓塞修复
的完成［３］，干旱胁迫诱导银腺杨８４Ｋ（Ｐｏｐｌｕｓ ａｌｂａ
×Ｐｏｐｌｕｓ ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）苗木上部、中部和基部７个
（ＰＩＰ１；１、ＰＩＰ１；２、ＰＩＰ１；３、ＰＩＰ１；５、ＰＩＰ２；１、
ＰＩＰ２；３、ＰＩＰ２；４）水通道蛋白基因上调表达［１３］；另
一方面，高盐、干旱、磷素缺乏等环境胁迫抑制多数
水通道蛋白基因转录水平、蛋白质水平上的表达，造
成水通道蛋白通道活性下降甚至消失［１４－１６］。本项研
究揭示干旱、干旱－溃疡病菌双重胁迫处理不同阶段
ＰＩＰ基因表达具有不同特征，处理早期（４８ｈ）ＰＩＰ
基因上调表达，而在处理后期（９６ｈ）ＰＩＰ基因表达
下降，甚至受到抑制。
病理学研究发现，线虫以及菟丝子可以诱导植
物水通道蛋白基因的特异表达［１７－１８］。然而，植物真
菌性病害发生与水通道蛋白基因表达特征变化尚未
见报道。本研究首次揭示了干旱－溃疡病菌胁迫下，
北京杨水通道蛋白基因的响应表达特征。首先，与
干旱诱导多数ＰＩＰ基因表达不同，溃疡病菌胁迫在
诱导部分基因表达的同时显著抑制其他基因的表
达。其次，干旱－溃疡病菌比干旱及溃疡病菌对水通
道蛋白基因表达具有更为强烈诱导作用，即干旱与
溃疡病菌胁迫的具有一定的协同效应，这有可能是
干旱胁迫加重杨树溃疡病发生发展的分子基础。总
之，本研究首次揭示了杨树溃疡病发生与水通道蛋
白基因特异性表达之间的相关性，然而，杨树溃疡病
发生的水分生理机制的解析则有待于对杨树水力学
特征、栓塞形成及修复机制、水通道蛋白基因表达特
征等水分运输相关的生理学问题的详尽分析。
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河 北 农 业 大 学 学 报 第３８卷
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（编辑：梁 虹
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（编辑：梁 虹）
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