全 文 ：第 29卷第4期
2011年 7月 干 旱 地 区 农 业 研 究Agricultural Research in the Arid Areas Vol.29No.4Jul.2011
　
收稿日期:2010-12-01
基金项目:宁夏自然科学基金资助项目(NZ1040)
作者简介:代金霞(1973—),女 ,回族 ,副教授 ,研究方向为分子系统学。
通讯作者:王玉炯 , E-mail:wyj@nxu.edu.cn。
荒漠植物柠条根瘤菌的抗逆性及其系统发育分析
代金霞 ,王玉炯 ,郭晶静 ,武雪娟 ,张晓玲
(宁夏大学生命科学学院 , 宁夏 银川 750021)
　　摘　要:对分离自宁夏白芨滩国家级自然保护区的 62株柠条根瘤菌的耐盐性 、耐酸碱性 、生长温度范围和抗
生素抗性进行了测定 ,并采用 16S rDNA PCR-RFLP和 16S rDNA 全序列分析方法对其进行了遗传多样性及系统发
育分析。结果表明:柠条根瘤菌具有较强的耐受高温和耐盐 、耐酸碱能力 , 抗逆性较强 , 但仍存在菌株间差异。
70.8%的菌株可耐受 4%的 NaCl ,全部菌株对 100 μg/mL的青霉素具有抗性 , 均可在 pH5.0～ 11.0 的培养基中生长。
经16S rDNA 序列测定鉴定为豌豆根瘤菌的 CNXE4、CNXLW24 和中华根瘤菌的 CNXC3 , 这 3 株菌在 pH4.0 ～ 12.0 的
范围内都可生长 ,可以耐受 6%的NaCl、50μg/mL浓度的卡那霉素和链霉素 、300 μg/mL的青霉素 , 在 60℃热激后可
生长 , 表现出极强的抗逆性。 16S rDNA PCR-RFLP将 62 株菌分为 7 种图谱类型 , 16S rDNA 全序列分析的结果表
明 , 它们分别归属于根瘤菌属 、中华根瘤菌属 、土壤杆菌属 、叶杆菌属和慢生根瘤菌属 , 遗传多样性较为丰富。
关键词:柠条;根瘤菌;抗逆性;系统发育
中图分类号:S154.3;Q939.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7601(2011)04-0223-05
　　豆科植物与根瘤菌共生体系具有固氮能力强 、
固氮量大 、抗逆性强的优点 ,可以提高土壤肥力 、为
人类提供高蛋白质营养 ,具有巨大的生态 、经济和社
会价值 , 在农业的可持续发展中占有重要的地
位[ 1 ,2] 。
柠条是豆科蝶形花亚科锦鸡儿属(Caragsana
Fabr.)植物几种灌木的俗称 ,不仅具有生物产量高 、
营养丰富等品质 ,而且有极强的生命力和抗逆性 ,它
可以抗 50℃的高温 ,耐-40℃的严寒 ,在防风固沙 、
水土保持 、改善生态环境方面有突出作用 ,是中国西
北 、华北 、东北西部水土保持和固沙造林的重要树种
之一[ 3] 。因而作为防风固沙的先锋物种 ,柠条的生
态学意义远大于其经济学意义 ,发掘与其共生的根
瘤菌资源 ,寻找高效的固氮共生体系 ,将对沙漠化治
理起到积极的作用 。而目前 ,国内外对豆科与根瘤
菌共生固氮体系的研究主要集中于对农业生产有重
大意义的植物如大豆 、苜蓿 、花生等 ,对乔木 、灌木 、
半灌木豆科植物根瘤菌的研究相对较少 。针对锦鸡
儿属植物根瘤菌进行的抗逆性与系统发育研究亦十
分有限[ 4～ 6] ,尤其对干旱半干旱荒漠草原这种特殊
的生态环境中锦鸡儿植物超强的抗逆性与根瘤菌的
互作和协同进化的研究至今还未见报道 。本研究对
分离自宁夏荒漠草原的柠条根瘤菌的生长温度 、耐
酸碱 、耐盐 、对抗生素的抗性等抗逆性进行研究 ,同
时采用 16S rDNA PCR-RFLP 和序列分析方法对柠
条根瘤菌进行多样性及系统发育分析 , 旨在筛选出
有实际应用前景的菌株 ,为干旱半干旱生态环境中
锦鸡儿植物与根瘤菌的互作和协同进化研究及柠条
根瘤菌的系统分类地位和应用研究提供基础资料。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
柠条根瘤样品采自宁夏白芨滩国家级自然保护
区 ,该区不仅是我国典型的荒漠类型自然保护区 ,而
且是全国最大的防风治沙先锋树种柠条的集中分布
地和西北最大的猫头刺荒漠自然保护区。根瘤采集
后用无菌水浸泡至吸涨 ,经 75%的乙醇和 0.1%的
HgCl2分别进行表面消毒后 ,用无菌水冲洗多次 ,在
无菌的条件下用镊子夹碎根瘤 ,挤出汁液接种于
YMA培养基上 ,置 28℃下培养 3 ～ 5 d ,挑取单菌落
进行分离纯化[ 7] 。革兰氏染色并镜检细胞形态和纯
度后 ,将纯菌落转接于试管斜面保存 。本实验共筛
选待测菌株 62株 。菌株编号见表 1。
1.2　抗逆性测定
将供试菌株进行活化培养后接种于待测指标平
板 ,置恒温培养箱中 28℃培养 3 ～ 7 d ,观察平板上
菌的生长情况 ,生长记为“ +” ,不生长记为“ -” ,各
处理均 3次重复 。
表 1　供试菌株及其 16S rDNA PCR-RFLP图谱类型
Table 1　Tested strains and the types of 16S rDNA PCR-RFLP
菌株
Strain
16S rDNA酶切类型
Type of 16S rDNA PCR-RFLP
HinfⅠ HaeⅢ MspⅠ TaqⅠ
酶切组合类型
Combination of RFLP types
CNXE1 , CNXF1 , CNXF2 , CNX222 , CNX223 , CNX051, CNX821 A A A A Ⅰ(AAAA)
CNXE2 , CNXE3, CNXE4, CNXE5, CNXE7, CNXF5 , CNXF6 ,
CNXLW14 , CNXF7 , CNXF8 , CNXF9 , CNXLW20 , CNXLW24 ,
CNXLW25 ,CNXC6
B A B B Ⅱ(BABB)
CNXE6 , CNX053 , CNX054 B C E E Ⅲ(BCEE)
CNXF3 ,CNXF4 ,CNXLW17, CNXC7 , CNXC8 , CNXC10 B A B C Ⅳ(BABC)
CNXC1 , CNXC2 , CNXC3 , CNXC4, CNXC5 , CNXC9 , CNX331 ,
CNX332 , CNX334 , CNX052 C A C D Ⅴ(CACD)
CNX333 , CNX335 , CNX221 D B D E Ⅵ(DBDE)
CNX401 , CNX402 , CNX403 , CNX404 , CNX411 , CNX412, CNX413 ,
CNX414 , CNX501 , CNX502 , CNX511 , CNX512, CNX513 , CNX514 ,
CNX811 , CNX812 , CNX813 , CNX822
B D F D Ⅶ (BDFD)
1.2.1　耐盐性测定　将 NaCl加入到 YMA 培养基
中配成质量分数为 1%、2%、3%、4%、5%和 6%六
个梯度 ,灭菌后倒平板 。以含 0.01%NaCl的 YMA
平板作为阳性对照。
1.2.2　耐酸碱性测定　将高压灭菌的 YMA培养基
用1 mol/L 的 HCl和 NaOH 调节 pH 值为 4.0 、5.0 、
6.0 、8.0 、9.0 、10.0 、11.0 、12.0八个梯度后倒平板 。
以 pH7.0的 YMA平板作为阳性对照 。
1.2.3　生长温度范围测定　YMA平板上接种供试
菌株后置于 4℃、10℃、40℃培养;将菌株 60℃热激
处理 10 min后置于 28℃培养 ,以 28℃生长的 YMA
平板为阳性对照 。
1.2.4　抗生素抗性测定　选取氨苄青霉素(AMP)、
氯霉素(CAP)、卡那霉素(KM)、庆大霉素(GM)和链
霉素(SM)5 种抗生素 ,每种抗生素设置 5 、50 、100
μg/mL和 300 μg/mL 四个浓度梯度加入 YMA培养
基中倒平板。以不含抗生素的 YMA平板作为阳性
对照 。
1.3　系统发育分析
1.3.1　细菌基因组 DNA的提取　将供试菌株接入
TY液体培养基中 ,28℃,150 r/min振荡培养 3 d ,4℃
8 000 r/min 离心收集菌体 ,弃去上清 ,用 TE洗涤 3
次 ,溶菌酶破壁 ,蛋白酶K 处理 ,酚/氯仿/异戊醇抽
提基因组 DNA , 乙醇沉淀 , 最后溶于灭菌双蒸水
中[ 4] 。
1.3.2　16S rDNA的PCR扩增　采用细菌 16S rDNA
通用引物进行扩增 ,引物序列为:27F :5 -AGA GTT
TGA TCC TGG CTC AG -3 ;1492R:5 -TAC GGY
TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ,分别对应于大肠杆菌
(Escherichia coli)16S rDNA基因的 8 ～ 27位和 1 492
～ 1 513位。PCR扩增方法参照文献[ 8] 。
1.3.3　16S rDNA PCR-RFLP 分析及序列测定 　选
用HinfI 、HaeIII、MspI 、TaqI四种限制性内切酶分别进
行酶切 。酶切产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测 ,
GelRed染色 ,Bio-Rad凝胶成像系统拍照。分析各酶
切图谱类型 ,选取每种图谱类型组合中的代表菌株
进行 16S rDNA全序列测定 ,序列测定委托上海生工
生物工程技术服务有限公司进行 。将测得的序列与
GenBank中已知根瘤菌的 16S rDNA序列进行同源性
比较 ,获得同源性相近的菌种序列 ,用Clustal X进行
多重比对 ,运用MEGA5.0软件 ,采用UPGMA法构建
系统树。
2　结果与分析
2.1　柠条根瘤菌的抗性
供试菌株普遍具有较强的耐盐 、耐酸碱能力。
所有菌株都能在含 1%NaCl的培养基中生长 , 92%
的菌株可以耐 2%的NaCl ,80%的菌株可耐受 3%的
NaCl ,70.8%的菌株可耐受 4%的NaCl。36.1%的菌
株可耐受 5%的 NaCl ,有 8 株菌(12.9%)可以耐受
6%的NaCl。随着 NaCl浓度的不断升高 ,菌株的耐
盐性逐渐降低 ,生活力逐渐下降 ,表现在平板上的菌
落不仅数目减少 ,菌的生长也变得十分缓慢 ,4 ～ 5 d
才可见 1.5 mm 的菌落。全部菌株均可在 pH5.0 ～
11.0 的培养基中生长 ,除 12 株菌外其余菌株均能
在 pH12.0 的培养基中生长 , CNXE4 、CNXLW24 ,
CNX501 ,CNX414 、CNX811和 CNXC3 这 6 株菌能在
pH4.0 ～ 12.0下生长。
供试菌株在 4℃时均不能生长 ,所有菌株可在
10℃和 40℃下生长 , 60℃热激处理 10 min 后置于
224　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 29卷
28℃培养 ,93%的菌株能继续生长 ,表现出极强的耐
高温性质 。
绝大部分菌株对青霉素具有极强的抗性 ,在含
100 μg/mL 青霉素的培养基中均能正常生长 ,有
62%的菌株能耐受 300 μg/mL 青霉素 。90%以上的
菌株能耐受 5 μg/mL的氯霉素 、卡那霉素 、链霉素和
庆大霉素 ,而 50 ～ 100 μg/mL浓度的卡那霉素 、链霉
素和庆大霉素则对菌株具有很强的抑制作用 ,多数
菌株在该浓度下均不能生长。
2.2　16S rDNA PCR-RFLP及序列测定
62株供试菌株的 16S rDNA 的 PCR产物经 4种
限制性内切酶酶切后分别产生 4 ～ 6 种图谱类型 。
所有待测菌株的 4种酶切图谱类型组合后共获得 7
种组合类型(表 1)。揭示出该保护区内与柠条共生
的根瘤菌具有较丰富的遗传多样性 。选取不同组合
类型的代表菌株进行序列测定 , 根据代表菌株的
16S rDNA全序列与已知种的根瘤菌序列比较 ,构建
出系统分类树状图(图 1)。从树状图可以看出 , 62
株供试根瘤菌在系统分类上分别归属于慢生根瘤菌
属(Bradyrhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、
根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)及
叶杆菌属(Phyllobacterium)的系统发育分支上。酶
切组合类型 Ⅱ(BABB)的代表菌株 CNXE4 和
CNXLW24与豌豆根瘤菌(R.leguminosarum CCBAU
15266 , R.leguminosarum BKBLP5)的亲缘关系最近 ,
序列相似性达到 100%,可认为是同种菌;组合类型
Ⅲ(BCEE)的代表菌株 CNXE6 与山羊豆根瘤菌
R .galegae的序列相似性为 100%,与根瘤菌属内各
已知种的模式菌株 16S rDNA 序列相似性最小 ,为
96%,大于划分属的标准(95%);类型Ⅳ(BABC)的
代表菌株 CNXF3 、CNXLW17 分别与岩黄芪根瘤菌
R .sullae 、高卢根瘤菌 R.gallicum 的序列相似性也
达到 100%,与根瘤菌属内其它已知种序列相似性
最小 ,为 96.5% 。这一结果表明这些菌株所代表的
类型 Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的 24株菌在系统分类上都属于根瘤
菌属;类型 Ⅰ(AAAA)的代表菌株 CNXE1 、CNXF1与
叶杆菌属 Phyllobacterium 已知模式菌株的序列相似
性最小 ,为 98.2%,表明这一类型的 7株菌在系统
分类上都属于叶杆菌属;类型Ⅴ(CACD)的代表菌株
CNXC3 与草木樨中华根瘤菌 Sinorhizobium meliloti
CCBAU65887的序列相似性达到 100%,与新疆中华
根瘤菌 S .xinjiangensis CCBAU83084 、费氏中华根瘤
菌 S .fredii MWE7 、苜蓿中华根瘤菌 S.medicae LMG
18864的 16S rDNA 序列相似性分别为 98.5%、
98.3%和 99.8%;类型 Ⅵ (DBDE)的代表菌株
CNX333 ,CNX221与慢生根瘤菌属内的 Bradyrhizobi-
um sp.CCBAU 85055 和 Bradyrhizobium sp.CCBAU
85057等菌株的序列相似性为 99.5%,而与该属已
知种的模式菌株序列相似性最大仅为 94.2%,这三
株菌可能代表一个新分类群 ,其系统地位尚需要结
合其它基因进一步分析;类型 Ⅶ (BDFD)的代表菌株
CNX404 、CNX502 与根瘤土壤杆菌 Agrobacterium
tumefaciens 的亲缘关系最近 , 序列相似性达到
100%,属于土壤杆菌属分支 。
3　结论与讨论
在抗逆性实验中 ,供试菌株表现出不同的耐盐 、
耐酸碱能力和抗生素抗性。其中 ,经 16S rDNA序列
测定结果鉴定为豌豆根瘤菌的 CNXE4 、CNXLW24和
中华根瘤菌的 CNXC3这 3株菌的抗逆性较为显著 ,
不仅可以耐受 6%的 NaCl 、300 μg/mL 的青霉素 、50
μg/mL浓度的卡那霉素和链霉素 ,而且表现出极强
的耐高温和耐酸碱性质 ,在 pH4.0 ～ 12.0的酸碱范
围内都可生长 。已有的研究结果表明 ,根瘤菌与其
宿主共生固氮体系的形成 ,除受到遗传因素的主导
作用外 , 生态环境也有可能成为重要的调节因
素[ 6 ,9～ 12] 。高丽锋等对毛乌素沙地的中间锦鸡儿根
瘤菌的抗逆性研究表明 ,分离的根瘤菌中 77%的菌
株能够耐受 8%的 NaCl , 在 10%NaCl 浓度下仍有
13.3%的菌株能够生长 ,表现出极强的耐盐性 ,在
pH为 4.0和 10.0的环境中仍有较强的生活力[ 6] 。
何恒斌等在对荒漠常绿植物沙冬青根瘤菌的研究中
也筛选出了一些抗盐碱 、耐高温的高抗逆性的菌
株[ 13] 。本研究的供试菌株全部来源于白芨滩国家
级自然保护区 ,该保护区属于毛乌素沙地的边缘和
鄂尔多斯台地区域 ,是典型的荒漠类型自然保护区 ,
降雨量小 ,蒸发量大 ,土壤贫瘠 ,盐碱化和沙漠化严
重。然而在这一地区 ,分布有全国最大的天然柠条
灌木林地 1.67万 hm2 、猫头刺近 2万 hm2 及各种各
样的共生固氮的豆科植物[ 14] 。高温干旱是动植物
和微生物生长发育的限制因子 ,但这种生态条件同
时亦赋予柠条及其共生根瘤菌较强的抗逆性。不论
是宿主还是细菌 ,均经自然选择不断适应干旱环境 ,
表现出耐盐 、耐酸碱 、耐高温的特性。目前的研究结
果揭示 ,根瘤菌耐盐机理是由于细胞中海藻糖 、甜菜
碱和多胺等的调节 ,进而提高了根瘤菌的耐盐能
力[ 15～ 17] 。而根瘤菌在抗干旱和抗盐碱方面具有相
关性 ,一般来说 ,抗旱性强的根瘤菌耐盐碱能力也
强[ 18] 。供试菌株及其宿主分布于干旱半干旱的荒
漠区 ,土壤盐碱化程度较高 ,它们所具有的特殊性状
225第 4期　　 　　　　代金霞等:荒漠植物柠条根瘤菌的抗逆性及其系统发育分析
可能是其在长期逆境胁迫下 ,经过双重选择 ,逐渐进
化 、适应生态环境的结果 ,是物种生态系统功能正常
发挥的有效保障 。柠条根瘤菌的高抗性与其宿主植
物的高抗性间可能有着密切的联系 ,其相互间的作
用机理及协同进化关系尚有待于进一步的研究 。
图 1　柠条根瘤菌 16S rDNA 全序列系统发育关系树状图
Fig.1　Phylogenetic relationship of rhizobia isolated from Caragsana spp.based on 16S rDNA sequences
　　经16S rDNA PCR-RFLP及序列测定结果 ,本实
验分离的 62株菌株中 ,根瘤菌属与土壤杆菌属占总
数的 67.7%,属于柠条根瘤内的优势菌 。系统树中
二者在种的系统发育上互有交叉 ,该结果与现有的
一些报道相一致[ 19 ,20] 。Gao 等的研究表明从内蒙毛
乌素沙地锦鸡儿植株中分离的主要根瘤菌类型为土
壤杆菌[ 21] ;Yan等从东北地区锦鸡儿根瘤菌中分离
出的主要根瘤菌类型是中慢生根瘤菌[ 22] 。本研究
分离的根瘤菌中未发现有中慢生根瘤菌的分布 ,这
进一步说明植被的种类和地理环境的差异会影响到
根瘤菌的种类和分布 ,根瘤菌与豆科植物的共生关
系是细菌 、植物及环境三方面相互作用的结
果[ 10 ,23] 。
总之 , 柠条作为水土保持和固沙造林的先锋物
种 ,干旱贫瘠的土壤生态条件必然会影响到与其共
生的根瘤菌的遗传特性和在分类上的差异 。对柠条
根瘤菌多样性的研究 ,对于进一步丰富我国根瘤菌
资源具有积极的意义。筛选出的抗逆性强的优良菌
株(如CNXE4 、CNXLW24和 CNXC3)需要进一步进行
结瘤和固氮能力的测定 ,以期为受损生态系统恢复
重建 、干旱风沙区自然保护区建设和优势生态林业
资源产业化发展提供种质资源。
226　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 29卷
参 考 文 献:
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Analysis of stress resistance and phylogenesis of rhizobia
isolated from Caragsana spp.
DAI Jin-xia , WANG Yu-jiong , GUO Jing-jing , WU Xue-juan , ZHANG Xiao-ling
(School of Life Science , Ningxia University , Yinchuan , Ningxia 750021 , China)
　　Abstract:Several biochemical characteristics of 62 rhizobia isolated from Caragsana spp.in Baijitan National Na-
ture Reserve in Ninaxia were detected , including resistance to salt , acid-alkali , temperature variation and intrinsic an-
tibiotics.The results indicated that 70.8% strains could tolerate NaCl stress at 4% concentration.All of the strains
could tolerate Amp stress at 100μg/mL as well as could grow at a range of pH from 5 ～ 11.Strains CNXE4 , CNXLW24
and CNXC3 had high resistance , they could grow at pH from 4 ～ 12 , could tolerate 6% concentration NaCl , 50μg/mL
KM and SM , 300 μg/mL AMP , and could grow after being exposed to 60℃for 10min.The methods of 16S rDNA PCR
-RFLP and 16S rDNA sequencing were used to analysis the diversity and phylogenesis of 62 rhizobia strains.The results
revealed that all the tested strains belonged to the genus of Rhizobium , Sinorhizobium , Agrobacterium , Phyllobacterium
and Bradyrhizobium.The rhizobia isolated from Caragsana spp.showed a rich genetic diversity .
Keywords:Caragsana spp.;rhizobia;stress resistance;phylogenesis
227第 4期　　 　　　　代金霞等:荒漠植物柠条根瘤菌的抗逆性及其系统发育分析