全 文 ：第 2 期
收稿日期：2009－09-28
基金项目：重庆市教育委员会科技研究项目（KJ091213）
作者简介：徐文峰（1968－），男，浙江兰溪人，副教授，从事材料化学教学与科研工作，（电话）023－49682200（电子信箱）xwf＿228＠163．com。
第 49卷第 2期
2010年 2月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.2
Feb．，2010
目前， 我国在计量测试和疫病控制分析领域，
进行测量不确定度评定已较普遍，但在化学分析领
域，尤其在食品分析领域，对测试结果进行测量不
确定度评定的尚不多见。 针对维生素 HPLC法测定
结果的不确定度评定研究， 目前也主要有奶粉中
VA含量［1］、饲料中 VB2［2］、茶油中 VE［3］、乳粉中 VB2［4］
的测量不确定度评定，HPLC 法同时测定蔬菜中 VC
（维生素 C）、VB2（核黄素）、VPP（烟酸）含量的不确
定度评定还未见报道。
番杏又称新西兰菠菜，原产澳大利亚、新西兰
等地，含有多种维生素和钙铁，还含有一定量的单
宁。 番杏可全株入药，有凉血、解毒、利尿、消疮疥、
解蛇毒的功效，对胃癌、食道癌有治疗作用，是我国
新品种蔬菜。 本文用反相高效液相色谱法，在优化
条件的基础上， 对连续测定番杏中 VC、VB2和 VPP
含量的测量不确定度进行评定。 其结果对 HPLC法
联测蔬菜中多种维生素结果的可信度提供了参考
依据。
1 材料与方法
1．1 仪器和试剂
LC－2010C HT 高效液相色谱仪 （日本岛津）；
AS 10200AT 超声清洗器（天津奥特）；FA2104 电子
天平（上海民桥）；PHS－P1酸度计（上海电光）。
甲醇（色谱纯，天津四友）；抗坏血酸（VC，重庆
博艺）；核黄素（VB2，国药集团）；烟酸（VPP，国药集
团）；乙酸（重庆川东）；VC（32μg ／mL）、VB2（16μg ／mL）、
VPP（16 μg ／ mL）标准溶液：准确称取标准品抗坏血
HPLC法联测番杏中VC，VB2和VPP的不确定度评定
徐文峰
（重庆文理学院化学与环境工程学院，重庆 402160）
摘要：通过对高效液相色谱法连续测定番杏中 VC、VB2、VPP 含量的全过程进行分析，建立评定模型，确
定不确定度的来源，并对测定过程中的不确定度分量进行了计算评估和合成。 结果表明，测量 VC 含量
为 0．28 mg ／ g 时， 扩展不确定度为 0．008 4 mg ／ g； 当测出 VB2含量为 0．001 3 mg ／ g 时， 扩展不确定度为
0．000 12 mg ／ g；当测出 VPP 含量为 0．004 7 mg ／ g 时，扩展不确定度为 0．000 79 mg ／ g。 评定结果对 HPLC
法联测蔬菜中多种维生素结果的可信度提供了参考依据。
关键词：番杏；VC；VB2；VPP；不确定度；评定
中图分类号：O657．7＋2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）02－0443-04
Uncertainty Evaluation of Simultaneous Determination of VC，VB2 and VPP
in New Zealand Spinach by HPLC
XU Wen－feng
（College of Chemistry and Environment Engineering， Chongqing University of Arts and Sciences， Chongqing 402160， China）
Abstract： The uncertainty in determination of vitamin C（VC）， vitamin B2（VB2） and nicotinic acid （VPP） in New Zealand
spinach was modeled on the base of the full analysis． Each component of uncertainty was evaluated and combined to estab-
lish the source of uncertainty． The results showed that the contents of VC， VB2 and VPP were 0．28， 0．001 3 and 0．004 7
mg ／ g， respectively， and then their expanded uncertainties were 0．008 4， 0．000 12 and 0．000 79 mg ／ g， respectively． This pa-
per provided a reference to verify credibility of HPLC results of multi－vitamin in vegetable．
Key words： New Zealand spinach； vitamin C； vitamin B2； nicotinic acid； uncertainty； assessment
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.02.008
湖 北 农 业 科 学 2010 年
酸 0．032 0 g，核黄素 0．016 0 g 和烟酸 0．016 0 g 用水
定容到 1 000 mL。 试剂未注明的为分析纯，水为超
纯水。
1．2 试验方法
1．2．1 测定原理 样品经处理后，注入 HPLC中，经
色谱柱分离，进入 UV 检测器，在 260 nm 处测定色
谱峰面积，外标法计算 VC、VB2、VPP的含量。
1．2．2 色谱条件 色谱柱： 依利特 C18 （4．6×250
mm，5 μm）柱，柱温 24℃；流动相：甲醇－乙酸水溶液
（75∶25，V ／ V，pH 值为 5）； 进样量 10 μL； 流速 1．0
mL ／ min；检测波长 260 nm。
1．2．3 测试过程 用研钵将洗净阴干、粉碎后的番
杏研碎， 用电子天平称取 100 g， 加入 30 mL 超纯
水，超声 15 min，将滤渣进行抽滤后定容到 100 mL
棕色容量瓶，2 000 r ／ min 离心 10 min， 重复操作 2
次，上清液过 0．45 μm微孔膜过滤，在上述色谱条件
下进行测定。 在色谱条件下，标准溶液在室温下超
声 15 min，经微孔膜（0．45 μm）过滤进样。
1．3 数学模型
番杏中维生素含量（X）按下式计算：
X＝ Ai×Cs×100
As×100
×10－3
式中，X 为试样中样品的含量，Cs 为标准溶液
浓度，As为标准品峰面积，Ai为样品峰面积。
2 不确定度来源分析
经对高效液相色谱法联测番杏中 VC、VB2、VPP
的方法过程分析，其测量结果的不确定度主要有表
1的 5个来源。
2．1 标准溶液配制引入的不确定度
2．1．1 标准品纯度引入的不确定度 标准品抗坏
血酸的纯度为 99．7％，核黄素的纯度为 99．7％，烟酸
的纯度为 99．5％，取矩形分布，k＝ 3姨 ，计算得标准
品的不确定度：
u（VC）＝0．003 ／ 3姨 ＝0．001 7
u（VB2 ）＝0．003 ／ 3姨 ＝0．001 7
u（VPP）＝0．005 ／ 3姨 ＝0．002 9
计算得标准品纯度的相对标准不确定度：
urel（1VC）＝0．001 7 ／ 99．7％＝1．7×10－3
urel（1VB2 ）＝0．001 7 ／ 99．7％＝1．7×10
－3
urel（1VPP）＝0．002 9 ／ 99．5％＝2．9×10－3
2．1．2 电子天平称量引入的不确定度 称取标准
品使用的是分度值为 0．1 mg 的电子分析天平，称重
引入的不确定度按矩形分布，k＝ 3姨 计算得：
u1（m）＝0．000 1 ／ 3姨 ＝0．000 058（g）
根据文献［5］，计算分辨率产生的不确定度：
u2（m）＝0．000 01×0．29＝0．000 002 9（g）
因称量是分皮重和毛重两次，故合成不确定度
为：
u1（m）＝ 2（u21（m）+u22（m））姨 ＝0．000 082（g）
计算标准品称量的相对标准不确定度为：
urel（mVC）＝0．000 082 ／ 0．032＝0．002 6
urel（mVB2 ）＝0．000 082 ／ 0．016＝0．005 1
urel（mVPP）＝0．000 082 ／ 0．016＝0．005 1
2．1．3 容量瓶引入的不确定度 将标准品溶解定
容至 1 000 mL，1 000 mL 容量瓶（A 级）的允许误差
为±0．4 mL，溶液的温度与校正时的温度不同引起的
体积不确定度（试验温度为 20±5℃，由于液体的膨
胀体积明显大于玻璃，因此，只考虑前者即可，水的
体积膨胀系数为 2．1×10－4 ／℃），按矩形均匀分布，k＝
3姨 ，计算得标准品的不确定度为：
u（V）＝0．4 ／ 3姨 ＝0．23（mL）
u（T）＝
1 000×5×2.1×10-4
3姨
＝0．61（mL）
计算得容量瓶体积的相对标准不确定度为：
urel（mL）＝ 0.23
2+0.612姨
1 000
＝0．000 65
通过以上分析计算出的标准液制备过程中，不
确定度来源的各组成引入的不确定度，则可计算出
待测 VC、VB2 和 VPP 的标准溶液配制过程引入的
相对标准不确定度为：
VC：urel（1）＝ u2rel（1VC）+u2rel（mVC）+u2rel（mL）姨 ＝3．15×10－3
VB2：urel（1）＝ u2rel（1VB2）+u2rel（mVB2 ）+u2rel（mL）姨 ＝5．40×10－3
VPP：urel（1）＝ u2rel（1VPP）+u2rel（mVPP）+u2rel（mL）姨 ＝5．89×10－3
2．2 样品制备过程引入的不确定度
2．2．1 取样引入的不确定度 本试验将番杏叶捣
碎后随机取样，可认为样品是均匀的，由此所致的
不确定度忽略不计。
2．2．2 称重引入的不确定度 用分度值为 0．1 mg
的电子分析天平，样品称重引入的不确定度按矩形
表 1 不确定度来源
序号
1
2
3
4
5
不确定度分量
urel（1）
urel（2）
urel（3）
urel（4）
urel（5）
不确定度来源
标准液制备过程
样品制备过程
标准的曲线拟合
测定重复性
仪器定量测量重复性
不确定度来源组成
标准品纯度、称重、1000mL
容量瓶体积和温度
样品称重、100mL 容量瓶
体积和温度
VC、VB2、VPP 的标准曲线
样品重复性试验
仪器的校准证书规定
444
第 2 期
分布，k＝ 3姨 计算得标准品的不确定度为：
u（m）＝0．000 1 ／ 3姨 ＝0．000 058（g）
根据规程［3］，计算分辨率产生的不确定度：
u2（m）＝0．000 01×0．29＝0．000 0029（g）
因称量是分皮重和毛重两次，故合成不确定度
为：
u1（m）＝ 2（u21（m）+u22（m））姨 ＝0．000 082（g）
计算标准品称量的相对标准不确定度为：
urel（m）＝0．000 082 ／ 100＝8．20×10－7
2．2．3 样品定容引入的不确定度 样品经提取后
定容至 100 mL，20℃时 100 mL A 级容量瓶的允差
为±0．10 mL，同 2．1计算得标准品的不确定度为：
u（V）＝0．1 ／ 3姨 ＝0．058（mL）
u（T）＝
1 000×5×2.1×10-4
3姨
＝0．061（mL）
计算得容量瓶体积的相对标准不确定度为：
urel（mL）＝ 0.058
2+0.0612姨
1 000
＝8．40×10－4
2．2．4 回收率引入的不确定度 由于样品前处理
不完全或处理过程中导致 VC、VB2、VPP 的损失，使
得番杏中的维生素不能 100％进入到测定液中，通
过加标回收率试验 ，VC 的加标回收率为 98．0％～
100．6％，VB2 加标回收率为 97．2％～100．2％，VPP 的
加标回收率为 99．0％～102．6％，上下界不对称，样品
回收率的不确定度按 JJF1059－1999 第 5．8 节公式
计算［3］，得样品回收率的不确定度：
u（VC）＝
（2%+0.6%）2
100姨 ＝0．007 51
计算 VC相对标准不确定度为：
urel（2VC）＝0．007 51 ／ 100％＝7．51×10－3
同理，计算 VB2、VPP的相对标准不确定度为：
urel（2VB2 ）＝0．008 66 ／ 100％＝8．66×10－3
urel（2VPP）＝0．010 3 ／ 100％＝1．03×10－2
通过以上分析计算出的样品制备过程中，不确
定度来源的各组成引入的不确定度，则可计算出待
测 VC、VB2 和 VPP 的样品制备过程引入的相对标
准不确定度为：
VC：urel（2）＝ u2rel（m）+u2rel（mL）+u2rel（2VC）姨 ＝7．56×10－3
VB2：urel（2）＝ u2rel（m）+u2rel（mL）+u2rel（2VB2 ）姨 ＝8．69×10－3
VPP：urel（2）＝ u2rel（m）+u2rel（mL）+u2rel（2VPP）姨 ＝1．03×10－2
2．3 标准曲线拟合引入的不确定度
为评定由曲线拟合引起的不确定度，试验选用
了 VC、VB2、VPP 的 6 个不同浓度的标准溶液来进
行工作曲线校准，每个浓度标准做 9 个平行，如表 2
所示。 相应的峰面积值 y，得到直线方程 y＝a＋bC，根
据信噪比（S ／ N＝3）计算检出限，见表 3。 由于可以认
为测得的浓度值与标准溶液浓度的标称值的差异
主要来自拟合偏差，故忽略标准溶液标称值的不确
定度。
本例对番杏样品测定液进行了 2 次测量，由标
准工作曲线方程求得 3 种维生素质量浓度 X 的平
均值 C0见表 4。
由此，在 C0浓度下由曲线拟合引起的不确定度
为：u （C0）＝
S（y）
b
1
p
+ 1
n
+ （c0-c
軃）2
Sc姨 ＝0．036 mg ／ mL，
其中标准溶液峰面积的残差的标准差 s （y）＝
∑
n
i=1 ［yj-（a+bCj）］2
n-2姨 ＝187．55； 标准溶液浓度的残
差 s（c）＝∑
n
i=1 ［（Cj－C）］2＝358．40；标准溶液平均浓度
C＝［（3．2＋6．4＋9．6＋12．8＋16．0＋19．2）×2］ ／ 12＝0．011 2
mg ／ mL； 标准溶液的测量次数 n＝12；C0的测量次数
p＝2。
因此，曲线拟合的相对标准不确定度为：
VC：urel（3）＝
uCo
Co
＝0．036 ／ 0．28＝1．25×10－2
同理：VB2：urel（3）＝
uCo
Co
＝0．000 060 ／ 0．001 3＝4．60×
10－2
VPP：urel（3）＝
uCo
Co
＝0．000 41 ／ 0．004 7＝8．70×10－2
表 2 VC 标准工作溶液峰面积的测定值
序号
1
2
3
4
5
6
VC 标准溶液
C//μg/mL
3.2
6.4
9.6
12.8
16.0
19.2
试验 1
40503
98732
179760
243381
316184
528041
试验 i
……
……
……
……
……
……
试验 9
42063
99544
173097
240611
318058
532351
峰面积
表 3 各维生素的线性回归方程
序号
1
2
3
标准品
VC
VB2
VPP
回归方程
y1 =185 28C-35340
y2 =124 82C+160.9
y3 =138 24C+191.6
相关系数 r
0.999 9
0.999 9
0.999 9
检出限//μg/mL
0.016 6
0.010 1
0.012 5
表 4 番杏中 3 种维生素的含量
序号
1
2
3
维生素名称
VC
VB2
VPP
X 含量//mg/g
C0=0.28
C0=0.0013
C0=0.0047
徐文峰：HPLC 法联测番杏中 VC，VB2和 VPP 的不确定度评定 445
湖 北 农 业 科 学 2010 年
2．4 测定重复性引入的不确定度
在色谱条件下， 对番杏液进行了 9 次独立测
试，获得番杏液中 VC、VB2、VPP 的测定峰面积值和
平均值：AOVC＝99 717，AOVB2 ＝50 062，AOVPP＝61 028．67。
标准溶液峰面积的不确定度按文献［6］贝塞尔公式
计算：
u（3VC）＝
∑（Aoi-Ao ）2
n-1姨 ＝1．08×102
u（3VB2 ）＝
∑（Aoi-Ao ）2
n-1姨 ＝11．61×103
u（3VPP）＝
∑（Aoi-Ao ）2
n-1姨 ＝12．20
相对标准不确定度为：
VC：urel（4）＝1．08×102 ／ 99 719＝1．08×10－3
VB2：urel（4）＝11．61 ／ 50 062＝2．31×10－4
VPP：urel（4）＝12．20 ／ 61 028．67＝2．00×10－4
2．5 仪器定量测量重复性引入的不确定度
定量测定重复性的相对标准不确定度由仪器
的校准证书提供：urel（5）＝3．00×10－3
2．6 不确定度来源的分量结果
通过以上分析和计算 HPLC 法联测番杏 VC、
VB2、VPP 含量的各个方面的不确定度来源，最终确
定出 HPLC 法联测番杏中 VC、VB2、VPP 含量的各
分量不确定度的评定方法和相对标准不确定度的
评定结果，见表 5。
表 5 不确定度分量统计表
序号
1
2
3
4
5
符号
urel（1）
urel（2）
urel（3）
urel（4）
urel（5）
不确定度来源
标准液制备过程
样品制备过程
标准的曲线拟合
样品测定重复性
仪器定量测量重复性
评定方法/分布
B 类/矩形分布
B 类/矩形分布
A 类
A 类
B 类/矩形分布
VC
3.15×10-3
7.56×10-3
1.25×10-2
1.08×10-3
3.00×10-3
VB2
5.40×10-3
8.69×10-3
4.60×10-2
2.31×10-4
3.00×10-3
VPP
5.89×10-3
1.03×10-2
8.70×10-2
2.00×10-4
3.00×10-3
3 结果与报告
3．1 总的相对标准不确定度合成
计算合成总的相对标准不确定度得：
urel（VC）＝ u2rel（1）+u2rel（2）+u2rel（3）+u2rel（4）+u2rel（5）姨 ＝0．015 1
urel（VB2 ）＝ u2rel（1）+u2rel（2）+u2rel（3）+u2rel（4）+u2rel（5）姨 ＝0．046 9
urel（VPP）＝ u2rel（1）+u2rel（2）+u2rel（3）+u2rel（4）+u2rel（5）姨 ＝0．087 7
3．2 相对扩展不确定度的计算
取包含因子 K＝2，则相对扩展不确定度：
Urel（VC）＝Kurel（VC）＝2×0．015 1＝0．030，
Urel（VB2 ）＝Kurel（VC）＝2×0．046 9＝0．094
Urel（VPP）＝Kurel（VPP）＝2×0．087 7＝0．17
由 X（VC）＝0．28 mg ／ g，X（VB2 ）＝0．001 3 mg ／ g，X（VPP）＝
0．004 7 mg ／ g得测定结果的相对扩展不确定度：
U（VC）＝Urel（VB2 ）×X（VC）＝0．030×0．28＝0．008 4（mg ／ g）
U （VB2 ）＝Urel （VB2 ）×X （VB2 ）＝0．094×0．001 3＝0．000 12
（mg ／ g）
U（VPP）＝Urel（VPP）×X（VPP）＝0．17×0．004 7＝0．000 79（mg ／
g）
高效液相色谱法联测番杏中 VC、VB2、VPP 含
量的测量不确定度报告见下表 6。
4 小结
通过对高效液相色谱法连续测定番杏中 VC、
VB2、VPP 含量的全过程中，不确定度的来源的分析
与计算， 建立了评定模型， 得出了评定结果，为
HPLC 法联测蔬菜中多种维生素结果的可信度提供
了评定参考依据。
参考文献：
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确定度评定分析［J］．中国计量， 2007（4）：87－89．
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［6］ 李慎安，王玉莲，范巧成．化学实验室测量不确定度［M］．北京：化
学工业出版社，2006．10．
表 6 不确定度报告表
序号
1
2
3
名称
VC
VB2
VPP
测定值 X//mg/g
0.28
0.0013
0.0047
扩展不确定度 U
0.008 4
0.000 12
0.000 79
测量结果//mg/g
0.28±0.008 4
0.001 3±0.000 12
0.004 7±0.000 79
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