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五加皮杨梅树皮及其复方制剂药对小鼠抗疼痛效果的研究



全 文 :书收稿日期:2011-05-29; 修订日期:2011-12-15
基金项目:河北省科学技术研究与发展课题(No. 0527611002)
作者简介:余 红(1966-) ,女(汉族) ,湖北蕲春人,现任河北联合大学基
础医学院教授,硕士学位,主要从事临床药理研究工作.
* 通讯作者简介:韩淑英(1957-) ,女(蒙古族) ,内蒙古通辽人,现任河北
联合大学基础医学院教授,硕士学位,主要从事糖尿病并发症研究工作.
五加皮杨梅树皮
及其复方制剂药对小鼠抗疼痛效果的研究
余 红1,郑 冬2,蔡 健2,李望田2,杨 静2,胡方芳2,Muhammad Naeem3,韩淑英1*
(1.河北联合大学基础医学院,河北 唐山 063000;
2.河北联合大学心理学院 2009 级学生,河北 唐山 063000;
3.河北联合大学 2008 级国际留学生,河北 唐山 063000 )
摘要:目的 探讨五加皮、杨梅树皮及其复方制剂药对小鼠机体功能状况的作用及其机制。方法 采用对比法,对小鼠给
以镇痛药物之后再给以冰醋酸致痛,观察其对急性疼痛的感受,扭体频数的观察;最后颈椎脱臼法处死,取小鼠肾上腺与
脾脏,称重观察药物对小鼠免疫力的影响。结果 复方制剂药的急性镇痛药效明显(P < 0. 05) ,五加皮镇痛药效远不如赖
氨匹林(P < 0. 01) ,也不如杨梅树皮和复合制剂。杨梅树皮对脾脏的免疫功能影响大(P < 0. 05)。结论 杨梅树皮有镇
痛药效,五加皮无镇痛药效;且杨梅树皮中加入五加皮所制成的复方制剂有更全面的治疗效果。杨梅树皮有镇痛药效,
五加皮和复方制剂无镇痛药效;杨梅树皮、五加皮单独使用,分别可以提高机体免疫功能;但是临床应用应该采用分开使
用的方式,两药联合用药不具备提高疗效的功能。
关键词:五加皮; 杨梅树皮; 复方制剂; 镇痛; 免疫力
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2012. 05. 045
中图分类号:R285. 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)05-1151-02
疼痛(pain)是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的
症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉,以及
机体对伤害性刺激的痛反应。而许多疼痛,对机体已成为一种难
以忍受的折磨。因此,镇痛是医务工作者面临的重要任务。中药
中的杨梅树皮,味苦、性温,具有散瘀止血、止痛之功效 ,民间用
于治疗跌打损伤、骨折、痢疾、胃和十二指肠溃疡、牙痛等[1]。五
加皮始载于《神农本草经》,为五加科落叶小灌木细柱五加的根
皮,常在夏、秋二季采挖,剥取根皮,晒干。其功效为散风祛湿,
利水消肿,益肝肾壮筋骨。临床具有祛风湿、止痹痛的作用。课
题组根据前人的理论,探讨五加皮、杨梅树皮各自的药效制成复
方制剂的综合药效,为进一步推广临床运用提供实验室依据。
1 材料
1. 1 动物 昆明级 SD健康小鼠,60 只,体质量(28. 72 ± 3. 07)g,
雌雄均可。
1. 2 药品 中药五加皮,杨梅树皮,由华北煤炭医学院药理实验
室成员自行煎制。煎药的方法:将所需药材称重配好,先用温水
泡 60 min,再将药材放入锅中,加水(每 500 g 中药加 1 000 ml
水)打开电磁炉加热煮沸,煮沸后保温(120℃) ,至浓缩液剩余 50
ml。第二次加水至 1 000 ml,煮药材煮沸后保温,至浓缩液剩余
50 ml,收集滤液,再用五加皮、杨梅树皮滤液以 2∶ 5 的比例制成
复方制剂。0. 4%曲马多注射液(石家庄欧意药业有限公司生
产,批准文号:国药准字 H10800001) ,3. 6%赖氨匹林注射液(安
徽省蚌埠丰原涂山制药有限公司生产,批准文号:国药准字
H34022436) ,生理盐水,秒表,电子天平(江苏常熟市金羊砝码仪
器有限公司生产)。各装入瓶中,共计五副药。
1. 3 试剂及仪器 25%冰醋酸(天津申泰化学试剂有限公司生
产,批号:080801) ,动物实验手术器械,实验橱柜、铁笼、灌胃器、
1ml注射器数个等。
2 方法
2. 1 动物分组及给药 小鼠 60 只,随机分成 6 组,10 只 /笼,即五
加皮组(1 组) ,杨梅树皮组(2 组) ,复方制剂组(3 组) ,曲马多组
(4 组) ,赖氨匹林组(5 组) ,空白对照组(6 组)。给药 5 d,其剂
量为(1 组)五加皮灌胃,剂量为每日每次 0. 1 ml /10g 体质量;(2
组)杨梅树皮滤液灌胃,剂量为每日每次 0. 1ml /10g 体质量; (3
组)复方制剂灌胃,剂量为每日每次 0. 1 ml /10 g 体质量; (4 组)
0. 4%曲马多腹腔注射,剂量为每次 0. 1 ml /10 g 体质量; (5 组)
3. 6%赖氨匹林腹腔注射,剂量为每次 0. 1 ml /10 g 体质量; (6
组)生理盐水腹腔注射,剂量为每次 0. 1 ml /10 g体质量。
2. 2 具体实验方法
2. 2. 1 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药分别对小鼠抗疼痛效果的
影响 取 18 ~ 22 g 小鼠,按体重随机分组,每组小鼠均进行体表
编号 1 ~ 10 号,并分别称重。第 1 天,(1) (2) (3)组小鼠分别给
五加皮、杨梅树皮、复方制剂药,1 h后再腹腔注射冰醋酸 0. 2 ml /
只 ,(4) (5)组小鼠分别腹腔注射曲马多、赖氨匹林 0. 1 ml /10g,
15 min以后再腹腔注射 0. 7%冰醋酸 0. 2 ml /只。6 组小鼠均 5
min后观察 15 min内典型的扭体发生次数(扭体即伸展后肢,腹
部收缩和扭曲身体)。第 2 天至第 4 天,(1) (2) (3)组小鼠分别
每天定时给以五加皮、杨梅树皮、复方制剂药(灌胃方式)。第 5
天,(1) (2) (3)组小鼠分别给以五加皮、杨梅树皮、复方制剂药
(灌胃方式) ,3 h后再腹腔注射冰醋酸 0. 2 ml /只 ,(4) (5)组小
鼠分别腹腔注射曲马多、赖氨匹林 0. 1 ml /10 g体质量,15 min以
后再腹腔注射 25%冰醋酸 0. 2 ml /只。6 组小鼠均继续观察 20
min,观察并记载每只小鼠扭体频数。
2. 2. 2 药物对小鼠免疫功能的影响 末次给药并测量扭体频数
后颈椎脱臼法处死所有小鼠,分别取胸腺,脾脏,称重记录,计算
脏器重量指数(weight index ,WI)。计算公式:脏器指数 =脏器
重量(mg)/体质量(g)。
2. 3 结果统计学处理 数据用 珋x ± s表示,数据采用 SPSS11. 5 和
t检验统计分析,组间差异用单因素方差分析。
3 结果
3. 1 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药分别对小鼠抗疼痛效果的影
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL . 23 NO. 5 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 5 期
响 结果见表 1 ~ 2。
由表 1 可见,与赖氨匹林组相比,五加皮药和复方制剂药的
慢性药效均远不如赖氨匹林,具有明显统计学意义(P < 0. 01) ;
杨梅树皮药的慢性镇痛药效不明显,不具有统计学意义(P >
0. 05) ;与对照组比较,五加皮、杨梅树皮及其复方制剂药的慢性
镇痛药效均不明显,不具有明显统计学意义(P > 0. 05) ;与曲马
多相比,五加皮药、杨梅树皮和复方制剂药的慢性药效均远不如
中枢镇痛药曲马多。
表 1 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药分别对小鼠急性疼痛的镇痛药效
(珋x ± s) 次·(20 min)- 1
组别 给药方法 扭体频数
五加皮 灌胃 18. 60 ± 10. 95**
杨梅树皮 灌胃 12. 60 ± 11. 44
复方制剂 灌胃 8. 50 ± 8. 75△
曲马多 腹腔注射 0. 00 ± 0. 00
赖氨匹林 腹腔注射 6. 90 ± 7. 16
对照 灌胃 25. 90 ± 21. 92
与赖氨匹林组比较,**P < 0. 01;与对照组比较,△P > 0. 05;n = 10
表 2 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药分别对小鼠慢性药效(给药第 5 天时)
组别 n 给药方法 扭体频数 /次·20min -1
五加皮 12 灌胃 18. 25 ± 9. 36**
杨梅树皮 10 灌胃 18. 50 ± 19. 17
复方制剂 11 灌胃 24. 18 ± 11. 95△△
曲马多 10 腹腔注射 0. 00 ± 0. 00
赖氨匹林 10 腹腔注射 6. 90 ± 7. 16
对照 10 灌胃 25. 90 ± 21. 92
与赖氨匹林组比较,**P < 0. 01;与对照组比较,△△P > 0. 05;n = 10
由表 2 可见,与赖氨匹林组比较,五加皮药和复方制剂药的
慢性药效均远不如赖氨匹林,具有明显统计学意义(P < 0. 01)。
杨梅树皮药的慢性镇痛药效不明显,不具有统计学意义(P >
0. 05) ;与对照组比较:五加皮、杨梅树皮及其复方制剂药的慢性
镇痛药效均不明显,不具有明显统计学意义(P > 0. 05) ;与曲马
多比较,五加皮药、杨梅树皮和复方制剂药的慢性药效均远不如
中枢镇痛药曲马多。
3. 2 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药对小鼠机体免疫系统功能的
影响 结果见表 3。
表 3 五加皮、杨梅树皮、复方制剂药对小鼠机体免疫系统功能的影响
组别 n
脾脏
重量(mg) 指数
肾上腺
重量(mg) 指数
五加皮 11 134. 7 ± 27. 6 4. 50 ± 2. 18 11. 3 ± 5. 0 0. 37 ± 1. 56
杨梅树皮 10 118. 9 ± 39. 4 4. 01 ± 1. 46 13. 2 ± 4. 3* 0. 44 ± 1. 19Δ
复方制剂 11 117. 2 ± 40. 9# 4. 18 ± 1. 63# 10. 3 ± 3. 1# 0. 37 ± 0. 14#
对照 8 117. 7 ± 53. 6 3. 79 ± 1. 82 9. 9 ± 1. 9 0. 32 ± 0. 08
与对照组比较,* P < 0. 05;与对照组比较,△P > 0. 05;与对照组比较,#P >
0. 05
由表 3 可见,与对照组比较,杨梅树皮组的肾上腺重量及重
量指数明显增加,对肾上腺的影响具有统计学意义(P < 0. 05) ,
而五加皮组与复方制剂组对肾上腺重量及重量指数的影响无统
计学意义(P > 0. 05) ;五加皮组、杨梅树皮组以及复方制剂组的
脾脏重量及重量指数均无明显增加,对脾脏的影响无统计学意义
(P > 0. 05)。说明对免疫系统影响小。
4 讨论
4. 1 对急性疼痛的镇痛效果比较 表 1 显示五加皮与赖氨匹林
相比,具有显著差异(P < 0. 01) ,五加皮药急性效远不如赖氨匹
林。而单独使用杨梅树皮镇痛效果好,两药制成的复方制剂与赖
氨匹林(外周神经镇痛药)药效相当,但均不如曲马多(中枢镇痛
药)。若遇到疼痛时,不能立即用五加皮进行急性镇痛,而可以
选择杨梅树皮或者复方制剂。若遇到急性锐痛(如手术痛)时,
五加皮、杨梅树皮和复方制剂均无效。五加皮主要化学成分为挥
发油(4 -甲基水杨醛等)、鞣质、棕榈酸、亚麻酸以及维生素 A、
维生素 B等。它的主要有效成分是苷类,其中丁香苷、刺五加苷
B、刺五加苷 D具有与人参皂苷相似的生理活性。有报道五加皮
在骨折、肥大性腰椎炎、腰椎管狭窄症等骨科疾患方面有一定应
用[2]。杨梅树皮的主要化学成分是黄酮、杨梅素[3,4],黄酮在中
枢神经系统方面的活性 ,其中以抗抑郁和抗焦虑等精神调节活
性为主[5]。杨霉素有降血糖[6]、酪氨酸酶抑制、血小板活化因子
拮抗[7]、肝脏保护[8]等作用。因此,我们大胆推测:杨梅树皮中
加入五加皮所制成的复方制剂可有效治疗急性闭合软组织损伤、
挫伤等疾病,其中杨梅树皮有镇痛效果,五加皮或有抗炎镇静等
其他药效。
4. 2 对慢性疼痛的镇痛效果比较 表 2 显示杨梅树皮组与赖氨
匹林组相比无显著性差异,即杨梅树皮与赖氨匹林的药效相当。
而五加皮和复方制剂这两组数据都分别与赖氨匹林组的数据存
在极显著差异(P < 0. 01) ,即五加皮药和复方制剂药的慢性药效
均远不如赖氨匹林。因此更充分说明五加皮没有镇痛药效,且复
合制剂不能长期用于镇痛,只能作为急性镇痛。含五加皮有丰富
的葡萄糖、半乳糖、胡萝卜素。并且在配糖体的还原基中(酒精、
乙醇、羟基等有机化合物结合成的化合物) ,调节中枢神经及内
分泌功能的作用,具有益智安神的作用,民间有采用刺五加片每
次口服 5 ~ 8 片,每日 3 次治疗由神经衰弱引起的诸如失眠多梦、
心悸健忘、疲乏无力等症状具有明显效果。刺五加对中枢神经作
用机制尚不清楚,可能是抑制了某些药物代谢酶,不影响正常睡
眠过程,但与神经系统功能状态及剂量大小有关。用刺五加喂养
老年大鼠两个月后,能使纹状体、中脑和延脑中 MAO - B(单胺氧
化酶 B)活性明显下降,但使下丘脑 MAO - A活性上升 22%。提
示刺五加可能是通过改变某些脑区 MAO 及其同工酶活性,影响
单胺类介质水平而改善神经系统的功能。因此 ,我们认为:对慢
性疼痛仅有镇静作用,无镇痛效果[9]。
4. 3 对小鼠机体免疫功能的影响 表 3 显示,与对照组比较,杨
梅树皮可提高肾上腺的重量及重量指数,其它组效果虽有差别,
但效果相当、无明显统计学差异。肾上腺、脾是机体最重要的外
周免疫器官,伴随上述变化,机体免疫功能明显增强。五加皮为
五加科落叶小灌木细柱五加(Acanthopanax gracilistylus W. W.
smith)的根皮。①五加皮中含有刺五加苷,其对肾上腺具有良好
的作用,并分泌抵抗疲劳的肾上腺激素,刺激交感神经的活性,增
强抵御疾病能力。刺五加提取物显示可刺激细胞免疫力,研究发
现其可刺激 T -细胞产生,因此刺五加被用于多种免疫相关疾
病。德国科学家曾发现该草药可能对治疗 AIDS 的早期阶段有
很大帮助,研究发现其可通过上升数量的助手细胞和细胞毒素 T
细胞的协作作用来减缓病毒的扩散,但本组实验中五加皮对肾上
腺以及脾脏的影响均无显著影响;②刺五加含有多种五加苷、多
糖等活性成分,具有抗衰老、抗疲劳(刺五加苷的抗疲劳作用比
人参还强) ,和调节神经、内分泌、心血管功能,提高机体对物理、
化学、生物等有害剌激的抵抗能力等药理作用,在神经衰弱、失
眠、高血压病、冠心病、脑梗塞、脑动脉硬化、更年期综合征、血脂
异常、糖尿病、风湿病、慢性支气管炎以及肿瘤等疾患的治疗中,
都有一定疗效。五加皮也可调整中枢神经系统兴奋与抑制过程
的平衡等;③刺五加含超氧化歧化酶 SOD (Superoxide dimutase)
复合物,SOD具有良好的抗氧化功能,可以增强人体免疫以及抵
抗自由基攻击的效果,具有抗氧化作用,可增强人体免疫力、防止
老化及促进健康。五加皮既能散风除湿以驱邪、又能补益肝肾以
强身,也是滋补强身的佳品。贺兴东等报道,细柱五加皮水煎剂
可抑制机体的免疫功能,而总皂苷则能提高机体的免疫功能[10];
④脾脏是抗体形成的主要淋巴器官,杨梅树皮可促进脾脏的单核
巨噬细胞的吞噬作用和提高溶血素含量,可增强小鼠非特异性免
疫功能和免疫功能低下小鼠体液免疫功能[11],但本实验中杨梅
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL. 23 NO. 5
树皮对脾脏的重量及重量指数均无显著影响;⑤大量实验研究表
明,杨梅树皮含有的黄酮类化合物有抗炎、调节免疫、抗衰老作
用,其作用机制与其抗自由基或抗氧化有关,双氢杨梅树皮素能
显著提高小鼠单核 -巨噬细胞吞噬功能和溶血素含量,增强免疫
功能,提高小鼠的抗炎、镇痛能力[12]。因此,用杨梅树皮可提高
机体免疫功能。
参考文献:
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收稿日期:2011-07-01; 修订日期:2011-12-30
基金项目:湖北省教育厅重点项目(No. D20112801) ;
咸宁学院创新团队项目(No. KY0874)
作者简介:姚 刚(1966-) ,男(汉族) ,湖北咸宁人,现任咸宁学院药学院
讲师,学士学位,主要从事生物活性蛋白研究工作.
人参水溶性蛋白的提取及 SOD活性测定
姚 刚,刘 宏,欧阳昌汉
(咸宁学院·药学院,湖北 咸宁 437100)
摘要:目的 提取人参水溶性蛋白,测定其蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。方法 采用缓冲溶液抽提及硫酸铵分
级沉淀法制备人参水溶性总蛋白,采用 Bradford蛋白含量试剂盒测定蛋白质含量、SDS - PAGE 法进行蛋白鉴定、邻苯三
酚自氧化法进行 SOD活力测定,并采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行活力显示。结果 通过 Bradford蛋白含量试剂
盒测定蛋白质含量达 80%,蛋白收率达 1%,SDS - PAGE电泳检测显示人参中主要含有 8 种蛋白亚基。邻苯三酚自氧化
法测得 SOD活力达 16. 048 U /mg蛋白,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条活性谱带。结论 人参中具有较丰富的水溶
性蛋白,且这些水溶性蛋白具有较高的 SOD活性。
关键词:人参; 水溶性蛋白; SOD 活性
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2012. 05. 046
中图分类号:R284. 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)05-1153-02
人参为五加科植物 Panax ginseng C. A. Meyer 的根,味甘、性
温,为一种家喻户晓的滋补性中药材,对机体具有多种生理学效
应,如兴奋中枢神经,加快冲动传导;增强机体抵抗力和对恶劣环
境的耐受力;促进性功能以及降压强心、提高机体免疫力,改善记
忆力和老年痴呆等[1]。在亚洲,像中国、韩国、日本应用人参已
有 2000 年的历史。人参作为药用食物现在已逐渐成为流行趋
势,在欧洲及美洲人参销售逐年增加。
近年来研究表明,人参中所含的人参皂苷是主要的有效成
分。人参皂苷是一种四环类固醇结构的物质并且和半乳糖相连。
目前已从人参中分离出三十多种不同的皂苷,占人参总量的 3%
~4%,且人参皂苷在参根中含量多于参体[2]。尽管目前人们对
人参中皂苷类活性成分进行了大量的研究,但对其他成分研究方
面尤其是在生物活性蛋白方面研究甚少。因此,本实验提取了人
参中的水溶性蛋白,并检测其 SOD活性,进而为开发和利用该类
生物活性蛋白的提供理论依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料与试剂 人参,吉林省靖宇县四年生生晒参;Tris,Gen-
view电泳纯;丙烯酰胺,Sigma电泳纯;硫酸铵,Sigma 电泳纯;β -
硫基乙醇,Sigma 电泳纯;TEMED,Amresco 电泳纯;考马斯亮蓝
R250,Sigma电泳纯;NBT,Sigma公司产品;SDS - PAGE标准蛋白,
中科院上海生物化学研究所产品;Bradford 蛋白含量试剂,Sigma
公司产品。
1. 2 仪器 电子天平,TA1203N,上海精密科学仪器有限公司产
品;超声波清洗器,KQ - 3200B,昆山市超声仪器有限公司产品;
微机型酸度计,pHS - 25CW,上海理达仪器厂产品;高速组织捣
碎机,DS - 1,上海标本模型厂产品;冷冻干燥机,LL3000,德国
Heto公司产品;漩涡混合器,XW -80A. H - 1,上海 2 精科实业有
限公司产品;离心机,TDL - 5,上海安亭科学仪器厂产品;垂直板
电泳槽,DYCZ - 24D,北京六一仪器厂产品;分光光度计,UVmini
- 1240,日本岛津公司产品;酶标仪,Multiskan MK3,Thermo 公司
产品。
2 方法与结果
2. 1 人参水溶性蛋白的提取分离 取生晒参若干,高速组织捣碎
机粉碎,称重,加入 10 倍量的 pH 7. 4 Tris - HCl 缓冲液搅拌均
匀,在 4℃下搅拌浸提 12 h。以 5 000 r /min 离心 30 min,向沉淀
中加入 10 倍量的 pH 7. 4 Tris - HCl进行二次浸提,离心,上清液
合并。向合并的上清液中逐级加入硫酸铵使达 80%饱和度,4℃
静止过夜,以 5 000 r /min 离心 30 min,收集沉淀。沉淀用少量
pH 7. 4 Tris - HCl缓冲液溶解并对水透析(先用流水透析约 5 h
至大量硫酸铵透出,再用蒸馏水于 4℃下搅拌透析 20 h) ,透析液
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL . 23 NO. 5 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 5 期