全 文 ：北方园艺 2009(11):51 ～ 53 ·试验研究 ·
第一作者简介:张俊环(1974-), 女, 山东菏泽人 , 博士, 助理研究
员,现主要从事果树逆境生理与分子生物学研究工作。 E-mail:
zhang junhuan@163.com。
通讯作者:王玉柱(1960-),男 ,北京平谷人, 博士, 研究员 ,现主要
从事果树资源与育种工作。
基金项目:北京市优秀人才培养 D 类资助项目(20061D02005
00047)。
收稿日期:2009-06-20
杏树皮可溶性总蛋白的提取与浓缩方法探讨
张俊环 , 王 玉柱 , 孙浩元 , 杨 　丽
(北京市农林科学院林业果树研究所,北京 100093)
　　摘　要:为从杏树皮组织中获取高质量的可溶性总蛋白 ,选择经过冬季自然低温驯化的1 a
生杏树新梢为试材 ,比较分析提取缓冲液中分别添加2%SDS ,不同浓度的 Tween 20 ,以及高浓度
PVPP对可溶性总蛋白提取浓度和质量的影响。结果表明:提取杏树皮可溶性总蛋白的最佳缓冲
液体系为:5 mL 50 mmol/ L的 Tris-HCl缓冲液(其中含 2 mM EDTA-Na2 ,10 mmol/ L抗坏血酸 ,
0.5 mmol/L DTT ,0.1 mmol/L PMSF ,1%(w/v)PVPP ,pH 8.0)和0.5%Tween 20。丙酮浓缩方
法中加入蛋白粗提液 2倍体积的冷丙酮是最理想的。经过提取和浓缩的蛋白浓度可达 0.773
μg/μL ,电泳分析中的条带多而清晰 ,可用于后续的目的蛋白纯化试验及功能分析。
关键词:杏;树皮;可溶性总蛋白;提取
中图分类号:Q 946-33　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2009)11-0051-03
　　植物可溶性总蛋白的提取 ,是对植物进行多种生化
分析的前提。但是不同植物材料 ,它的提取方法和提取
的难易程度是有很大差别的[ 1] ,所得蛋白溶液的质量直
接影响下一步的分析(如目的蛋白的分离纯化 、特异蛋
白的 SDS-PAGE与Western blot分析、蛋白酶活性的检
测等)[ 2-4] 。植物抗冻蛋白(Antif reeze proteins , AFPs)是
低温诱导基因表达所产生的蛋白 ,广泛存在于多种植物
体内 ,被认为是植物体内重要的抗冻剂[ 5] ,并成为近年
来抗寒生物学领域研究的热点[ 6-7] 。杏树抗干旱 ,耐瘠
薄 ,是山区绿化及生态农业建设的理想树种 ,具有良好
的生态效益;但是 ,北京地区早春骤然低温 、晚霜和寒潮
的气候特征严重影响广大杏栽培区的收益。因此 ,该试
验选择经过冬季自然低温驯化的山杏 1 a 生新梢为试
材 ,探讨从新梢组织中提取高质量可溶性蛋白的方法 ,
以为下一步进行抗冻蛋白的分离纯化奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
2008年1月24日 ,从北京市农林科学院林业果树
研究所内的杏资源圃采取经过冬季低温驯化的山杏 1 a
生新梢 ,带回实验室 ,用蒸馏水冲洗干净后 ,刮取其韧皮
组织 ,液氮速冻后 , -80℃保存备用。
1.2　蛋白提取
取 0.5 g 样品 ,液氮中研磨 ,加入 5 mL 50 mmol/ L
的 Tris-HCl缓冲液(其中含2mM EDTA-Na2 ,10mmol/
L抗坏血酸 ,0.5 mmol/L DTT ,0.1 mmol/L PMSF ,1%
(w/v)PVPP , pH 8.0)和不同组分:Ⅰ, 2%SDS;Ⅱ,0.1%
Tween 20;Ⅲ,0.5%Tween 20;Ⅳ,1.0%Tw een 20;Ⅴ,加
PVPP 至10 %(w/v);Ⅵ ,对照 ,即不添加其它成分。匀
浆于 4℃下 10 000 rpm离心 20 min ,上清液即为蛋白粗
提液。3次重复。
1.3　丙酮浓缩
向一定体积的蛋白粗提液中分别加入 1、2、3 、4倍
体积的冷丙酮(-20℃),并在-20℃条件下放置 30 min ,
之后于 4℃下12 000 rpm离心15 min ,弃上清液 ,沉淀在
4℃下晾干后 ,加入1 ～ 2倍沉淀体积的 Tris-HCl缓冲液
进行抽提 ,之后于4℃下 12 000 rpm离心15 min ,取上清
液 ,进行浓度检测 ,3次重复。
1.4　蛋白浓度检测
按 Bradford(1976)方法[ 8] ,BSA为标准蛋白质。
1.5　SDS-PAGE电泳
按照 Laemmli(1970)的方法[ 9] ,采用 Bio-Rad Mini
电泳系统(Bio-Rad , Rachmond California , USA),进行
SDS-PAGE ,分离胶浓度为 12%,浓缩胶浓度为 5%。
2　结果与分析
2.1　不同提取方法的粗提取液结果
采用 2种方法对 6种不同提取方案所得的蛋白粗
提液进行浓度检测 ,分别是 Bradford法和凝胶电泳法。
Bradford法所测得的计算结果见表 1 ,可以看出不同提
取方法所得蛋白粗提液的蛋白浓度差异显著 ,方法Ⅰ、Ⅲ
51
·试验研究· 北方园艺 2009(11):51～ 53
和Ⅳ所得的蛋白浓度显著高于其它 3种方法 ,方法 Ⅲ和
Ⅳ之间差异不大 ,但又都高于方法Ⅰ。
为了进一步检测不同方法所得结果的差异 ,又进行
了SDS-PAGE电泳 ,结果显示(图 1),同样的电泳上样
量 ,只有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ泳道有较弱的少量蛋白条带 ,而方法
Ⅱ、Ⅴ和 Ⅵ 没有蛋白条带出现 ,表明后者蛋白浓度较低 ,
这与 Bradford法所测得的计算结果相一致 ,表明方法Ⅰ、
Ⅲ和Ⅳ优于其它提取方法。
　　表 1 不同提取方法所得提取液的蛋白含量比较
　　Table 1 Changes of protein concentration of crude
ext racts by six methods
处理 Treatments Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
上清液蛋白浓度 The
protein concentration of
supe rnatant/μg·μL-1
0.19 0.041 0.256 0.272 0.021 0.010
图 1　不同提取方法所得提取液的SDS-PAGE电泳结果
Fig.1　The SDS-PAGE of protein ext racts by six extraction methods
由图 1还可以看出 ,即使方法Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ能跑出少量
的条带 ,但条带太弱 ,不清晰 ,表明浓度太低 ,这样低的
浓度不能用于下一步的蛋白纯化试验 ,为此需要做进一
步的浓缩来提高蛋白浓度。
2.2　不同体积丙酮浓缩方法比较
该试验采用了丙酮浓缩法 ,因为不同的丙酮用量会
对最后的结果有很大的影响 ,所以对不同体积的丙酮浓
缩方法进行了比较 ,向一定体积的蛋白粗提液中分别加
入1 、2 、3、4倍体积的冷丙酮(-20℃),结果如图2所示 ,
当加入 1倍体积和 2倍体积的丙酮时(图 2 A ,B),可观
察到少量的絮状沉淀悬浮于液体中 ,随着丙酮用量的增
加 ,沉淀量增加(图 2 C),但当加到 4倍体积时 ,蛋白沉
淀严重收缩并沉于离心管底部(图2 D)。离心后收集沉
淀 ,低温晾干后 ,用一定体积的提取缓冲液使沉淀溶解 ,
之后再离心取上清 ,并用 Bradford法进行了浓度检测 ,
结果显示 ,用 2倍体积的丙酮浓缩 ,所得的蛋白浓度最
高 ,其次为3倍体积 ,4倍体积浓缩效果最差(表 2)。
图 2　不同体积丙酮浓缩所得的蛋白沉淀状
Fig.2　The deposit s f rom dif ferent acetone condensing methods
　　表 2　不同浓缩方法所得悬浮液的蛋白含量比较
　　Table 2 Changes of protein concent ration of suspension f rom
different acetone condensing methods
处理 Treatment s A B C D
浓缩液蛋白浓度 The protein
concent ration of condensate/μg·μL-1 0.162 0.227 0.210 0.147
图 3　不同提取方法所得提取液的
浓缩液的SDS-PAGE电泳结果
Fig.3 The SDS-PAGE of different protein ext racts
af ter condensing t reatments
　　表 3　对不同提取方法所得提取液进行丙酮
浓缩后的蛋白含量比较
　　Table 3　The protein concentration of diff erent protein ext racts
af ter condensing t reatments
处理 Treatments Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
浓缩液蛋白浓度
The protein concent ration of
condensa te/μg·μL-1
0.244 0.468 0.738 0.773 0.395 0.146
所得浓缩液体积
The volume of condensate/μL 200 80 200 200 100 95
浓缩所得蛋白总量 The amount of
total protein after condensing/μg 48.8 46.8 147.6 154.6 39.5 14.6
2.3　不同提取方法的粗提取液浓缩结果
用粗体液 2倍体积的冷丙酮对 6种不同提取方案
所得的蛋白粗提液进行了浓缩处理 ,并对浓缩所得的蛋
白溶液进行了浓度测定和 SDS-PAGE电泳检测 ,结果表
明 ,对相同体积的蛋白粗体液进行浓缩 ,所得的蛋白量
有明显的差异 ,方法Ⅲ和Ⅳ显著高于其它 4种方法 , Ⅲ和
52
北方园艺 2009(11):51 ～ 53 ·试验研究 ·
Ⅳ间差异不大 ,方法Ⅳ略高于Ⅲ。电泳检测结果与此相
对应 ,泳道Ⅲ和Ⅳ检出的清晰蛋白条带最多 ,最亮(图3),
表明 2种方法所得的蛋白溶液中的蛋白含量最高 ,考虑
到提取液中去污剂添加量太大也会对后续试验带来些
许不利影响 ,所以综合考虑 ,方法Ⅲ是最理想的提取
方案。
3　结论与讨论
丙酮浓缩法一直是蛋白溶液浓缩的常用方法 ,但不
同材料通常要用不同的丙酮用量 ,才能达到最理想的结
果。丙酮体积太少 ,蛋白溶液中的蛋白分子沉淀不完
全 ,会影响最后的蛋白得率;但若使用的丙酮量太大 ,蛋
白分子收缩太严重 ,使复性困难 ,最后得到的蛋白浓缩
液也是明显偏低的。所以该试验中以 2倍体积丙酮所
得的结果最理想 ,与在桃叶片材料上的结果相一致[ 10] 。
蛋白提取缓冲液中 ,加入去垢剂可以提高蛋白在缓
冲液中的溶解度 ,从而使蛋白分子更容易从材料中游离
出来。去垢剂分为离子型(如十二烷基硫酸钠(SDS))和
非离子型(如 TritonX-100 , Tw een-20等)。离子型去垢
剂的缺点是使蛋白质高度变性 ,后续试验需要保持蛋白
活性的就不宜使用;而非离子型去垢剂对蛋白和蛋白间
的相互作用干扰较弱 ,对于分离功能性的蛋白复合物较
为有利[ 11] 。该试验对 2%SDS 和 0.1%、0.5%、1.0%
Tween-20进行了比较试验 ,结果表明 ,蛋白提取缓冲液
中添加 0.5%Tween-20是最理想的。
PVPP可以结合材料中酚类物质 ,保护蛋白质不被
氧化分解。杏树皮材料中的酚类物质含量较高 ,所以试
验设计方法Ⅴ中提高 PVPP的用量达 10%(w/v),结果
所得蛋白溶液中的蛋白含量比对照(添加 1%(w/v)的
PVPP)略有提高 ,但仍远远低于方法Ⅲ(0.5% Tween-
20+1%(w/v)的 PVPP)所的蛋白含量(表 1 、3),可见 ,
PVPP的用量也不是越多越好。
综合分析 6种蛋白提取方案 ,最后确定杏树皮可溶
性总蛋白提取的最佳缓冲液体系为:5 mL 50 mmol/L 的
Tris-HCl缓冲液(其中含2mM EDTA-Na2 ,10 mmol/L 抗
坏血酸 ,0.5 mmol/ L DTT ,0.1 mmol/ L PMSF ,1%(w/v)
PVPP ,pH 8.0)和 0.5%Tween 20。丙酮浓缩方法中:加
入蛋白粗提液 2倍体积的冷丙酮是最理想的。经过提
取和浓缩的蛋白浓度可达 0.773 μg/μL ,电泳分析中的
条带清晰 ,可用于后续的目的蛋白纯化试验及功能分
析。
参考文献
[ 1] 　谷瑞升,刘群录 ,陈雪梅 ,等.木本植物蛋白提取和 SDS-PAGE分析
方法的比较和优化[ J] .植物学通报, 1999, 6(2):171-177.
[ 2] 　尉姗姗,尹林克 ,牟书勇 ,等.新疆沙冬青抗冻蛋白的提取分离及其
热滞活性测定[ J] .云南植物研究 ,2007 ,29(2):251-255.
[ 3] 　Zhang J H , Huang W D ,Pan Q H ,et a1.Improvement of chiling toler-
ance and accumulation of heat shock proteins ingrape berry by heat-pretreat-
ment[ J] .Postharvest Biology and Technology , 2005, 38(1):80-90.
[ 4] 　张俊环,黄卫东.葡萄幼苗在温度逆境交叉适应过程中活性氧及抗
氧化酶的变化[ J] .园艺学报 ,2007 ,34(5):1073-1080.
[ 5] 　康国章,王正询,孙谷畴.植物的冷调节蛋白[ J] .植物学通报, 2002,
19(2):239-246.
[ 6] 　费云标,魏令波 ,高素琴 ,等.沙冬青抗冻蛋白分离纯化及其理化特
性分析[ J] .科学通报 , 2000 ,45(20):2185-2189.
[ 7] 　刘尚 ,廖祥儒 ,张建国,等.一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化[ J] .植物
学通报 , 2007 ,24(4):505-510.
[ 8] 　Bradford N M.A rapid and sensit ive method for the quantitation mi-
crogram quant ities of protein utilizing the principleof protein-dye binding[ J] .
Analyt ical Biochemist ry , 1976 , 72:248-259.
[ 9] 　Laemmli U K.Cleavage of st ructural protein during the assembly of
the head bacteriophage T4[ J] .Nature ,1970 ,227:680-683.
[ 10] Wang X Q , HuangW D ,Zhan JC.Effect of low light on the activity of
sucrose synthase in leaves of Nectarine[ J] .The Journal of Horticultural Sci-
ence &Biotechnology ,2005 ,80(3):358-362.
[ 11] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M] .北京:科学出版社 ,2000:60-668.
Study on the Extracting and Condensing Methods of Total
Proteins from the Shoot Barks of Apricot
ZHANG Jun-huan , WANG Yu-zhu , SUN Hao-yuan , YANG Li
(Institute of Pology and Fo restry , Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences , Beijing 100093 , China)
Abstract:The condition of ext racting soluble total proteins from the shoot barks of apricot by different solvents was dis-
cussed.The optimum extracting condition was determined as:50 mmol/L Tris-HCl buffer ,pH 8.0 , containing 2 mmol/ L
EDTA-Na2 ,10 mmol/L ascorbic acid , 0.5 mmol/L DTT , 0.1 mmol/L PMSF , 1%(w/v)PVPP and 0.5%(w/v)
Tween20.The acetone condensing method was also investigated and the results showed that the volume ratio of the rude
protein extracts to acetone was 1 ∶2 , the reacting result was most desirable:the protein concentration was higher to
0.773 μg/μL , and many clear bands was detected by SDS-PAGE , which indicating that the protein ext racts had a good
quality for deeply study , such as protein purification and function analysis.
Keywords:Apricot;Shoot bark;Soluble total proteins;Ex traction
53