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沙田柚花柱蛋白对其花粉萌发及生长的影响



全 文 :·生物技术· 北方园艺2014(03):88~91
第一作者简介:覃屏生(1976-),男,广西环江人,硕士,讲师,现主
要从事植物分子生物学等研究工作。E-mail:qps@mailbox.gxnu.
edu.cn.
责任作者:秦新民(1956-),男,广西灵川人,教授,现主要从事植物
分子生物学等研究工作。E-mail:xmqin@mailbox.gxnu.edu.cn.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31360477);广西科技厅科
研资助项目(2013YB036)。
收稿日期:2013-10-30
沙田柚花柱蛋白对其花粉萌发及生长的影响
覃 屏 生,张   瑜,侯 丽 霞,杨 孝 文,秦 新 民
(广西师范大学 生命科学学院,广西 桂林541004)
  摘 要:以沙田柚花粉为试材,研究比较了自交和异交花柱提取蛋白对花粉萌发和花粉管生
长的影响。结果表明:添加沙田柚自交、异交花柱蛋白后,花粉的萌发未受影响。但花粉管的生
长情况在二者之间有明显差异,添加异交花柱蛋白对花粉管的生长没有影响,而添加自交花柱蛋
白的花粉管的生长受到明显抑制。PAGE电泳显示自交花柱蛋白处理的花粉管出现了1条特异
蛋白带(Rf值=0.81);SDS-PAGE电泳检测到自交花柱蛋白处理的花粉管出现了相对分子量为
35.0kD和37.5kD的2条特异蛋白带;IEF-PAGE电泳的结果表明,在自交花柱蛋白处理的花粉
管蛋白中出现了等电点为5.85和6.20的2条的特异蛋白谱带。
关键词:沙田柚;花粉萌发;花粉管长度;花柱蛋白;电泳
中图分类号:S 666.3 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)03-0088-04
  沙田柚(Citrus grandis var.shatinyu Hort.)原产于
广西容县沙田乡,因其口感好、营养丰富而深受广大消
费者欢迎,是南方果树中较重要的树种之一,在我国广
东省、广西省的栽培面积较大。然而在生产中,沙田柚
存在着严重的自交不亲和现象,在自然授粉情况下坐果
率极低,产量很少,通过人工授粉(亲和花粉)虽然能提
高坐果率,但需耗费大量的人力和物力,增加生产成本。
因而研究沙田柚的自交不亲和机理具有重要的生产实
践价值和理论意义[1]。
关于沙田柚配子体自交不亲和现象,薛妙男等[2]对
沙田柚自交不亲和性的细胞学基础和生化基础进行了
一系列较为深入的研究,确定了沙田柚属于配子体型自
交不亲和类型;花粉管在花柱中的生长途径以及花粉管
在花柱的1/2部位生长受阻[3];同时,还用免疫胶体金标
技术对花柱S糖蛋白进行了组织化学定位[4]。杨继华
等[5]采用亲和层析和电泳相结合的方法,分离纯化了沙
田柚花柱特异糖蛋白,并对其生物学活性及生化性质进
行了分析。而有关沙田柚花粉的研究报道不多。现已
证明植物配子体自交不亲和性受1个具有复等位基因
的S-位点控制,S-位点至少包括2个基因,1个在花柱中
特异性表达,称花柱S-基因;另1个在花粉中特异表达,
称花粉S-基因,自交不亲和的拒斥反应即是花柱S-基因
和花粉S-基因互作的结果。因此配子体自交不亲和涉
及到花粉和花柱中相关基因的表达和相互作用。该试
验研究了沙田柚自交和异交花柱蛋白对自身花粉萌发
和花粉管生长的影响,并比较了自交和异交花柱蛋白处
理条件下花粉管蛋白的差异,以期为克服沙田柚自交不
亲和提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试花粉采自10a生沙田柚结果树。
1.2 试验方法
当天开花的花药置于电热吹风干燥箱中,25℃恒温
2h,吹干表面水分,再置于25℃恒温房中自然晾干至花
药完全散开、花药壁翻转,使花药含水量在11.8%~
15.5%范围内。
1.2.1 自交、异交花柱蛋白的提取 分别取沙田柚自
交、异交(酸柚×沙田柚)后3d花柱,切取1/2花柱段,
参照杨继华等[6]的方法提取花柱蛋白,紫外分光光度计
测定蛋白质浓度后置于-20℃备用。
1.2.2 花粉管的培养与收集 基本培养基在Brewbaker
等[7]的基础上加以改良:15%蔗糖,0.02%硫酸镁,
0.01%硝酸钾,0.03%硝酸钙,0.01%硼酸,20% PEG
4000,pH 5.6,在培养液中分别加入自交、异交花柱识别
蛋白提取物,并使蛋白质终浓度为0.5mg/mL。选择有
凹槽的载玻片进行花粉培养,把配制好的液体培养基滴
在载玻片的凹槽内,每个凹面皿加1.5mL培养液,然后
用毛笔均匀撒播适量花粉,再将载玻片放在垫有湿滤纸
的培养皿中,加盖后置于28℃恒温箱内培养,每个处理
重复3次。培养24h后,检测花粉的萌发及花粉管生
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北方园艺2014(03):88~91 ·生物技术·
长状况。同时,将培养好的2种花粉管(即分别添加自
交、异交花柱蛋白培养的沙田柚花粉管)培养液分别装
入50mL离心管中,5 000r/min离心10min,弃上清,沉
淀用蒸馏水清洗3次,吸干水分后置-20℃冰箱中备用。
1.2.3 花粉管蛋白的提取 自交和异交花柱处理后的
花粉管收集后,按文献[6]的方法提取花粉管蛋白。
1.2.4 花粉管蛋白的电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)参考文献[8]方法进行。浓缩胶4%,分离胶
10%,电极缓冲液系统为Tris-甘氨酸(pH 8.3),浓缩胶
恒压70V,分离胶恒压150V至电泳结束。取出凝胶
板,进行考马斯亮蓝R250染色30min,脱色至背景清晰,
拍照、保存。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)参
考文献[8]方法进行。浓缩胶4%,分离胶10%,电极
缓冲液系统为Tris-甘氨酸(pH 8.3),含0.1%SDS,浓
缩胶恒压70V,分离胶恒压150V至电泳结束。取出凝
胶板,进行考马斯亮蓝R250染色180min,脱色至背景清
晰,拍照、保存。载体两性电解质pH 梯度等电聚焦
(IEF-PAGE)参考 Vesterberg[9]和郭尧君[8]等方法进
行。预电泳为200V10min,300V30min,400V
30min。预电泳结束,小心吸取胶面上液体,每管上样
15μL(其中有2管为空白对照,用来测pH值),再依次
加入20μL样品覆盖液防止样品与电极液直接接触,覆
盖液上加满负极液。电极液为:上槽(负极)0.02mol/L
NaOH,下槽(正极)0.01mol/L H3PO4,在室温下,按
400V1h,600V12h,800V1h的程序进行聚焦电泳。
2 结果与分析
2.1 花柱蛋白提取液对花粉萌发的影响
花粉培养24h后进行镜检,每个培养皿随机观察
30个视野。以花粉管长度等于或大于花粉粒直径(1/2)
以上者为萌发标准[10-11],统计花粉萌发率。结果表明,
花粉在含自交花柱蛋白的培养基中的萌发率为80.1%,
而在含异交花柱蛋白的培养基中花粉萌发率为81.6%,
在不添加任何花柱蛋白的培养基中,花粉的萌发率为
83.0%。三者之间差异不大。
2.2 花柱蛋白提取液对花粉管生长的影响
不同浓度的自交花柱蛋白对花粉管生长均有抑制作
用,当自花授粉花柱蛋白达到0.5mg/mL时,其抑制作用
明显。花粉在分别添加0.5mg/mL自交和异交花柱蛋
白的培养基中,每隔2h对花粉管的生长情况观察1次。
结果发现,在添加自交花柱蛋白的培养基中,花粉管的
生长从培养的4h开始受到抑制,4~10h内发生明显的
抑制作用,10h后花粉管不再继续生长,其平均长度
(240.1μm)仅为添加异交蛋白花粉管平均长度
(728.0μm)的1/3左右;添加异交蛋白培养液中的花粉
管平均长度与未添加任何花柱蛋白的花粉管的平均长
度相比(736.2μm),在生长状况上没有明显差异。
2.3 PAGE电泳结果
添加自交、异交花柱蛋白培养的花粉管可溶性蛋白
经PAGE电泳分离结果显示,2种花粉管可溶性蛋白图
谱所显示蛋白条带比较均匀,分布差异不明显,仅在Rf
值=0.81(比移Rf=条带泳动距离/指示剂泳动距离)
处,自交花柱蛋白处理的花粉管的蛋白图谱显示出1条
特异蛋白带(图1箭头a所示)。
图1 自交、异交花粉管蛋白的PAGE电泳结果与模式
Fig.1 PAGE electrophoresis pattern of proteins from
self-polinated and cross-polinated polen tube
2.4 SDS-PAGE电泳结果
分别添加自交、异交花柱蛋白培养的2种沙田柚花
粉管可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳结果显示,各种蛋白
分子量集中在100kD内,在每条泳道高、中、低分子量区
域比较均匀地分布了约50条蛋白带,蛋白条带数目明
显地比普通电泳即PAGE电泳结果(图1)增加,这说明
构成花粉管可溶性蛋白的亚基种类较多。2种花粉管可
溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图谱基本相似,仅在自交柱
蛋白处理的花粉管可溶性蛋白图谱中发现2条相对分
子量分别约为35.0kD和37.5kD的蛋白特异带(图2
箭头a、b所示),在异交柱蛋白处理的花粉管可溶性蛋白
提取物中未发现蛋白特异带。
图2 自交、异交花粉管蛋白SDS-PAGE电泳结果与模式
Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis pattern of proteins from
self-polinated and cross-polinated polen tube
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·生物技术· 北方园艺2014(03):88~91
2.5 IEF-PAGE电泳结果
分别添加自交、异交花柱蛋白培养的2种花粉管可
溶性蛋白等电聚焦电泳分离结果显示,蛋白质等电点主要
集中在pH 4.5~7.8;2种处理方式花粉管蛋白电泳图谱
差异不大,但在自交花粉管蛋白的电泳图谱上发现了2条
特异蛋白带,等电点分别为6.20和5.85(图3中a、b)。
图3 自交、异交花粉管蛋白IEF-PAGE电泳结果与模式
Fig.3 IEF-PAGE electrophoresis pattern of proteins from
self-polinated and cross-polinated polen tube
3 讨论
薛妙男等[1-3]对沙田柚自花授粉和异花授粉(沙田
柚×酸柚)过程中,花粉的萌发、花粉管的生长,以及受
精过程进行了研究,发现无论是自花授粉还是异花授
粉,花粉在柱头上均能萌发,并且花粉管能通过柱头乳
突细胞间隙进入柱头。但自花授粉和异花授粉的花粉
管在柱头中的生长情况完全不同,自花授粉的花粉管伸
长到花柱1/4~1/2时,自、异交的花粉管生长速度出现
差异,自交花粉管在花柱1/2左右处停止生长,而异交
花粉管生长正常进入胚囊受精。至于自、异交花粉管在
花柱中的这种生长差异的原因,杨继华等[12]认为沙田柚
花柱在自花授粉后诱导能够产生具有核酸酶活性的
S-糖蛋白,这种S-糖蛋白可对花粉管的生长产生抑制作
用,而在异花授粉的花柱中没有发现S-糖蛋白的产生。
这种现象在烟草[13-14]、矮牵牛[15]、秘鲁番茄[16]和苹果[17]
等植物中也有报道。该试验在沙田柚花粉的离体萌发
过程中,通过添加自交和异交花柱蛋白,发现沙田柚花
粉的萌发没有受到影响,但在随后花粉管的生长中,自
交花柱蛋白对花粉管的生长有明显抑制作用,培养4h
开始花粉管的生长速度降低,10h后不再生长,24h时
    
其长度仅为添加异交花柱蛋白花粉管的1/3。结果与沙
田柚栽培条件下自交、异交时花粉的萌发和花粉管的生
长情况相吻合。
通过对自交、异交花柱蛋白处理的沙田柚花粉管可
溶性蛋白质进行电泳分析比较,发现在添加了自交花柱
蛋白的花粉管中出现了一些特异蛋白质,特异蛋白亚基
分子量分别大约为35.0kD和37.5kD,特异蛋白的等
电点分别为5.85和6.20。但其理化特性、生活学活性、
与花柱S-核酸酶的相互作用,以及在自交不亲和中的作
用等还有待今后进一步深入细致的研究。
参考文献
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Effect of Citrus grandis var.shatinyu Hort.Style Protein on
Its Polen Germination and Growth
QIN Ping-sheng,ZHANG Yu,HOU Li-xia,YANG Xiao-wen,QIN Xin-min
(Colege of Life Science,Guangxi Normal University,Guilin,Guangxi 541004)
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Abstract:Taking the polen of Citrus grandis var.shatinyu Hort.as material,efect of the self-polinated style proteins
and the cross-polinated style proteins on polen germination and polen tube growth were compared.The results showed
that polen germination was unafected by adding self-polinated style protein and the cross-polinated style protein,but
significantly afected the growth of polen tube.The growth of polen tube in those media with the self-polinated style
proteins was restrained,with cross-polinated style proteins was unafected.PAGE electrophoresis showed that the polen
tube self style protein processing of the 1specific protein bands(Rf=0.81);tube SDS-PAGE electrophoresis to self
styleprotein processing appeared relative molecular weight of 2specific protein of 35kD and 37.5kD band;IEF-PAGE
electrophoresis results showed that,in the self style protein treated polen tube protein in the isoelectric points of 5.85
and 6.20of the two specificprotein bands.
Key words:Citrus grandis var.shatinyu Hort.;polen germination;polen tube length;style proteins;Gel electrophoresis
第一作者简介:许瑞瑞(1982-),女,博士,讲师,研究方向为植物逆
境基因表达调控。E-mail:xuruirui2006@163.com.
责任作者:曹慧(1966-),女,博士,教授,硕士生导师,研究方向为
果树逆境生理。E-mail:hui5232@163.com.
基金项目:山东省自然科学基金资助项目(Y2007D60);潍坊市科
学技术发展计划资助项目(20121305,2012098);生物化学与分子
生物学山东省高校重点实验室(潍坊学院)开放课题资助项目
(2012SWKF01)。
收稿日期:2013-10-22
两个苹果RNA解旋酶基因的基本特征与表达分析
许 瑞 瑞1,张 世 忠2,曹   慧1,刘 慧 莲1,王 建 波1
(1.潍坊学院,山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室,山东 潍坊261061;
2.山东农业大学 国家苹果工程技术研究中心,山东 泰安271018)
  摘 要:利用生物信息学方法对2个苹果RNA解旋酶基因染色体定位、系统进化关系和氨
基酸序列基本特征等进行了预测,分析了基因在果实成熟期和砧穗互作中的表达差异;利用
PlantCARE软件对二者的启动子序列中所包含的响应元件进行了预测和分析;利用qRT-PCR方
法分析了2个苹果RNA解旋酶基因的组织表达模式。结果表明:“金冠”苹果基因组中鉴定了2
个RNA解旋酶基因,命名为Mdhelicase1、Mdhelicase2,分别分布在苹果第6、17条染色体上;表达
谱芯片分析发现,在苹果果实成熟时期和砧木接穗互作过程中,Mdhelicase1和Mdhelicase2基因
的表达有不同程度的变化;2个基因的启动子区域存在多个胁迫响应元件,如 MBS、HSEs、TC-
rich repent、AREs、ABREs、GARE motif、P box、CGTCA motif、TGACE motif、Light responsive
elemonts等。Mdhelicase1、Mdhelicase2在“平邑甜茶”茎、叶、花、果实中都有表达,二者分别在茎和
叶中的表达量最高。
关键词:苹果;RNA解旋酶;基因特征;启动子序列分析;表达分析
中图分类号:S 661.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)03-0091-06
  RNA解旋酶是一类参与RNA结构调控并影响
RNA合成、复制、翻译启始、剪接、rRNA加工、核糖体组
装、核mRNA输出及mRNA稳定化与降解的蛋白质新
家族[1-2]。植物细胞中RNA解旋酶参与多种代谢过程,
具有广泛的生理意义并且对逆境的适应具有重要作
用[3]。植物中的RNA解旋酶已成为该领域的研究热
点,越来越多的植物基因组中的RNA解旋酶基因被克
隆鉴定,包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)[4-8]、水稻
(Oryza sativa)[9]、大麦(Hordeum vulgare)[10]、烟草
(Nicotiana tabacum)[11]等。
2001年,Seki等[4]在拟南芥中,通过对1 300个基因
的cDNA进行微阵列(Microarray)分析技术,首次发现
冷害诱导型DEAD-box解旋酶基因AB050574,这一发
现表明解旋酶在植物胁迫应答过程中具有一定的作用,
研究还发现拟南芥的FL25A4基因能够忍耐4℃的低
温;Gong等[5]利用图位克隆的方法从有较强的耐寒能
力的拟南芥突变体中得到CRYOPHYTE/LOS4基因,
试验结果显示该基因编码定位于核膜上的DEAD-box
RNA解旋酶,对于mRNA的输出和植株的生长发育以
及逆境响应具有重要的作用;大麦中的RNA解旋酶基
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