全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2015 年
收稿日期：2015－08－14
基金项目：国家自然科学基金项目（31402130；30871819）
作者简介：熊军波（1982－），男，湖北天门人，副研究员，博士，主要从事牧草遗传育种研究，（电话）13147190015（电子信箱）jbx9715＠126．com；
通信作者，刘 洋，研究员，主要从事牧草种质资源收集和遗传育种研究，（电子信箱）liuyang430209＠126．com。
第 54 卷第 21期
2015年 11月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 54 No.21
Nov.，2015
l． .
.
根据联合国粮食与农业组织 （Food and Agri-
culture Organization）的估算，全世界约有 3 400 万
hm2（灌溉面积的 11％）受到不同程度的盐渍化影
响 ［1］。 据农业部组织的第二次全国土壤普查资料统
计，我国现有盐渍土的面积为 0．35亿 hm2（不包括滨
海滩涂），其中已开垦种植的为 576．84 万 hm2。 盐渍
化土壤中高浓度的盐离子会对植物的正常生理代
谢产生影响，如水分缺失、离子毒害、营养失衡、氧
化胁迫等，从而导致植物生长减缓，甚至死亡 ［2］。 土
壤盐渍化大大限制了作物生产， 威胁到粮食安全，
研究作物抗盐机制，提高作物抗盐能力，是全球农
业发展的重要方向。
紫花苜蓿（Medicago sativa L．）为豆科苜蓿属多
年生草本植物，是世界上栽培种植利用最为广泛的
人工牧草，素有“牧草之王”和“饲料皇后”的美称。
紫花苜蓿属于中等耐盐碱植物， 在电导率范围为
2．0 dS ／ m 和渗透压在 1．5 bars 内的土壤中能正常生
长，超过此范围，电导率每上升一个单位，产量下降
7％［3］。 生理生化研究表明，紫花苜蓿可以通过改变
外在形态、加强活性氧胁迫保护、合成渗透物、离子
选择吸收、隔离和外排、改变细胞壁和细胞膜结构
等措施以适应盐胁迫［4］。 这些适应性调节机制与盐
胁迫下紫花苜蓿基因网络的特异性表达密切相关，
采用各种高通量技术，已鉴定出大量盐胁迫响应基
紫花苜蓿根响应盐胁迫的比较蛋白质组学分析
熊军波 1，杨青川 2，蔡 化 1，田 宏 1，张鹤山 1，刘 洋 1
（1．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 431700；2．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100194）
摘要：6 d 龄紫花苜蓿（Medicago sativa L．）幼苗在 0、200 mmol ／ L NaCl 处理 9 d 后，采用双向电泳分别分
离了其根部蛋白组。 最终每块胶中有超过 900 个蛋白质点被分离，采用 MALDI－TOF－TOF ／MS 质谱技术
结合 MASCOT 软件在线检索，成功鉴定 21 个表达量发生 1．5 倍以上变化的蛋白质点，为 19 种不同的蛋
白质。 生物信息学分析表明，这些差异表达蛋白质主要参与胁迫防御、碳水化合物和能量代谢、次生代
谢、转录和翻译调控、信号传导和离子转运等调控途径。
关键词：紫花苜蓿（Medicago sativa L．）；盐胁迫；根；蛋白质组
中图分类号：S551＋．7 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）21－5422－07
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.057
Comparative Proteomic Analysis of Salt－stress Response of Alfalfa Proteins in Root
XIONG Jun－bo1，YANG Qing－chuan2，CAI Hua1，TIAN Hong1，ZHANG He－shan1，LIU Yang1
（1．Institute of Animal Science， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 431700， China；2．Institute of Animal Science of Beijing，
Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100194， China）
Abstract： 6 day old alfalfa （Medicago sativa L．） seedlings were exposed to 0（control），and 200 mmol/L NaCl for 9 days． Pro-
teins extracted from the root of alfalfa seedlings were separated by two－dimensional gel electrophoresis（2－DE）． More than 900
protein spots were detected on each gel，and 21 spots at least one point five－fold differences in abundance were identified by
matrix－assisted laser desorption ionization time－of－flight ／ time－of－flight mass spectrometry （MALDI－TOF－TOF ／MS） and MASCOT
online． Bioinformatics analysis induced that these proteins were associated with a variety of functions，including stress defense，
carbohydrate and energy metabolism，secondary metabolism，transcription and translation related，signaling and ion transport．
Key words：alfalfa（Medicago sativa L．）； salt－stress；root； proteomic
第 21 期
因［5，6］。 然而，这些研究都是基于转录水平的差异表
达来寻找胁迫应答基因，mRNA 只是基因行使功能
的中间载体，而蛋白质才是执行各种生命活动的主
体，且研究表明，蛋白质的表达水平和 mRNA 水平
间相关性不强，因此有必要从蛋白质水平对紫花苜
蓿响应盐胁迫的调节机制进行研究。 近年来，国内
外研究者采用蛋白质组学的方法对超过 34 种植物
的抗盐胁迫蛋白质组学进行了研究，并成功鉴定出
大量盐胁迫响应蛋白质［7］。 根系是植物感受多种胁
迫伤害的最初位点，对根系响应盐胁迫的研究有助
于更深入地了解盐胁迫的调节机制。 本研究以紫花
苜蓿根系为研究对象，对根响应盐胁迫的比较蛋白
质组学进行分析，以期更深入地揭示紫花苜蓿响应
盐胁迫的调节机制。
1 材料与方法
1．1 试验材料
紫花苜蓿“中苜一号”种子由中国农业科学院
畜牧研究所牧草研究室提供。 挑选籽粒饱满、无病
虫害种子，用 1％次氯酸钠溶液消毒 5 min，然后用
蒸馏水冲洗 3 次。 清洗的种子用蒸馏水浸种 12 h
后，放置于湿润的滤纸中培养 3 d。 之后将幼苗移入
1/2 Hoagland 营养液进行水培，6 d 后开始胁迫。 将
培养的幼苗分为两组： 一组在 1/2 Hoagland 营养液
中培养； 另一组在 1/2 Hoagland 营养液中添加 50
mmol/L NaCl 适应生长 24 h，其后放入终浓度为 200
mmol/L NaCl 的 1/2 Hoagland 营养液培养。 每两天
更换一次培养液，期间不定时搅拌，培养 9 d 后同时
收割两组苜蓿根部，液氮保存。
1．2 药品与试剂
固相 pH 梯度干胶条（pH 4－7）、IPG buffer、2D
clean－up 试剂盒、2D－Quant 试剂盒、尿素（Urea）、甘
氨酸、CHAPS、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯
酰胺 （Bis－Acrylamide）、过硫酸铵 （AP）、甘油 （glyc-
erol），干胶条覆盖液，均购至 Amersham Biosciences
公司；碘乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）、四甲基乙二胺
（TEMED）购自 Sigma 公司；溴酚蓝、蛋白 Marker、碳
酸钠、乙酸钠、硫代硫酸钠、EDTA 二钠盐、十二烷基
磺酸钠 （SDS）、 低熔点琼脂糖购自 BBI （Bio Basic
Inc，加拿大）；其他试剂为国产分析纯。 所有溶液均
用 Milli－Q 制备的纯水配制。
1．3 总蛋白质的提取和定量
蛋白质提取方法参照文献［8］，部分进行调整。
称取 0．5 g 样品液氮研磨后，转入离心管加入 3 mL
TRIzol （2％ DTT）， 振荡混匀，添加 0．6 mL 氯仿，振
荡混匀，放置 5 min；4 ℃，15 000 r ／ min 离心 10 min，
去上清，添加 0．9 mL 无水乙醇，振荡混匀，放置 5
min；4 ℃，15 000 r ／ min，离心 5 min，取上清 ，加入
4．5 mL 异丙醇 ，振荡混匀 ，4 ℃放置 5 min；此后 4
℃，15 000 r ／ min 离心 10 min， 去溶液， 用 6 mL 含
300 mmol ／ L盐酸胍的 95％乙醇洗涤沉淀 3 次；4 ℃，
15 000 r ／ min 离心 10 min，留沉淀，用 6 mL 无水乙
醇洗涤一次，冷冻干燥。 其后加入裂解液［8Murea，
2％ CHAPS （W/V），1％DTT （W/V），0．5％ IPG buffer
（V/V）（pH 4～7）和 0．002％ Bromophenol blue（W/V）］，
超声 20 min促溶，4 ℃静置 4 h以上，离心沉淀（4 ℃，
40 000 r ／ min，1 h），吸取上清备用。 使用 Amersham
公司 2D－Quant 试剂盒对蛋白质进行定量分析，步
骤按试剂盒说明进行。
1．4 等电聚焦电泳和 SDS－PAGE电泳
使用水化液 ［8Murea，2％ CHAPS （W/V），1％
DTT （W/V），0．5％ IPG buffe （V/V） （pH 4 ～7）和
0．002％ Bromophenol blue（W/V）］稀释蛋白质溶液，
最终将 120 mg/450 mL 蛋白质溶液上样到 24 cm pH
4～7 IPG 胶条上。 等电聚焦在 Ettan IPGphor II （GE
Healthcare）仪器上进行，温度设置为 20 ℃，程序为：
30 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000
V，2 h；8 000 Vh 到 40 000 Vh。等电聚焦后胶条立即
平衡，首先在含有平衡液［6 mol ／ L urea， 30％ glyc-
erol（W/V），2％SDS （W/V），50 mmol ／ L Tris－HCl，pH
8．8，1％ DTT（W/V）］的平衡液管中水平放置 15 min，
其后换入含有平衡液的管中水平放置 15 min。 平衡
后的胶条转移到 12％的 SDS－PAGE 凝胶中进行二
向分离，首先在电泳液［250 mmol/L Tris－base，1．92
mol/L glycine 和 1％ SDS（W/V）］中 0．2 W ／ strip 运行
1 h，其后相同环境中使用 15 W/strip运行到结束。每
组试验设置 4次组内重复。
1．5 蛋白染色和图像分析
凝胶选用银染，方法参照 GE handbook 做适当
修改。凝胶首先在含有 40％乙醇，10％乙酸的水溶液
中固定 1 h，其后使用含有 30％乙醇，0．2％硫代硫酸
钠（W/V）和 6．8％乙酸钠溶液中敏化 30 min。经超纯水
漂洗 3次，每次 5 min；后转入含有 2．5 g ／ L 的硝酸银
溶液中银染 20 min，其后使用超纯水漂洗 2次，每次
1 min；转入显色液（25 g/L 碳酸钠，240 ml/L 甲醛）中
显色 2次，第 1次 1 min，第 2次 4 min。 反应完后转
入含有 1．46％的 EDTA 溶液中 10 min 终止反应，最
后使用纯水漂洗 3次，每次 5 min。 染色完成的胶用
Powerlook 2100XL扫描仪扫描，并使用ImageMasterTM
2D Platinum 6．0 软件分析，包括凝胶图像的背景消
除、点确认、定量和点的匹配等，选取蛋白质差异达
1．5 倍以上的蛋白质点进行质谱分析。
熊军波等：紫花苜蓿根响应盐胁迫的比较蛋白质组学分析 5423
湖 北 农 业 科 学 2015 年
1．6 蛋白质谱鉴定和分类分析
根据 ImageMaste 分析软件结果挖取差异蛋白
质点，委托北京华大基因公司进行基质辅助激光解
吸 ／电离飞行时间串联质谱（MALDI－TOF－TOF ／MS）
分析。将所得到的肽片段质量数据运用 MASCOT软
件进行在线检索 （http：//www．matrixscience．com），选
取 NCBI 数据库作为检索数据库。 鉴定成功的蛋白
质点根据 aimGo 数据库 （http：//www．geneontology．
org/）功能注释进行分类统计。
2 结果与分析
2．1 双向电泳凝胶图谱分析和质谱鉴定
分别提取对照组和处理组紫花苜蓿根部蛋白
质进行双向电泳，经银染后最终电泳图谱见图 1。基
于 ImageMaster 图像软件分析表明， 对照组凝胶蛋
白质点有（957±35）个，而处理组（200 mmol ／ L NaCl
处理）凝胶上蛋白质有（935±27）个，两个试验组内
变异系数都在 5％以内。 软件匹配和手工匹配相结
合，最终处理组和对照组间有 725 个蛋白质点成功
匹配。 选取相对丰度（vol％）发生 1．5 倍改变的点为
差异表达蛋白质点，结合 MALDI－TOF－TOF ／MS 分
析，Mascot 软件搜索 NCBInr 数据库 Green Plants，
最终成功鉴定出 21 个蛋白质点，为 19 种不同的蛋
白质（表 1）。
2．2 差异表达蛋白质的功能分类
基于质谱结果， 将这些蛋白的功能分为以下
五大类。
Ⅰ类：胁迫防御类蛋白，共有 4个蛋白质点。 谷
胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，spot 3）、
2 个抗坏血酸过氧化物酶 （Ascorbate peroxidase，
spot 8，18）、 病原相关蛋白 2 （Pathogenesis－related
protein 2，spot 12）。
Ⅱ类：碳水化合物和能量代谢，共 4 个蛋白质
点。 线粒体苹果酸脱氢酶 （Malate dehydrogenase
mitochondrial，spot 6）、甘油醛－3－磷酸脱氢酶（Glyc-
eraldehyde 3 －phosphate dehydrogenases，spot 14）、
线粒体 ATP 合酶 β 支链 2（ATP synthase bate chi-
na 2 mitochondrial，spot 1）、核苷二磷酸激酶 1（Nu-
cleoside diphosphate kinase 1，spot 21）。
Ⅲ类：次级代谢，共 5个蛋白质点。 异甘草黄苷
2′－甲基转移酶（Isoliquiritigenin 2′－O－methyltrans-
ferase，spot 7）、查尔酮还原酶（Chalcone reductase，
spot 13）、3－异丙基苹果酸脱氢酶（3－Isopropylmalate
dehydrogenase，spot 16）、 异黄酮还原酶（Isoflavone
reductase，spot 11）；乙醇脱氢酶（Alcohol dehydroge-
nase，spot 17）。
Ⅳ类：转录、翻译和调节类蛋白，共 4 个蛋白质
点。真核转录起始因子 5A－2（Eukaryotic translation
initiation factor 5A－2，spot 4）、 热激蛋白 70 （Heat
shock protein 70，spot 5）、RNA 结合蛋白 （RNA－
binding protein，spot 9）、mRNA 结合蛋白前体（mR-
NA binding protein precursor，spot10）。
Ⅴ类：信号传导和离子转运相关蛋白，共 3 个
蛋白质点。 液泡膜联蛋白 VCaB42（Vacuole－associ-
ated annexin VCaB42，spot 15）、 膜联蛋白（Annex-
in，spot 19）、 细胞质膜 H＋－ATP 酶 （Plasma mem-
brane H＋－ATPase，spot 2）。
箭头所指为差异表达蛋白和编号；A，对照组（0 mmol ／ L NaCl）；B，处理组（200 mmol ／ L NaCl）
图 1 紫花苜蓿幼苗 0、200 mmol ／ LNaCl 胁迫处理 9 d 后根蛋白质组双向电泳图谱
96.4 KDa
45.0 KDa
33.0 KDa
20.0 KDa
4 pI 7
A
96.4 KDa
45.0 KDa
33.0 KDa
20.0 KDa
B
21
5 6
4
21
7
8 9
10
11 12
13
14
15 16 17
18
19 20
7
8 9
10
11 12
13
14
15 16 17
18
1920
5
4
21 6
3
3
21
5424
第 21 期
表 1 盐胁迫下紫花苜蓿根中差异表达蛋白的串联质谱鉴定结果
编
号 a
8
3
18
12
6
14
1
21
17
16
13
11
5
10
4
9
19
15
2
匹配蛋白质
抗坏血酸过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶
病原相关蛋白 2
线粒体苹果酸脱氢酶
甘油醛 3-磷酸脱氢酶
线粒体 ATP 合酶β 支链 2
核苷二磷酸激酶 1
乙醇脱氢酶
3-异丙基苹果酸脱氢酶
查尔酮还原酶
异黄酮还原酶
热激蛋白 70
mRNA 结合蛋白前体
真核转录起始因子 5A-2（eIF－5A－2）
RNA 结合蛋白
膜联蛋白
液泡膜联蛋白 VCaB42
质膜 H+-ATP 酶
植物
种类 b
紫花苜蓿
蒺藜苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
拟南芥
拟南芥
豌豆
康乃馨
拟南芥
紫花苜蓿
紫花苜蓿
黄瓜
番茄
海岛棉
拟南芥
欧亚花葵
烟草
大麦
NCBI
登录号 c
16304410
355524544
16304410
22266001
32328905
15229231
18415911
134667
33149683
121343
563540
19620
1143427
26453355
45644510
21593201
4580920
4580920
15149829
理论分子量
/等电点 d
20.1/5.3
21.3/7.6
20.1/5.3
16.5/5.8
48.6/6.5
39.0/6.69
73.0/5.81
16.4/5.94
41.9/6.57
46.6/6.0
35.0/6.5
35.5/5.3
75.3/5.1
44.0/7.1
17.2/5.2
42.7/7.71
36.0/5.34
36.2/6.06
70.9/8.6
实验分子量
/等电点 e
34.7/4.3
11.7/4.6
40.1/4.2
23.7/5.6
18.7/6.9
5.6/22.3
12.0/4.4
95/6.5
38.1/6.4
38.0/6.0
42.1/6.6
38.5/4.7
15.3/6.6
35.6/4.5
21.3/5.6
34.2/4.4
44.7/5.3
37.7/5.7
16.4/5.2
匹配肽
段数 g
6
5
5
9
7
7
4
5
6
4
6
5
4
3
5
5
5
4
3
分
数 f
99
76
81
344
97
87
75
69
79
104
111
129
75
93
75
85
121
135
91
相对表达量 h
CK 200 mmol/L
熊军波等：紫花苜蓿根响应盐胁迫的比较蛋白质组学分析 5425
湖 北 农 业 科 学 2015 年
3 讨论
3．1 胁迫防御类蛋白
生物正常的生理代谢过程，如光合成、光呼吸、
脂肪酸氧化和衰老等都会产生活性氧 （Reactive
oxygen species，ROS）， 但当生物和非生物产生胁迫
时，将引发 ROS 的迸发。 ROS 具有多种功能，一方
面，低水平的 ROS 可作为信号传导分子，调控植物
生长发育、细胞周期以及细胞程序化死亡、激素合
成、生物或非生物的胁迫应答等；另一方面，过量
ROS 可导致蛋白质、 膜脂和其他细胞组分的损伤，
对植物的生长产生危害［9］。 植物体内有多种 ROS清
除机制，以维持体内正常的 ROS水平。在本研究中，
3 个过氧化物类酶表达量上调， 其中包括 2 个抗坏
血酸过氧化物酶（APX，8、18 号）和 1 个谷胱甘肽过
氧化物酶（GPX，3 号）。 APX 和 GPX 分别以抗坏血
酸和谷胱甘肽作为底物， 与 H2O2的亲合力较强，是
植物体 H2O2重要的清除剂。 APX 催化 H2O2还原反
应中产生的单脱氢抗坏血酸，通过谷胱甘肽还原酶
途径被还原为抗坏血酸，而还原型谷胱甘肽作为还
原剂参与抗坏血酸的再生，产生的氧化型谷胱甘肽
可以通过谷胱甘肽还原酶得到还原， 形成抗坏血
酸－谷胱甘肽循环（Ascorbate－glutathione cycle），是
植物清除 H2O2的最主要途径。 有研究认为，活性氧
清除机制是植物抗盐碱机制的重要组成部分［10］。 在
本研究中活性氧清除蛋白质在盐胁迫下表达量均
上升， 这有利于清除盐胁迫引起的活性氧迸发，维
持苜蓿细胞内部环境的稳定。
在本研究中还发现了病原相关蛋白 2（Patho-
genesis－related protein 2，PR2） 在盐胁迫下表达量
上升。 病原相关蛋白是一类由真菌、细菌和病毒等
病原体入侵诱导产生的抗逆性蛋白质，根据作用和
功能的不同将其分为 17 个家族， 本研究中鉴定的
差异表达蛋白 PR2 属于 β－1，3－葡聚糖酶家族，其
以探明的功能包括水解真菌性病原菌的细胞壁，参
与植物生长发育的各个阶段的调控 ［11］。 在拟南芥
（Arabidopsis thaliana）中发现盐胁迫下 PR5 蛋白质
表达量下降 ， 而在抗盐碱能力相对较强的盐芥
（Thellungiella halophila）中，盐胁迫下 PR5 蛋白质
表达量下降 ［12］，这表明部分 PR 蛋白质也参与到盐
胁迫调节。在此前的研究中还未发现 PR2与盐胁迫
响应相关，其功能还有待深入研究。
3．2 参与碳水化合物和能量代谢的相关蛋白
植物生长发育过程中需要大量的能量以维持
体内正常的生理代谢，这些能量主要通过碳水化合
物代谢，如糖酵解（Embden－Meyerhof－Parnas path-
way，EMP） 和三羧酸循环 （Tricarboxylic acid cycle，
TCA）产生。 在本研究中，甘油醛－3－磷酸脱氢酶（glyc-
eraldehyde 3 －phosphate dehydrogenase，GAPDH，14
号）在盐胁迫下表达量上升。GAPDH是糖酵解、糖异
生和卡尔文循环过程中的关键酶， 催化甘油醛－3－
磷酸形成 1，3－二磷酸甘油酸的可逆反应，是糖酵解
（糖异生）中惟一的氧化（还原）反应。 此前对水稻的
研究表明， 抗盐碱性水稻的材料中 GAPDH 蛋白表
达量显著高于敏盐性材料，表明 GAPDH的高表达可
能与水稻抗盐碱相关 ［13］。 另有研究表明，非磷酸化
GAPDH（NP－GAPDH）可催化糖酵解“旁路”反应，催
化依赖于 NADP＋， 将 3－磷酸甘油醛氧化为 3－磷酸
甘油酸，同时伴有 NADPH生成的不可逆反应［14］。盐
胁迫下，GAPDH 的表达量上升一方面可为机体合
成代谢提供还原力 NADPH，维持胞质中 NADPH 的
水平，另一方面在磷饥饿或 ADP 水平低下而无法合
成 ATP 时，可以使碳源顺利流经糖酵解途径，保证
逆境条件下碳源流的通畅［15］。 本研究中，GAPDH在
盐胁迫下表达量上升可能是苜蓿适应盐胁迫的调
节机制。
线粒体是植物生成能量的主要细胞器，在本研
究中鉴定出 2 个线粒体内蛋白质表达量发生改变。
线粒体苹果酸脱氢酶属于 NAD－依赖性 MDH，其为
三羧酸循环循环中的关键酶，催化苹果酸与草酰乙
酸之间的可逆转换，生产 ATP，为机体提供能量 ［16］。
线粒体 ATP 合成酶参与氧化磷酸化和光合磷酸化，
在跨膜质子动力势的推动下合成 ATP，将能量用于
合成生物中的能量通货－ATP 的能量转换。 这 2 个
蛋白表达量的下降从一个侧面表明了盐胁迫下，紫
花苜蓿能量代谢减缓，这与盐胁迫下光合作用受阻
而导致碳水化学物合成减少相关。 此外研究还鉴定
出 1 个核苷二磷酸激酶 1（NDPK1）在盐胁迫下表达
量降低。 NDPK 被称为 ATP 的管家酶，维持细胞中
CTP、GTP、UTP 的水平。 在植物中 NDPK 已被证明
参与干旱、寒害、热和盐胁迫的抗逆中，在水稻小穗
期响应盐胁迫的蛋白质研究中鉴定出该蛋白表达
量下调［17］。
3．3 次生代谢相关蛋白质
植物在多条代谢途径中都会产生乙醇，但当特
定外界胁迫时会导致体内乙醇积累，过量乙醇聚合
成高活性的有毒分子， 攻击细胞内亲核物质如核
酸、蛋白和碳水化合物等，最终危害到植物的正常
生长［18］。 乙醇脱氢酶（ADH，17 号）是植物体内主要
短链醇代谢的关键酶，生理学功能为催化伯醇和醛
之间的可逆反应。有研究表明，ADH的表达与干旱、
低温、病原菌入侵等生物逆境的应答相关 ［19］。 在本
5426
第 21 期
研究中，ADH 在盐胁迫下表达量下降， 这与此前在
水稻中的研究观察到的结果相反 ［20］，这可能与胁迫
浓度和植物自身的抗盐碱差异性相关。
类黄酮化合物是植物合成的一类重要次生代
谢产物，目前已知化学结构的有 6 000 多种，在植物
生长发育中发挥着重要作用 ［21］。 近期研究表明，类
黄酮化合物还参与植物的胁迫防御中，如植物受微
生物侵染时其作为植保素在植物体内积累，或作为
植物体内活性氧的脱毒系统［22，23］。 在鉴定的差异表
达蛋白中有 2 个蛋白质与类黄酮代谢途径相关，其
中包括查尔酮还原酶 （13 号） 和查尔酮还原酶（11
号）。 查尔酮还原酶是查尔酮合成类黄酮代谢分支
的第一步催化酶。 查尔酮还原酶是合成植物抗毒素
类异黄酮的重要酶。 本研究中，这 2 个蛋白质表达
量都呈现出下降的趋势，这表明盐胁迫下，类黄酮
合成代谢减缓。
在鉴定的蛋白质中，3－异丙基苹果酸脱氢酶
（16 号）表达量下升，该蛋白质为异亮氨酸合成蛋氨
酸过程中的催化蛋白酶。 已有研究表明，异亮氨酸
也是苜蓿抗渗透胁迫的因子［24］。 本研究中该蛋白质
表达量下调，有利于异亮氨酸的积累，可能是紫花
苜蓿渗透调节机制之一。
3．4 参与转录调控，蛋白质合成和代谢类的蛋白质
植物感受到外界环境刺激，通过特定的受体将
这一信号传递到细胞核，并诱导相关基因的表达来
适应外界环境，在这过程中，受到复杂的转录、翻译
和剪切修饰等调控。 在鉴定的差异表达蛋白质中，
有 3 个蛋白质参与到转录起始和转录调控，其中包
括 1 个真核转录起始因子 5A－2（eIF－5A－2，4 号）和
2 个 RNA 结合蛋白质。 eIF－5A 是普遍存在于真核
生物和原始细菌中的转录启始因子。 已有研究表
明，eIF－5A 与细胞中的许多生命活动有关， 如细胞
增殖、蛋白质翻译、mRNA 降解、细胞周期的转化及
细胞衰老与凋亡等 ［25］。 对拟南芥 eIF－5A 家族成员
的分析表明，不同的家族成员参与的转录调控与植
物不同的生理防御相关， 其中 eIF－5A－2 参与拟南
芥受到病毒感染和伤害后的信号传导，以及通过细
胞分裂素信号通路调控拟南芥根木质部的发育，在
细胞的分裂、生长和死亡中发挥着重要作用 ［24］。 在
本研究中，eIF－5A－2 在盐胁迫下表达量上升， 表明
其表达与盐诱导相关。
基因表达的转录调控中每一步都需要大量的
RNA 结合蛋白质和 RNA 相互作用来起稳定、保护、
组装和转移等作用。 近年来的研究表明，一些 RNA
结合蛋白质参与动植物各种胁迫调控并发挥着重
要生理功能， 如富含甘氨酸 RNA 结合蛋白质调控
植物逆境诱导反应， 许多逆境因子， 包括冷害、致
伤、干旱、过敏和水逆境等均能诱导其表达量发生
变化［26］。在本研究中 mRNA结合蛋白质（10号）在盐
胁迫下表达量下降，而 RNA 结合蛋白质（9 号）表达
量则上升，表明盐胁迫下紫花苜蓿在转录水平存在
差异性调节机制。
盐胁迫会导致植物体内蛋白质错误折叠增加，
重新建立正常的蛋白质折叠、构象对维持细胞内稳
态尤为重要。 热激蛋白 70（Hsp70）是重要的分子伴
侣，在维持蛋白质构象、阻止蛋白质聚合、重折叠变
性蛋白质以及协助错误折叠蛋白质的降解等方面
发挥着重要作用 ［27，28］。 在本研究中，Hsp70（5 号）在
盐胁迫下表达量上升，这对维持体内蛋白质正常的
生理功能有重要意义。
3．5 信号传导和离子转运相关蛋白
Ca2＋是植物体内重要的信号分子， 在受到多种
胁迫时都会诱导细胞基质中 Δ［Ca2＋］cyt，特定的膜联
蛋白质（Annexins）通过结合 Δ［Ca2＋］cyt 而进行信息
传递［29］。Annexins 是一个多基因蛋白质，属于 Ca2＋依
赖性的磷脂结合蛋白质家族成员，通过与磷脂的结
合以及与钙离子的相互作用参与到各种膜有关的
过程，其中包括信号传导、自由基清除、DNA 复制和
细胞凋亡等过程。 目前，最少有 3 条线支持这一结
论的证据：各种生物胁迫都会诱导 Annexins 表达量
发生改变；改变某些 Annexins 的表达量将改变植物
对非生物胁迫的耐受性；Annexins 可能直接参与调
节胁迫激活信号通路 ［30］。 在本研究中，鉴定出 2 个
膜联蛋白质表达量上升，分别为膜联蛋白质和液泡
膜联蛋白 VCaB42， 这表明盐胁迫下紫花苜蓿信号
传导发生改变。
将 Na＋转运到液泡，减少细胞质中 Na＋离子浓度
是植物抗盐胁迫的重要机制之一。在本研究中细胞质
膜 H＋－ATP 酶（15 号）表达量上升。 质膜 H＋－ATPase
主要作用是形成跨膜的质子梯度， 驱动 Na＋/H＋逆向
转运蛋白质主动运输， 进而将 Na＋区隔在液泡中，减
少对细胞器的毒害［31］。盐胁迫下，该蛋白质表达量上
升有助于降低细胞基质中盐离子的浓度，从而减小
盐离子对植物的危害。
4 结论
根是植物感受多种胁迫伤害的最初位点，根对
胁迫的敏感程度直接关系到植物的生长，对根系响
应盐胁迫的研究有助于更深入了解盐胁迫的调节
机制。 在本研究中，鉴定出 19个不同的蛋白质表达
量发生改变， 其中包括 14 个表达上调蛋白质，5 个
表达下降蛋白质。 这些蛋白质中大部分蛋白质都是
熊军波等：紫花苜蓿根响应盐胁迫的比较蛋白质组学分析 5427
湖 北 农 业 科 学 2015 年
功能已知的蛋白质，此前在其他物种抗盐碱胁迫中
也鉴定出， 部分蛋白质在此前研究中未见报道，其
具体功能还有待进一步验证。 本研究为深入揭示紫
花苜蓿响应盐胁迫的调节机制奠定了基础，也为挖
掘紫花苜蓿潜在抗盐碱基因提供了数据。
参考文献：
［1］ FAO．The state of the world’s land and water resources for
food and agriculture （SOLAW）-Managing systems at risk ［EB ／
OL］．London：The Food and Agriculture Organization of the U-
nited Nations and Earthscan． http：//www．fao．org/docrep/015/i1688e ／
i1688e00．pdf，2011.
［2］ VINOCUR B，ALTMAN A． Recent advances in engineering
plant tolerance to abiotic stress： Achievements and limitations
［J］． Current Opinion in Biotechnology，2005，16（2）：123－132．
［3］ MAAS E， HOFFMAN G． Crop salt tolerance： Evaluation of
existing data ［A］． In： Managing Saline Water for Irrigation
Proceedings of the International Salinity Conference Ed HE
Dregne［C］： 1977． 187－198．
［4］ LIMAMI A M， RICOULT C， PLANCHET E， et al． Response
of Medicago truncatula to abiotic stress［EB ／ OL］．http：//www no-
ble org ／ MedicagoHandbook，2007-06-15.
［5］ POSTNIKOVA OA， SHAO J， NEMCHINOVL G. Analysis of
the alfalfa root transcriptome in response to salinity stress ［J］．
Plant ＆ cell physiology， 2013， 54（7）：1041－1055．
［6］ JIN H， SUN Y， YANG Q， et al． Screening of genes induced
by salt stress from Alfalfa［J］． Molecular Biology Reports，2010，
37（2）：745－753．
［7］ ZHANG H， HAN B， WANG T， et al． Mechanisms of plant
salt response： insights from proteomics［J］． J Proteome Res，2012，
11（1）：49－67．
［8］ XIONG J， YANG Q， KANG J， et al． Simultaneous isolation
of DNA， RNA， and protein from Medicago truncatula L ［J］．
Electrophoresis，2011，32（2）：321－330．
［9］ LALOI C， APEL K， DANON A． Reactive oxygen signalling：
The latest news［J］． Current Opinion in Plant Biology，2004，
7（3）：323－328．
［10］ ABOGADALLAH G M． Antioxidative defense under salt stress
［J］． Plant Signal Behav， 2010， 5（4）：369－374．
［11］ BORAD V， SRIRAM S． Pathogenesis－related proteins for the
plant protection［J］． Asian J Exp Sci， 2008， 22（3）：189－169．
［12］ PANG Q， CHEN S， DAI S， et al． Comparative proteomics of
salt tolerance in Arabidopsis thaliana and Thellungiella
halophila［J］．Journal of Proteome Research，2010， 9（5）：2584－
2599．
［13］ LIU C W， CHANG T S， HSU Y K， et al． Comparative pro-
teomic analysis of early salt stress－responsive proteins in roots
and leaves of rice［J］． Proteomics， 2014， 14（15）：1759－1775．
［14］ 卢 倩，弭晓菊，崔继哲．植物甘油醛－3－磷酸脱氢酶作用机制
的研究进展［J］．生物技术通报，2013，12（8）：1－6．
［15］ RIUS S P， CASATI P， IGLESIAS A A， et al． Characteriza-
tion of Arabidopsis lines deficient in GAPC －1， a cytosolic
NAD －dependent glyceraldehyde －3 －phosphate dehydrogenase
［J］． Plant Physiology， 2008， 148（3）：1655－1667．
［16］ 汪新颖，王 波，侯松涛，等．苹果酸脱氢酶的结构及功能［J］．生
物学杂志，2009，26（4）：69－72．
［17］ TANG L， KIM M D， YANG K S， et al． Enhanced tolerance
of transgenic potato plants overexpressing nucleoside diphos-
phate kinase 2 against multiple environmental stresses ［J］．
Transgenic Research， 2008， 17（4）：705－715．
［18］ SCHAUENSTEIN E， ESTERBAUER H， ZOLLNER H． Alde-
hydes in biological systems［M］． London： Pion， 1977.
［19］ 石之光，叶 磊，巩鹏涛，等．乙醇脱氢酶（ADH）家族生物信息
学分析［J］．基因组学与应用生物学，2009，28（3）：429－432．
［20］ SENGUPTA S，MAJUMDER A L．Insight into the salt tolerance
factors of a wild halophytic rice，Porteresia coarctata：A physi-
ological and proteomic approach ［J］．Planta，2009，229（4）：911－
929．
［21］ 邹凤莲，寿森炎，叶纨芝，等．类黄酮化合物在植物胁迫反应中
作用的研究进展［J］．细胞生物学，2004，26（1）：39－44．
［22］ LIN C M，CHEN C T，LEE H H，et al． Prevention of cellular
ROS damage by isovitexin and related flavonoids ［J］． Planta
Medica，2002，68（4）：365－367．
［23］ PICMAN A K，SCHNEIDER E F，PICMAN J．Effect of flavonoids
on mycelial growth of Verticillium albo－atrum［J］． Biochemical
Systematics and Ecology，1995，23（7）：683－693．
［24］ FENG H， CHEN Q， FENG J， et al． Functional characteriza-
tion of the Arabidopsis eukaryotic translation initiation factor
5A－2 that plays a crucial role in plant growth and develop-
ment by regulating cell division， cell growth， and cell death
［J］． Plant Physiology， 2007， 144（3）：1531－1545．
［25］ 时广红，王彦珍，魏建华 ．eIF－5A 与 DHS 功能研究及应用进
展［J］．生物技术通报，2009，21（5）：21－26．
［26］ 陈 璇，李文正，邵 岩，等 ．动植物中 RNA 结合蛋白的研究
进展［J］．生物技术通报，2007，25（3）：9－15．
［27］ WANG W，VINOCUR B，SHOSEYOV O，et al． Role of plant
heat－shock proteins and molecular chaperones in the abiotic
stress response［J］． Trends in Plant Science 2004，9（5）：244－
252．
［28］ HARTL F U．Molecular chaperones in cellular protein folding
［J］． Nature，1996，381（6583）：571－579．
［29］ MORTIMER J C，LAOHAVISIT A，MACPHERSON N，et al．
Annexins：Multifunctional components of growth and adaptation
［J］．Journal of Experimental Botany，2008，59（3）：533－544．
［30］ KONOPKA－POSTUPOLSKA D，CLARK G，GOCH G，et al．The
role of annexin 1 in drought stress in Arabidopsis ［J］．Plant
Physiology，2009，150（3）：1394－1410．
［31］ SHI H，QUINTERO F J，PARDO J M，et al．The putative plas-
ma membrane Na ＋ ／ H＋ antiporter SOS1 controls long－distance
Na＋ transport in plants［J］．The Plant Cell Online，2002，14（2）：
465－477．
（责任编辑 赵 娟）
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