全 文 ：广东截叶胡枝子根瘤菌株系的发现及其 16S rDNA分析
刘明骞1， 丁美美1， 欧阳昆唏2， 孙佩光2， 周 玮1， 骈瑞琪1， 陈晓阳1
（1.华南农业大学林学院，广东 广州 510642；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）
摘 要：从截叶胡枝子的根瘤中分离出 30 个分离物，经纯化、镜检后得到 26 株待测菌株。 将其 16S rDNA 部分序列测序后用
DNAMAN 和 MAGE 5.0 软件进行分析，并与参比菌株相比较。 结果表明，去除重复后共获得 18 株根瘤菌菌株，且可将其分为两大
类，分别属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和中华根瘤菌属（Sinorhizobium）。
关键词：截叶胡枝子； 根瘤菌； 16S rDNA
中图分类号：Q939.11+4 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2011）22-0138-03
Discovery and identification of rhizobia associated with
Lespedeza cuneata in Guangdong
LIU Ming-qian1, DING Mei-mei1, OUYANG Kun-xi2, SUN Pei-guang2,
ZHOU Wei1, PIAN Rui-qi1, CHEN Xiao-yang1
（1.College of Forestry, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China；
2.College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China）
Abstract: 26 tested strains were isolated and purified in 30 isolates which were isolated from Lespedeza cuneata. The partial
sequence of its 16S rDNA sequences were tested, and the software DNAMAN and MAGE 5.0 were used to analysis these sequences. The
results showed that 18 rhizobium strains were identified and belonged to Bradyrhizobium and Sinorhizobium compared with the known
strains.
Key words: Lespedeza cuneata; rhizobia; 16S rDNA
胡枝子属 （Lespedeza）是豆科 （Leguminosae）蝶形花
亚科（Papilionatae）中一个较大的属，该属植物全世界约
有 60 余种，分布在亚洲、大洋洲、欧洲和北美洲的湿润、
半湿润地区 [1]。 我国约有 26 种，广泛分布于东北到长江
流域至西南地区，以及台湾山地的林缘、林迹地，生长的
土壤从微碱到酸性， 多生于海拔 1 000～2 000 m 之间 [2]。
在我国南方红壤侵蚀区广为栽培的主要有美丽胡枝子
（Lespedeza fomosa Kochne）、 二 色 胡 枝 子 （Lespedeza
bicolor Turcz）和截叶胡枝子 （Lespedeza cuneata）等树种
[3]。 截叶胡枝子为多年生豆科胡枝子属半木本植物，根系
发达，抗病虫能力强，耐干旱和土壤贫瘠。 它不仅可改良
生态和提高土壤肥力，而且可作饲料 [4]，具有重要的生态
和经济价值， 因而倍受国内生产及科研部门的重视。 从
20 世纪 80 年代起，河北赤诚、吉林延边以及内蒙等地大
面积人工种植了胡枝子属植物， 取得了良好的生态及经
济效益。
华南各省区的土壤不仅 pH 值较低，而且氮、磷等养
分的有效含量都特别低，限制了豆科植物的生长。 豆科植
物虽然具有生物固氮的能力，但这种能力必须通过与根瘤
菌共生形成根瘤才能实现。 陈文新等[5]对我国北部及华南
地区大部分省份胡枝子根瘤菌做进行了调查和研究，但广
东省胡枝子根瘤菌未见报道。 实践表明，接种根瘤菌可增
加根瘤菌的数量，提高根瘤菌和土壤微生物的活性，增强
豆科作物的固氮能力，促进根系生长，从而提高豆科作物
的产量。但接种的增产效果主要取决于根瘤菌的竞争结瘤
能力和结瘤的固氮效率。因此，要提高根瘤菌的应用效果，
关键是筛选到适应当地土壤环境，具有较强竞争结瘤能力
和高效固氮能力的根瘤菌株系。 由于我国华南地区土壤
pH值较低且严重缺磷， 北方常用的根瘤菌菌剂在南方地
区适应性较差[6]。因此，筛选适应酸性缺磷土壤的高效根瘤
菌株系对提高华南广大地区豆科植物生长状况具有深远
意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试根瘤采自华南农业大学启林北林学院苗圃 (N
23°09′50″, E 113°21′60″)所种植的截叶胡枝子。 根据植株
的表现， 将截叶胡枝子大致分为 3 类：A 类， 株高 30～50
cm，枝条软嫩，分枝多但较短，叶多 ；B 类 ，株高大于 50
cm，枝条较硬，分枝多且长；C类，株高 50 cm 左右，分枝少
且短，叶多。由于该苗圃是第一次种植豆科植物，土著根瘤
菌丰度很低。
收稿日期：2011-10-14
基金项目：省部产学研项目（2006D90204004）；广州市科技计划
项目（2010Z1-E241）；农业部 948 项目(2011-Z50)
作者简介：刘明骞（1987-），男，在读博士生，E-mail: liumq0123
@163.com
通讯作者：陈晓阳（1958-）,男，博士，教授，E-mail: xychen@scau.
edu.cn
广东农业科学 2011 年第 22 期138
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2011.22.059
15000bp
10000bp
7500bp
M A6-2 A6-3 B-5 B-7 C-1 C-6 C-11
图 1 部分菌株基因组 DNA 提取结果检测
M A6-2 A6-3 B-5 B-7 C-1 C-6 C-11
2000bp
1000bp
图 2 部分菌株 16S rDNA 部分片段回收后检测
1.2 试验方法
1.2.1 根瘤菌的分离、纯化 根瘤菌的分离纯化参考文献
[7] 并稍作改动： 取新鲜根瘤放入 95%的乙醇中处理 3
min，再放入 0.2% HgCl2灭菌 5 min，取出后无菌水冲洗 5~
6次。 在用火焰灭过菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子
夹住半个瘤， 切口面向 YMA 培养基表面划线， 倒置后
28℃下培养。 待培养 6～7 d 后，挑取菌落形态像根瘤菌的
菌株进行纯化，得到纯的单菌落。 革兰氏染色，在显微镜
下从菌体形态上对分离菌株进行鉴定。
1.2.2 16S rDNA 基因的部分序列测定 参照 Yang 等 [8]
的方法提取根瘤菌总 DNA。 提取的 DNA经检测符合要求
后用于 16s rDNA的扩增。 16S rDNA扩增引物选用 E.coli
16S rRNA 基因系列保守区域的两段引物 P1 和 P6[9-10]，正
向引物 P1 为 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGA-
ACGCT -3’， 反 向 引 物 P6:5’ -TACGGCTACCTTGTTA
CGACTTCACCCC-3。 PCR 扩增体系：10×缓冲液 2.5 μL，
dNTP(2 mol/L)2.5 μL，引物 P1/P6 (各 10×10 -5 μmol/L)0.5
μL，模板 DNA 50 ng，Taq酶 2.5 U，超纯水补足。 PCR反应
程序 ：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，
72℃延伸 2 min，35个循环；72℃延伸 10 min。 PCR扩增产
物通过 0.8%～1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测， 用 2%的琼脂
糖凝胶电泳回收 1 500 bp 左右的片段， 回收的片段经检
测纯度符合要求后与 PMD-19T 载体连接，然后转入大肠
杆菌感受态细胞 5α中用于序列测定（华大基因公司）。
1.2.3 16S rDNA 基因的部分序列比对 、 分析 利用
DNAMAN 软件对供试菌株和参比菌株的 16S rDNA 基因
的部分序列进行比对，并计算其相似度，再利用 Mega 5.0
软件，采用 Kimura-2 参数，进行邻接法(Neighbor-Joining)
分析，生成系统发育树。 系统发育关系所用参比菌株及其
16S rDNA 基因部分序列在 NCBI 基因库(NCBI GenBank)
中索取。
2 结果与分析
从截叶胡枝子的根瘤中获得了 30 个分离物样品，经
分离、纯化、镜检后，得到 26株待测菌株，根据与其共生的
植株的表现类型依次编号。 将各菌株在 YMA液体培养基
中扩增后提取其基因组 DNA，部分菌株的 DNA 检测结果
见图 1。 从图 1可以看出，所得 DNA条带亮度大且无弥散
现象，说明 DNA量大且完整，可用于后续试验。
用 E.coli 16S rRNA基因系列保守区域的两段引物 P1
和 P6扩增各菌株 16S rDNA部分序列，用 2%的琼脂糖凝
胶电泳回收 1 500 bp 左右的条带， 部分条带回收后检测
结果见图 2。 从图 2可以看出，扩增片段量大且纯度较高，
说明回收结果理想，可用于下一步的连接和转化。
将回收的片段与 PMD-19T 载体连接，然后转入大肠
杆菌感受态细胞 5α 中进行序列测定， 通过 DNAMAN 软
件分析后去除重复菌株，得到 18株根瘤菌菌株，分别编号
为：A4-232、A5-3、A6-2、A6-3、A6-10、A6-31、B-5、B-7、
B-9、B-11、B-12、B-13、C-1、C-3、C-5、C-6、C-11、C-21。
将所得到菌株的 16S rDNA 基因部分序列与从 GenBank
数据库中获取的 12个参比菌株的 16S rDNA基因部分序
列进行比对后， 利用 Mega 5.0 软件得到待测菌株与参比
菌株之间进化与发育关系的系统发育树（图 3）。 从图 3可
以看出，分离纯化得到的根瘤菌菌株可分为两大类：一类
与埃氏慢生根瘤菌的代表性菌株聚为一类， 属于慢生型
根瘤菌属；另一类与中华根瘤菌的代表性菌株聚为一类，
属于中华根瘤菌属。
从图 3 还可以看出， 待测菌株 A5-3、A6-2、A6-3、
A6 -31、B -12、C -1、C -3、C -11 8 个菌株相似度很高
（99.91%）， 与慢生根瘤菌属的代表菌株 B.elkanii 和 B.
图 3 待测菌株与参比菌株系统发育树
semia
139
semia 同源性极高，相似性高达 99.93%；菌株 B-7、B-13、
C-6 的相似度很高（99.86%），与菌株 B.elkanii 和 B.semia
同源性较高 ， 其相似性为 99.93% ； 菌株 B-5 与 B.
yuanmingense 的同源性很高 （99.04%）；B-11、C-21 两个
菌株较为特殊， 与慢生根瘤菌属的其他代表菌株差异较
大，还需 DNA-DNA 杂交、多位点酶电泳、全细胞蛋白电
泳分析等其他分析方法进行全面分析， 才能确定其是否
是新菌株； 菌株 A4-232、A6-10、B-9、C-5 相似度高达
99.88%，与中华根瘤菌属聚为一类，与中华根瘤菌属的
代 表 菌 株 Sinorhizobium sp. S009 的 同 源 性 很 高
（99.90%），说明其属于中华根瘤菌属。
由此可以看出，3 种表现型的截叶胡枝子根瘤菌并无大
的区别， 每个类型都含有慢生根瘤菌属和中华根瘤菌的
根瘤菌。 这可能是由于胡枝子与根瘤菌的共生并没有高
度的寄主专一性，而与土壤的理化性质、环境条件和根瘤
菌与寄主植物之间的共生选择进化关系较为密切的缘
故。
3 结论与讨论
华南地区纬度低、温热多雨，而且大多数土壤为酸性
红壤，缺磷现象特别严重[11]。据报道，在酸性土壤特别是土
壤 pH值低于 5.0 的情况下，豆科作物很难结瘤 [12]，因此我
们需要筛选耐酸、耐低磷的高效根瘤菌菌株。 不同的根瘤
菌种类对环境的影响具有不同的忍耐能力， 与中性土壤
相比， 从酸性土壤中分离出的根瘤菌具有更强的耐酸能
力[13]。 本研究在无豆科植物栽培历史的酸性缺磷土壤上，
从截叶胡枝子的根瘤中筛选耐酸、耐低磷的大豆根瘤菌，
经过多次在 YMA 培养基平板上的分离、纯化，得到 18 株
胡枝子根瘤菌纯株系， 经 16S rDNA 测序分析确定 18 株
根瘤菌菌株可分为慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。 本研
究为今后在华南地区酸性土壤中接种胡枝子根瘤菌提供
了试验材料和理论依据。
本研究仅只对截叶胡枝子的根瘤菌进行了分离、纯
化及其 16S rDNA 序列分析，还需通过回接验证试验与
固氮酶活性测定，确定其中的高效根瘤菌株系，并需要
田间实验进一步证明所筛选株系的侵染效率、 固氮效
率、竞争性和适应性等特点，为其推广利用提供进一步
的试验和理论支持。 对于菌株 B-11 和 C-21，与慢生根
瘤菌属的代表菌株有较大差异，要确定其分类地位及其
是否为新发现菌株，还需通过 DNA-DNA 杂交 、多位点
酶电泳、全细胞蛋白电泳分析等分析方法进行进一步确
定。
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