全 文 ：农业生物技术科学
中国农学通报 第23卷 第 9期 2007年 9月
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白芦笋花药愈伤组织诱导及绿芽分化
林宗铿,张天翔,杨俊杰,蔡坤秀,曹明华,刘长全
(福建省热带作物科学研究所，漳州 363001)
摘 要:为建立芦笋单倍体育种技术体系以解决国内芦笋新品种资源贫乏问题,该文以白芦笋花药为外
植体进行了愈伤组织的诱导及绿芽分化研究。试验结果表明,芦笋花药经过4d的冷藏(4℃)处理后,接
种于含有NAA2.0mg/L、6-BA1.0mg/L及6%蔗糖的1/2MS培养基上,可产生愈伤组织;每年的4月份
接种花药的愈伤组织诱导率最高,8月份次之,11月份最低。品种间、同一品种不同单株间花药的愈伤
组织诱导率不同,以‘ UC155’品种(18.9%)最高,显著高于其他三个品种‘ UC142’(11.6%)、‘ Gijnlim’
(10.3%)、‘ Thielim’(5.8%),所有试验株系中以‘ UC155’-8的愈伤组织诱导率最高,达83.5%;每日补充光
照强度为1000lx的光照,比全暗培养更有利于芦笋花药愈伤组织的形成;花药接种前进行离心处理
(4000r/min)30min,不能提高愈伤组织诱导率;愈伤组织转瓶培养于NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg/L及
3%蔗糖的 MS培养基上,能分化出无根绿芽;不同品种间绿芽分化率有差别,以‘ Gijnlim’品种最高
(67.2%),‘ UC142’品种最低(14.1%);未分化绿芽的愈伤组织再转入于不含植物生长调节剂的 MS培养
基上培养,部分愈伤组织能分化出绿芽。
关键词:白芦笋;花药培养;愈伤组织;绿芽
中图分类号:Q331,S644.6 文献标识码:A
StudyonCalusInducementandGreenShootDiferentiationofWhiteAsparagusAnther
LinZongkeng,ZhangTianxiang,YangJunjie,CaiKunxiu,CaoMinghua,LiuChangquan
(FujianInstituteofTropicalCrops,Zhangzhou363001)
Abstract:ExperimentswereconductedontheantherofAsparagusoficinalisL.tostudythecalusinduce-
mentandgreenshootdiferentiation.ResultsshowedthatcalusofanthercouldbeinducedfromtheAspara-
gusantherwhichhadbeenrefrigeratedat4℃for4daysandtheninoculatedto1/2MSculturemediumof
NAA2.0mg/L,6-BA1.0mg/Land6%sucrose.TheoptimaltimetogatherantherisApril，inwhichthecal-
lusinducementratearivedatthepeak,whileinAugustandNovember,therateswerelower.Amongdifer-
entbreedsandplants,thecalusinducementrateofanthervaried,inwhichthebreedof‘ UC155’per-
formedthehighestinducementrate(18.9%),distinctivelyhigherthantheotherthreebreedsdid,including
‘ UC142’(11.6%),‘ Gijnlim’(10.3%)and‘ Thielim’(5.8%);Ofaltheexperimentstrains,thebreedof
‘ UC155’-8showedthehighestinducementrate,whichwas83.5%.Comparedwithdarkculture,asupple-
mentlightof1000lxeverydaycouldstimulatethecalusinducementofWhiteAsparagusanther.Centrifugal
disposal(4000r/min,30min)beforeinoculationofanthercouldnotincreasetheinducementrateofcalus.
ThecaluswhichtransferedtoMSculturemediumofNAA0.5mg/L,6-BA1.0mg/Land3%sucrosecould
diferentiategreenshootswithoutroot.Diferentiationratevariedamongdiferentbreeds,inwhichthebreed
of‘ Gijnlim’diferentiatedmost(67.2%)andbreed‘ UC142’didleast.Partofthenon-diferentiatedcalus
coulddiferentiategreenshootswhiletransferedtoMSculturemediumwithoutplantgrowthregulators.
Keywords:AsparagusoficinalisL.,Antherculture,Calus,Greenshoot
基金项目:福建省自然科学基金项目“ 芦笋抗病超雄株培育技术的研究”(B0510035)。
第一作者简介：林宗铿，男，1975年出生，福建莆田人，硕士，助理研究员，主要从事植物组织培养技术研究。通信地址：363001福建省热带作物科学
研究所。Tel：0596-2615160，E-mail:zklin2004@126.com。
收稿日期:2007-06-07，修回日期：2007-07-19。
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芦笋(AsparagusoficinalisL.)为百合科天门冬属
草本植物，是一种营养丰富且药用价值高的蔬菜。培养
芦笋雄株花药可获得由花粉发育而来的单倍体植株
(X或Y)，含有Y染色体的单倍体经染色体加倍后可
得到纯雄性双倍体(YY)。利用这种纯雄双倍体(超雄
株)与雌性个体(XX)交配，所得的 F1种子全为雄性
(XY)。该育种方法已被许多先进国家用于培育芦笋新
品种。
进行芦笋花药愈伤组织诱导和绿芽分化是开展芦
笋单倍体育种研究的基础。有关芦笋花药培养的报道
较多，在采花药的时期、花粉的发育时期、预处理、培养
基、植物生长调节剂、染色体的倍性等方面均有详细的
叙述 [1]。研究报道指出，诱导芦笋花药愈伤组织时，
1/2MS培养基是进行花药培养的最佳基本培养基，附
加的植物生长调节剂以NAA和BA配合使用为最佳，
NAA的用量要多于或等于6-BA的用量，而在愈伤组
织分化绿芽时，6-BA用量高于 NAA有利于芽的分
化[2~5]。但整体上芦笋花药培养的效率不高，愈伤组织
诱导率低、绿芽分化率低、体细胞干扰严重，花粉单倍
体出现的频率低等，仍然有待于克服[1]。笔者在前人工
作基础上，选用在中国南方栽培表现较好(产量高或较
抗病)的4个白芦笋品种[6]，进行花药培养，诱导出植
株，并探讨了几种影响芦笋花药培养及绿芽分化的因
素，为进行芦笋单倍体育种奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试白芦笋 (AsparagusoficinalisL.)品种为
‘ UC142’、‘ UC155’、‘ Thielim’和‘ Gijnlim’四个品种，
于2005年4月11日、8月14日、11月17日和 2006
年4月14日分别自福建省东山县芦笋种源圃采取雄
株花序，植株为3~4年生。
1.2试验方法
1.2.1材料处理 材料取回后选择长度为2.0mm左右
的花蕾(此时花粉多为单核中期)，放在4℃人工气候箱
中预处理4d。在超净工作台上将花蕾先用75%酒精溶
液浸泡10s，倒去酒精后加入2.0%的升汞溶液(加几滴
吐温-80)，浸泡15~20min后用无菌水冲洗4~5次。离
心处理的花蕾放在消毒过的离心管内，4000r/min的
转速下离心处理30min。处理过的花蕾在超净工作台
上剥取花药接种于诱导培养基。
1.2.2愈伤组织诱导 花药愈伤组织诱导培养基为
1/2MS+2.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA， 蔗 糖 浓 度 为
6.0%，琼脂为0.7%，pH为5.8。每瓶接种外观未破损的
花药50枚，接种后培养瓶置于(27±1)℃、1000lx光照
强度或全暗条件下诱导愈伤组织。80d时观察愈伤组
织的诱导情况。
1.2.3绿芽分化 将诱导的愈伤组织接种于绿芽分化培
养基 MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，60d时调查绿
芽分化情况，并将未分化的愈伤组织转瓶到不添加植
物生长调节剂的MS培养上继续培养，60d后再调查
绿芽分化情况。培养基中蔗糖的浓度为3.0%、琼脂为
0.7%、pH5.8。培养温度为 (27±1)℃，光照强度为
1500lx。
2结果与分析
2.1愈伤组织诱导
2.1.1愈伤组织外观比较 芦笋花药接种在愈伤组织
诱导培养基上，整个花药的药壁会逐渐变成褐色，培养
20d左右开始出现愈伤组织。产生的愈伤组织呈现三
种不同类型外观：一种为黄色、质地疏松的愈伤组织
(图1)，此类型占大部分(95%以上)；另一种为白色的、
棉絮状愈伤组织(图2)；第三种为白色(全暗培养)、浅
绿色(补充光照)且质地坚硬紧密的愈伤组织(图3)。
图1黄色、质地疏松的愈伤组织 图2白色的、棉絮状愈伤组织
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图3质地坚硬紧密的愈伤组织
2.1.2 不同花药采集时间对愈伤组织诱导率的影响
福建闽南地区种植的芦笋每年需更换三次母茎，每次
母茎新抽生时，均开花一次。因此在每年的4月、8月
和11月有三次采集花药的机会。调查不同采集时间的
花药愈伤组织诱导率，可以看出，每年的4月份接种花
药的诱导率最高，8月份次之，11月份接种的最低。试
验所用四个品种均表现出这种规律(表1)。
2.1.3不同品种、不同单株对愈伤组织诱导率的影响
表1不同时期的花药愈伤组织诱导率(%)
表2为不同品种在同一愈伤组织诱导培养基上诱导的
培养结果。从表2可以看出，品种间花药愈伤组织的诱
导率存在差异。‘ UC155’品种的诱导率18.9%为最高，
与其他三个品种差异显著。‘ UC142’和‘ Gijnlim’两品
种的诱导率分别为11.6%和10.3%，二者差异不显著。
‘ Thielim’品种的诱导率最低，仅为5.8%，与以上三个
品种的差异也达到显著水平。
试验调查中也发现，同一品种不同单株花药愈伤
组织的诱导率也存在差异。表3为各品种内不同单株
的愈伤组织诱导率分布情况。从表 3可以看出，
‘ UC155’品种中，愈伤组织诱导率在10%以上的单株
占该品种株系总数的57.1%。而‘ Thielim’品种中，诱导
不同采集时间
2005年4月11日
2005年8月13日
2005年11月12日
2006年4月9日
‘ Thielim
6.4
3.2
1.0
5.8
‘ Gijnlim
11.3
2.5
1.5
10.3
‘ UC155
16.5
5.8
6.9
18.9
‘ UC142
10.8
3.7
0.8
11.6
表2不同品种花药的愈伤组织诱导率
品种
‘ UC155
‘ UC142
‘ Gijnlim
‘ Thielim
接种花药数量
6600
4200
3350
9100
愈伤组织数量
1245
489
344
531
愈伤组织诱导率(%)
18.9a
11.6b
10.3b
5.8c
愈伤组织
诱导率
‘ UC155 ‘ UC142 ‘ Gijnlim’ ‘ Thielim
5%以下
5~10%
10%以上
合计
株系数量
4
2
8
14
百分率(%)
28.6
14.3
57.1
100.0
株系数量
5
2
3
10
百分率(%)
50.0
20.0
30.0
100.0
株系数量
5
3
3
11
百分率(%)
45.4
27.3
27.3
100.0
株系数量
5
8
1
14
百分率(%)
35.7
57.1
7.2
100.0
注：试验数据来源于2006年4月接种的花药(下表同)，同列数据后不同字母表示在P=0.05水平上差异显著。
表3同一品种不同单株花药的愈伤组织诱导率分布范围
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表4光照对Thielim品种花药愈伤组织诱导率的影响
率在10%以上的单株仅占该品种总数的7.2%。同一品
种间不同单株的愈伤组织诱导率存在差异，诱导率分
布范围没有表现出一定的规律性。最终的试验统计结
果显示所有试验株系中以‘ UC155’-8最高，其愈伤组
织诱导率为83.5%，与其他株系差异达极显著水平。
2.1.4 光照处理和离心处理对愈伤组织诱导率的影
响从表4可以看出，适当的光照度有利于芦笋花药愈
伤组织的生成。试验所用‘ Thielim’品种的3个株系均
表现在有补充光照的条件下，其愈伤组织的诱导率高
于在黑暗环境下培养的诱导率。Thielim-10株系只有
在光照条件下方能诱导出愈伤组织。比较同一株系花
药经离心处理和未经离心处理所得到的愈伤组织诱导
率，发现离心处理未能促进花药愈伤组织的形成 (表
5)。
2.2绿芽分化
愈伤组织接种于绿芽分化培养基上，20d后就有
绿芽开始萌发。从试验观察中发现，不同类型的愈伤组
织的绿芽分化的形式也不同。小部份质地疏松、浅黄色
的愈伤组织可以直接在愈伤组织诱导培养基上萌发出
绿芽，但所占的比例很小；大部份的质地疏松、浅黄色
的愈伤组织需经过在绿芽分化培养基的培养，才能分
化出绿芽，但产生的绿芽有两种情况，一种为表现正常
的，别一种表现为玻璃化。白色的棉絮状愈伤组织经过
在绿芽分化培养基上的培养，产生出大量的玻璃化的
绿芽。质地坚硬紧密的愈伤组织经过培养，在光照作用
下，颜色转为绿色，但未见有绿芽产生，长期培养变褐
死亡。
不同品种花药来源的愈伤组织在同一培养基上，
绿芽分化率有差别。以‘ Gijnlim’品种最高，其绿芽分
化率可达 67.2%，‘ UC142’最低，绿芽分化率仅为
14.1%。试验观察中也发现，愈伤组织在含有植物生长
调节剂的MS培养基上培养后，转移到不含有任何植
物生长调节剂的MS培养基，经过一段时间的培养，可
明显提高绿芽的分化率。尤其以‘ UC142’品种效果最
好，其愈伤组织在含有植物生长调节剂的培养基上的
绿芽分化率为2.7%，转入无植物生长调节剂的培养基
上，绿芽分化率可提高到14.1%。其他品种愈伤组织的
绿芽分化率也有不同程度的提高(表6)。
表6愈伤组织在不同培养基上绿芽分化率
株系编号
光照强度1000lx 暗培养
‘ Thielim-4
‘ Thielim-12
‘ Thielim-10
接种花药数量
650
550
850
愈伤组织数量
100
40
31
愈伤组织诱导率(%)
15.4
7.3
3.6
接种花药数量
600
500
432
愈伤组织数量
64
10
0
愈伤组织诱导率(%)
10.7
2.0
0
表5离心处理对花药愈伤组织诱导率的影响
株系编号
离心处理 未离心处理
‘ UC155-1
‘ UC142-18
‘ Gijnlim-13
‘ Thielim-14
接种花药数量
950
350
300
350
愈伤组织数量
95
39
21
30
愈伤组织诱导率(%)
10.0
11.1
7.0
5.7
接种花药数量
1600
550
350
1050
愈伤组织数量
220
57
18
66
愈伤组织诱导率(%)
13.8
10.4
5.1
6.3
品
种
接种愈伤组织数
量(A)
第一次培养(60d) 第二次培养(60d)
绿芽分化率
(B+C)/A(%)
‘ UC155
‘ UC142
‘ Gijnlim
‘ Thielim
1245
489
344
531
萌芽愈伤组织数量
(B)
156
13
212
166
绿芽分化率B/A
(%)
12.5
2.7
61.6
31.3
萌芽愈伤组织数量
(C)
113
56
19
29
绿芽分化率C/A
(%)
9.1
11.4
5.6
5.4
21.6
14.1
67.2
36.7
3讨论
植物的生长条件(如光周期、光强、温度和矿质营
养)和生理状态等均会影响雄核的发育[7]。在福建闽南
地区，芦笋在一年中需更换三次母茎，每次新生母茎均
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会开花。笔者试验结果(表1)表明，4个品种都是4月
份生长的花药愈伤组织诱导率高，而采集8月份和11
月份生长的花药的愈伤组织诱导率较低。引起这种现
象可能是由于外界温度、光周期等条件不同引起的芦
笋花药发育质量不同而引起的。
许多报道指出芦笋花药培养效率 (愈伤组织诱导
率和绿苗分化率)因试验所用品种、株系的不同而有很
大差异[2,4,7]。赖本智(1991年)培养了11个品种，发现
‘ UC500W’品种培养效率最高 (愈伤组织诱导率
53.3%、分化率13.4%)，80个株系中以‘ UC500W’-20
的培养效率最高 (愈伤组织诱导率 63.0%、分化率
23.2%)。韩佩来 (1994年)培养5个品种，发现‘ M.
W500’品种愈伤组织诱导率(30.5%)最高，‘ UC157’最
低，仅7.0%。笔者试验结果(表2、表3、表6)也显示了
这种差异性的存在。这种差异可能是由于芦笋品种间、
单株间的基因型上的差异引起的，但也有可能是培养
基成分对基因型的选择作用引起的。因此进行多种基
因型的芦笋花药培养时，进行必要的培养基选择，可能
提高部分品种或单株的花药培养效率。
接种前对花药进行适当的预处理，能提高其培养
效率，重力作用可打破微管，影响小孢子的发育[8]。芦
笋花药经过冷藏预处理、高糖预处理等，均取得提高花
药培养效率的结果[9,10]。但试验发现，用4000r/min的
转速处理芦笋花药30min，并未发现其能提高愈伤组
织的诱导率。
温度、光照等培养条件也影响花药培养的效率[11]。
笔者试验发现，在黑暗条件下可以诱导芦笋花药产生
愈伤组织，但在1000lx光照强度的条件下，可以得到
更高的愈伤组织诱导率。
张磊(1996年)报道，芦笋花药愈伤组织的绿芽分
化不仅受到愈伤组织的类型、分化培养基中植物生长
调节剂的组合配比的影响，而且也受培养方式的影响，
松散型愈伤组织的分化成苗率较低，而紧密型愈伤组
织的分化成苗率较高[7]。笔者试验所诱导的松散型愈
伤组织有两种类型，且都能诱导出绿芽，但所产生的绿
芽的生理状态不同。笔者试验诱导出的坚硬愈伤组织
却未能诱导出绿芽，是什么原因造成与有关报道有如
此大的差异，有待于进一步查明。笔者试验还发现，通
过两次培养，可提高绿芽的分化率，特别是对于在第一
次培养基中分化率低的品种，效果更佳(表6)。由芦笋
花药愈伤组织诱导出来的绿芽，其染色体倍数复杂，哪
一些为单倍体需进行染色体数目检测。检测方法和结
果将另文发表。
综上所述，进行芦笋花药培养时，在4月份采集处
于单核中期的花药，经过4d的冷藏(4℃)处理后，接种
于含有 NAA2.0mg/L、6-BA1.0mg/L和 6%蔗糖的
1/2MS培养基，光照强度1000lx，80d将所诱导的愈伤
组织转瓶培养于NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg/L及3%
蔗糖的MS培养基，光照强度1500lx，培养60d后，再
转入于不含植物生长调节剂的MS培养基培养60d，
可得到较佳的花药培养效率。
参考文献
[1] 张磊.石刁柏花药培养研究及其进展 [J].北方园艺,1996,111(6):
44-46.
[2] 刘贵仁,严仁玲,张磊,等.石刁柏花药培养与染色体倍性的观察[J].
吉林农业大学学报,1990,12(1):5-9,39.
[3] 赖本智,许家言,叶常青,等.芦笋花药培养之全雄育种Ⅰ:品种及单
株间花药培养效率之研究[J].中华农业研究,1991,40(1):94-101.
[4] 戴勇,邹道谦.石刁柏花药培养研究初报[J].河北农业大学学报,
1992,15(2):55-59.
[5] 韩佩来,陈利明,沈革志,等.石刁柏的花药培养与植株再生[J].上海
农业学报,1994,10(2):85-88.
[6] 陈振东,林岳生,高海筹,等.芦笋新品种引种试种初报[J].福建热作
科技,2005,30(1):17-18.
[7] 王蒂.植物组织培养[M].北京:中国农业出版社,2004,85-105.
[8] 李守岭,庄南生.植物花药培养及影响因素研究进展[J].亚热带植
物科学,2006,35(3):76-80.
[9] 周维燕,费水章,陆朝福,等.石刁柏超雄株培育技术的研究[J].北京
农业大学学报,1991,17(1):65-76.
[10] 肖昌华,李治平.石刁柏花药预冷冻对诱导频率的影响[J].长江蔬
菜,1994(4):28-29.
[11] 李靖,李焕秀,李敏,等.蔬菜花药培养研究进展[J].中国蔬菜.2005
(6):36-39.
（ 责任编辑：李碧鹰）
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