全 文 ：从鸡肝散 、银杏叶和金钱草中提取分离黄酮及抗氧化活性研究
高云涛 , 李羚 , 戴建辉
校 , 云一打保妇
贝玉祥 , 郭英 ` ,云南民族大学化学与生物技术学院, 昆明, 保 师`范高等专科学
摘要 目的 研究超声波与丙醇一硫酸按双水相搞合从 种提取分离黄酮的工艺条件及参数及提取物抗氧化活性 。方法 以
一 分光光度法测定总黄酮 , 研究丙醇一硫酸按双水相形成条件及超声提取条件对总黄酮提取率的影响 , 优化提
取条件 , 以 为脂质过氧化促进剂 , 以卵磷脂脂质体为模型研究提取物杭氧化活性。结果 对 种中药中总黄酮的提取率
在 一 之间 , 与回流提取法相近 , 而提取物中总黄酮含量为 一 , 明显高于回流提取法 , 提取物对脂质过
氧化最大抑制率在 一 之间。结论 方法可有效地从中药中提取黄酮 , 提取物对脂质过氧化具有良好的抑制作用 ,
方法操作简便 、条件温和 , 环境友好 , 适于中药中黄酮的提取 。
关键词 超声波提取 双水相分离 中药 黄酮
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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黄酮类化合物 是植物次生代谢产 要的黄酮 包括异鼠李素 、 山奈酚 、棚皮素 、黄茂
物 , 研究表明黄酮具有多种生物活性 。鸡肝散 、 营 、三叶豆普 、金丝桃营 、蒙花昔橙皮着 、异鼠李
银杏叫一和金钱草是以黄酮为主要活性成分的中药 , 素 、芦丁等。
鸡肝散又名四方篙 , 为唇形科香蕾属 黄酮类化合物因其热敏性 , 传统的方法如溶剂
植物 , 银杏叶系银杏属落叶乔木银杏 浸提法 、微波萃取法 、酶法提取法等需在加热条件
心。 之叶 , 金钱草 , 又称大金钱 进行 , 提取过程可能造成活性损失 , 而超临界萃取
草 , 为报春花科植物过路黄为心 。 。 法则设备成本较高。超声波提取法 是利用超声波
的全草 。鸡肝散黄酮类成分 主要有木犀草 的 “空穴作用 ”产生的冲击波和射流破坏植物细胞
素及其营类 、及芹菜素及其普类和 一轻基一 , 一二甲 和细胞膜结构 , 使黄酮化合物的释放与溶出 , 过程
氧基黄酮营类 银杏叶黄酮类化合物 主要由棚皮 的温度较低可有效保持提取物的生物活性 。
素 、 山奈素 、异鼠李素及其黄酮普组成 金钱草主 双水相萃取分离技术 。
基金项目 云南省社会发展科技计一划资助项日 百南省教育厅科学基金资助项 国家民委一教育部共建民族药资源
化学重点实验室开放基金资助项
作者简介 高 、涛 , 男 , 教授 , 硕 生导师 研究方向 药物化学 介 一 龙
· · , 人轰了, 玲 , ,国药学杂志 生不三 月第 卷第 期
extract ion , 是报道较多的一种新型分离技术 。
传统的聚合物一盐双水相因使用粘度较大的聚合物 ,
成本高 , 不易后续处理 , 限制了该法的应用。近年
来报道了一种低级醇一盐双水相水体系 , 在普通的
水溶性有机溶剂如丙醇一`护加入无机盐 , 利用无机盐
的水化作用形成水溶低级醇一盐双水相体系 ,该法克
服了传统双水相技术缺点 , 易于放大 , 并易与其它
技术集成 , 近年来受到人们关注 。
本实验以超声提取和丙醇一硫酸钱双水相进行
集成 , 将超声提取良好的提取作用与双水相水分离
结合 , 实现提取与分离两个过程合为一体 , 对鸡肝
散 、银杏叶和金钱草 种富含黄酮的传统中药中的
黄酮进行提取分离研究 。
材料与方法
实验材料与试剂
鸡肝散全草 云南昆明金殿制药有限公司
银杏叶 年 月采自云南大学校园 金钱草
全草 年 月采自云南丽江 , 均由云南大学
马绍宾教授鉴定。 种药材经自然风干 , 用植物粉
碎机粉碎至 目备用 。 溶液
溶液 卵磷脂溶液 一 , 用 卵
磷脂溶解于 ·一 , 冰浴震
荡 一一, 缓冲液 一硫代巴比妥
酸 溶液 一, 三氯乙酸 溶液
一, , 用前配制 一 溶液
·一。所用试剂均为分析纯 , 实验用水为二次
蒸馏水 。
仪器
超声波清洗器 , 型紫外一可见分
光光度计 上海第三分析仪器 一 , 旋转蒸发仪 上
海亚荣生化仪器厂 。
挥发干燥除去残余的石油醚 。
滤渣加入 水 、 丙醇 , 浸泡
, 加入 硫酸钱形成双水相体系 , 以超声提
取一定时间 , 于分液漏斗中静置层 , 上层丙醇相清
液以体积分数 乙醇定容 , 此溶液为总酮提取
液 , 测定总黄酮含量 , 计算总黄酮得率。
总黄酮含量测定
提取物中黄酮含量以总黄酮计算 , 测定方法参
考文献 , 以芦丁为标准 , 在总黄酮提取液中加入
溶液 , 使黄酮化合物与铝盐形成稳定的有
色络合物 , 在波长 处测定吸光度值 , 用标
准曲线法计算黄酮含量 。
对脂质过氧化抑制活性的测定
以卵磷脂脂质体为模型 , 卵磷脂可被· 氧
化损伤产生丙二醛 类似物 , 可与
类似物反应生成粉红色物质 , 该物质在 处
有最大光吸收 , 加入提取物溶液后 , 可有效抑制
的生成 , 进而反映其对脂质过氧化抑制活性 。
取 。` ·一,卵磷脂溶液 , 加入
缓冲液 , 不同浓度的样品溶液 ,
·一 认 一 ,混匀后于 ℃水浴
中反应 , 再加入 一的 ,
一,的 , 混匀后置于 沸水浴
中加热 ,冷却后在 处测定吸光度 样,
用 缓冲液调零 , 空白管用 缓冲液代替样
品测吸光度 。。并按下式计算一抑制率
抑制率 旦凡
方 法
低级醇一盐双水相体系
低级醇一盐双水相水体系参考文献阴 , 其中水溶
性有机溶剂选择丙醇 , 成相盐选择硫酸钱 , 通过改
变丙醇与水的比例和盐的用量可以控制双水相体
系的形成 。本文选择的双水相体系是 水 、
丙醇和 硫酸按 。
总黄酮的超声提取与双水相分离
准确称取所用药材粉碎至约 目 ,称取
于 具塞锥形瓶中 , 加入 石油醚超声
波提取 以除去脂溶性成分 , 过滤 , 滤渣室温
结果与讨论
双水相的形成及对总黄酮得率的影响
丙醇一硫酸钱双水相的形成 丙醇能与水无
限互溶 , 若在丙醇一水体系中加入某种盐 , 由于盐对
于丙醇有更强的水化作用 , 减弱了水与丙醇的结合
力 , 当盐加入量达到一定程度时 , 会将丙醇从水中
排斥出去 , 从而形成双水相 , 因此 选择析相用的
盐一般有较高的水合作用 ,常用的析相盐睁 主要有
, , , 认 , ,
, 。或 等 。
恒定丙醇体积 , 分别加入不同量的
, , , , ,
, 或 , 考查丙醇一盐双水相的分
相情况 , 结果发现 , 这些盐均能使丙醇一水不同程度
地分相 , 其中 , 及 的分相能力较
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差 ,而 今 , , 和 有较
好的分相能力 , 但考虑到 和 在室温
溶解度太低 , 本文选择 盐析试剂 , 其优
点是价格便宜 , 水溶性好 , 温度效应低。
恰好分相所需的伽氏 用量与丙醇初始体
积的关系见图 。从图 可知 , 不同丙醇初始体积
丙醇与水完全分离分相所需的伽 不同 , 丙
醇初始体积越大 , 所需的硫酸钱就越少 , 这与水的
相对活度有关 , 当初始组成中水的活度越低则平衡
所需的盐就越少。
硫酸钱用量对黄酮得率的影响 硫酸馁用
量对总黄酮得率的影响见图 , 从图 可知 , 随着
硫酸按用量增加 , 种中药总黄酮得率增加 , 当硫
酸钱用量达 时 , 总黄酮得率达到最大 , 但当硫
酸按用量超过 后 , 总黄酮得率则开始下降 。
双水相的形成是伽 小 与丙醇争夺水分子
的过程 , 随着州 小 用量 , 对水的束缚能力增
强 , 丙醇从盐水相中析出 , 而水分子也离开丙醇相 ,
结果 , 丙醇相对浓度增加 , 对具有醇溶性的黄酮的
萃取能力增强 , 其结果导致总黄酮得率增加。
提取溶剂体积对总黄酮得率的影响 提取
溶剂丙醇一水比例对总黄酮得率的影响见图 , 在
一 范围内 , 丙醇体积比例增加总黄酮得率
也随之增大 ,丙醇体积分数大于 后总黄酮得率
保持不变 , 且体系出现混浊 , 本实验选定的 丙
醇水作为提取溶剂 。
结合图 一 ,本实验采用的双水相的由
水 、 丙醇和 硫酸钱所构成 。
提取条件对总黄酮得率的影响
提取条件包括超声时间和料液比 , 研究表明 ,
不加超声时总黄酮得率很低 , 随超声时间的增加总
黄酮得率增大 , 超声时间达 , 种药材的总
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图 硫酸钱用量对总黄酮得率的影响 。 , 万幻
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图 丙醇体积分数对总黄酮得率的影响 ,
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图 恰好分相所需的刊 礴 认用量与丙醇体积分数的关系
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黄酮得率达到最大 , 当超声时间超过 后总黄
酮得率开始减少 ,木实验选定的超声时间为 。
黄酮得率随料液比的减少而增大 , 料液比在 一
之间时 , 得率增加较明显 , 大于 时得率增
加明显变小 , 料液比过高可导致溶剂的用量 , 也给
后续处理带来不必要的麻烦 , 因此 , 料液比在
较合适 。
不同提取方法的比较
将本法与常规剂乙醇一水回流提取法进行比
较研究 , 本法的提取分离条件为丙醇体积分数为
, 硫酸馁用量为 , 超声时间为 ,
倍溶剂 , 乙醇一水回流提取法条件为 乙醇
水 , 回流时间 , 倍溶剂。在提取结束时测
定溶液的温度。分别回收溶剂 , 常温条件下避光
真空干燥 , 获得总黄酮提取物 , 称量后称取部
分以乙醇溶解 , 以 乙醇配制成待测溶液 , 测
定总黄酮含量 , 计算提取物中总黄酮含量 , 结果
见表 。
从表 可知 , 对于 种中药 , 本法总黄酮得率
为 一 , 乙醇一水回流提取法总黄酮得率
为 一 , 种方法的得率相近 , 但是 ,
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表 不同提取方法的比较
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图 提取物对脂质过氧化的抑制作用 一 , 万幼
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本法提取温度低 、条件温和 , 所需时间较短 , 提取
物总黄酮含量为 一 ,明显高于回流法的
一 , 这意味着使用本法所得到的粗提取
物纯度更高。
黄酮具有较好的醇溶性 , 在丙醇一硫酸钱双水
相体系分配十丙醇上相 , 而其它水溶性成分如糖
类等则分配于盐水下相中 , 超声波可将细胞中的
果胶 、淀粉等大分了多糖降解成更易溶于水的木
聚糖 、甘露聚糖 、葡聚糖等 , 提高了水溶性成分
的得率 , 这部分水溶性成分可分配于盐水相从而
在提取时同时实现了黄酮与某些无效成分的分
离 , 提高了产物的纯度 。同时 , 黄酮产物转移至
丙醇上相 , 可改变提取过程中的化学平衡 , 有利
于黄酮的溶出 。
提取物对脂质过氧化的抑制作用
脂质过氧化主要发生在细胞膜上 , 细胞膜的主
要成分是磷脂和蛋白质 , 其中磷脂最容易发生脂质
过氧化反应 , 很多疾病和衰老与脂质过氧化有关 。
引起 是生物体内最主要的脂质过氧化促进剂 。
本文以 为脂质过氧化促进剂 , 以卵磷脂脂质体
为模型 , 在 一下测定本法所得的提取物对
卵磷脂脂质过氧化的抑制作用 , 结果见图 , 当抑
制率达到 时 , 鸡肝散提取物 听 一 ,
金钱草提取物 一 一 , 银杏叶提取物
一 一`。最高抑制率 鸡肝散提取物
一 ,银杏叶提取物 ·一 ,
金钱草提取物 一, , 这说明本法
所得的提取物对卵磷脂脂质过氧化的抑制作用较
好 , 方法较好地保持了中药黄酮的活性 。
体系可祸合集成 , 应用 中药中黄酮类化合物的提
取分离 , 可缩短提取时间 、提高得率 , 降低提取温
度 , 有利于热敏成分的分离 , 获得较高纯度高抗氧
化活性的物质 , 在中药科研和开发中展现了良好的
应用前景 。
结 论
本文的研究表明 ,超声波与丙醇一硫酸按双水相
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