全 文 ：东北刺人参体细胞胚状体的诱导及体细胞胚胎
发生的扫描电镜观察
夏广清 , 朱俊义 , 王艳萍
通化师范学院生物系 , 通化 134001
摘　要:分别以东北刺人参叶芽和带有叶柄的幼叶为外植体 , 研究 6-BA浓度对东北刺人参体细胞胚状体诱
导的影响 ,并利用扫描电镜对体细胞胚胎发生的形态学进行了观察。结果表明:以带有叶柄的东北刺人参幼
叶为外植体 ,在 MS 培养基上附加 4.0 mg/ L 6-BA 和 0.5 mg/L NAA , 可获得健状的胚状体 , 并且胚状体经过球
形胚 、心形胚 、鱼雷形胚和子叶形胚的胚胎发育时期 ,最终形成可发育成完整小植株的成熟胚。
关键词:东北刺人参;体细胞胚状体;诱导;扫描电镜
中图分类号:S567.51　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2009)02-0174-04
Induction and Observation of the Somatic Embryogenesis of Oplopanax
elatus by Scanning Electron Microscope
XIA Guang-qing , ZHU Jun-yi , WANG Yan-ping
Tonghua Normal University , Tonghua 134001 , China
Abstract:The leaves with leafstalk and buds of Oplopanax elatus Nakai were taken as explants and cul-
tured in vitro.Large and healthy embryoids were obtained on MS medium supplement with 4.0 mg/L ,
0.5 mg/L NAA from buds.The development of somatic embryos of Oplopanax elatus Nakai was observed
by scanning electron microscopy.The results showed that the embryoids were developed from global ,
heart-shaped , torpedo-shaped and cotyledon embryo , then matured and formed planet.
Key words:Oplopanax elatus Nakai;somatic embryogenesis;induction;scanning electron microscope
　　东北刺人参(Oplopanax elatus Nakai)为五加科
刺人参属多年生落叶乔木 ,其干燥根 、根茎和茎均
可入药 ,是一种珍贵的多年生药用植物 。近年来 ,
随着对东北刺人参药用价值的深入研究和开掘 ,
其自然资源遭到严重破坏 ,处于濒危状态 ,已列入
国家二级保护植物 、吉林省一级保护植物[ 1-3] 。东
北刺人参扦插成活率很低 ,种子萌发率亦很低 ,靠
常规繁殖其繁殖率非常低[ 4-6] ,所以利用组织培养
来快速繁殖东北刺人参是保护其资源的有效途径
之一。在以往研究的基础上 ,我们曾以东北刺人
参带叶柄的叶片为外植体 ,通过愈伤组织诱导获
得东北刺人参幼苗[ 7] ,但有关东北刺人参胚状体
诱导方面的研究尚未见报道。本试验分别以东北
刺人参叶芽和带有叶柄的幼叶为外植体 ,重点研
究了培养基 6-BA浓度对东北刺人参体细胞胚状
体诱导的影响 ,并利用扫描电镜观察了东北刺人
参体细胞胚状体发育各个阶段的形态特征 ,为建
立东北刺人参组织培养高效再生体系提供理论依
据。
1　材料与方法
(1)材料:东北刺人参 ,采于长白山国家旅游
区白鸡腰子北坡。
(2)外植体处理:将东北刺人参幼芽 、嫩叶及
基金项目:吉林省教育厅科研项目[ 2006(151)]
作者简介:夏广清 ,女 ,博士研究生 ,副教授 ,研究方向:生物技术与分子遗传育种。
收稿日期:2008-02-01　　修回日期:2008-05-29
吉林农业大学学报　2009 ,31(2):174 ～ 177 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
DOI :10.13327/j .j jlau.2009.02.011
叶柄剪下 ,流水冲洗 20 ～ 30 min , 用吐温-20摇洗
5 min ,清水洗净后经 70%乙醇处理 90 s , 0.1%升
汞浸泡5 ～ 8 min ,无菌水冲洗 4 ～ 5次后 ,分别置
于不同的培养基上进行体细胞胚状体的诱导 。
(3)培养条件:在MS培养基中加入 3%蔗糖 、
1.0%琼脂 、6-BA和一定浓度 NAA(0.5 mg/L)。6-
BA浓度分别为 1.0 , 2.0 , 3.0 , 4.0 , 5.0 mg/L。在
16 h光照 、8 h黑暗条件下进行 ,培养温度约25°C。
(4)胚状体的扫描电镜观察:取不同类型的愈
伤组织和胚状体用 4%戊二醛固定 ,磷酸缓冲液
清洗 ,100%系列乙醇脱水 ,乙酸异戊酯置换 ,离子
喷射镀金 ,最后用 S-3000型扫描电镜在 15 kV
下观察和摄影。
2　结果与分析
2.1　培养基组成对东北刺人参体细胞胚状体诱
导的影响
试验结果表明 ,当以带叶柄的幼叶为外植体
时 ,没有诱导出体细胞胚 ,在以东北刺人参幼芽为
外植体时 ,在 1号培养基上没有愈伤组织形成 ,只
可以诱导生成大量的气生根 ,不久气生根干枯 、死
亡;适当提高细胞分裂素浓度能促进愈伤组织的
诱导 ,适当细胞分裂素与生长素比例可使愈伤组
织生长良好 ,并且可以诱导体细胞胚胎的发生。
在本研究中 ,最适 6-BA 浓度为 4.0 mg/L ,NAA浓
度为 0.5 mg/L(表 1)。
表 1　培养基组成对东北刺人参体细胞胚状体诱导的影响
Table 1.Effect of culture medium components on induction of somatic embryogenesis of Oplopanax elatus Nakai
培养基代号
No.of medium ρ(6-BA)/(mg·L -1) ρ(NAA)/(mg·L -1) 体细胞胚状体的生长情况Growth of somatic embryogenesis
1
2
3
4
5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
诱导气生根的形成
不久形成愈伤组织 ,但随后褐变 ,死亡
前期愈伤组织 、球形胚增殖较快 ,但后期几乎不再增殖
愈伤组织和球形胚增殖率高,且生长良好
停留在愈伤组织阶段 ,不再分化
2.2　东北刺人参体细胞胚状体发生的细胞形态
学观察
扫描电镜观察结果表明 ,从胚状体产生的位
置上看胚状体多数来源于愈伤组织的表层细胞
(图 1),也有少数是从愈伤组织较内层部分细胞
产生的。东北刺人参胚性愈伤组织和非胚性愈伤
组织往往同时存在 ,且在愈伤组织诱导的初期这
种共存形式就已经形成。构成胚性愈伤组织的胚
性细胞进一步生长 、增殖和分化 ,可形成不同发育
时期的胚状体 ,胚状体表面光滑 ,具有极性 ,细胞
排列随机性强 。与胚性细胞结合松散 ,很易从中
分离出来 。胚状体后期的分裂不像合子胚那么有
规则 ,而是形成多种多样的胚状体。体细胞胚与
胚性愈伤组织之间通过胚柄结合 ,由胚性愈伤组
织形成的体细胞胚起初体积较小 ,呈圆形 ,为球形
胚 ,然后逐渐生长 ,经心形胚 、鱼雷形胚而发育成
子叶胚 ,最后发育成完整的小植株。各种不同发
育时期的胚状体其表面较为光滑 ,有规则的纹路。
此外 ,从形态上看 ,这些胚状体与由种子萌发形成
植株的过程一致 。东北刺人参愈伤组织产生的胚
状体不同步 ,因此在一块愈伤组织中可以见到不
同时期的胚状体 ,有些胚状体已长成苗 ,有些胚状
体还处于原始阶段 ,它们之间是相互独立的 ,可以
分别发育成不同的再生植株。
3　讨　论
在胡萝卜根髓愈伤组织所制备的悬浮单细胞
和几个细胞的聚集体 ,经诱导产生类似于但不同
于合子胚的体细胞胚 ,也被叫做胚状体 ,它像种子
一样通过球形 、心形 、鱼雷形和子叶形的胚胎发育
时期 ,最终形成可发育成完整小植株的成熟胚[ 6] 。
目前 ,包括裸子植物 、双子叶植物和单子叶植物中
许多科的代表植物 , 如陆地棉[ 8] 、棉花[ 9] 、芹
菜[ 10] 、杂交鹅掌楸[ 11] 、白云杉[ 12] 等近 50 科 100
属 120种植物都有体细胞胚状体的发生。这表明
胚状体的发生在高等植物中已普遍存在 。但对于
东北刺人参组织培养方面 ,主要集中在愈伤组织
诱导培养上 ,有关东北刺人参体细胞胚状体诱导
的研究尚未见相关报道。本研究只是初步探讨了
外植体取材部位和培养基 6-BA 浓度对其体细胞
胚状体诱导的影响 ,有关其他因素(如 2 , 4-D 、糖
的种类和浓度 、pH等)对体细胞胚状体诱导影响
175夏广清等:东北刺人参体细胞胚状体的诱导及体细胞胚胎发生的扫描电镜观察
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
的相关研究还有待于深入研究 。
1.从愈伤组织表皮细胞发育成的胚状体 Embryoswere born from textura cell of callus;2.从愈伤组织内层细胞产生的胚状体 Embryos re-
generated from inner-cell of callus;3.胚柄 Suspensor;4.球形胚 ,尾部有尚未退化的胚柄 Embryos at the globular stage which has the suspen-
sor;5.心形胚 Embryos at the heart stage;6.上端为心形胚 ,下端为鱼雷胚 ,鱼雷胚左下端为根端 ,右上端为芽端 Embryos at the torpedo
stage;7.子叶胚 Cotyledon embryos
图 1　体细胞胚胎发生的扫描电镜观察(100倍)
Fig.1.Scanning observation of development of somatic embryos(×100)
176　　　吉林农业大学学报　2009年 4月
Journal of Jilin Agricultural University 2009 , April
　　扫描电镜观察结果表明 ,东北刺人参组织培
养产生的胚状体具有明显的两极性和相对的独立
性 ,这完全符合区分器官发生和体细胞胚发生 2
个标准中的体细胞胚胎发生的条件 。此外 ,在东
北刺人参体细胞胚胎发生体系的研究中发现 ,体
细胞胚胎经过了球形胚 、心形胚 、鱼雷形胚和子叶
胚全过程 ,说明其发育过程与合子胚的发育完全
相同。由此可以得出 ,本研究不仅建立了东北刺
人参体细胞胚状体发生体系 ,而且此体系同步性
较好 ,发生频率较高 。电镜观察结果还可以说明 ,
体细胞胚是由胚性愈伤组织分化而来 ,体细胞胚
尤其是成熟体细胞胚与愈伤组织结合较松 ,易自
行脱落 。体细胞胚具有两极性 ,尤其是成熟的体
细胞胚极易观察到胚根和胚芽 ,从脱落下来的体
细胞胚可明显观察到它与愈伤组织没有维管束联
系 ,具有生理隔离性 ,这完全符合 Haccius[ 13]提出
的判断胚状体的 2个重要特征。
随着转基因农作物推广面积的逐年增加 ,利
用植物遗传转化对农作物重要农艺性状进行改良
的育种新技术已经逐渐被国内外的育种者和消费
者所接受 ,而建立高效稳定的组织培养再生体系
是用农杆菌侵染细胞获得转基因植株的重要前
提。通过植物集中转化系统(愈伤组织再生系统 、
直接分化再生系统 、原生质体再生系统 、胚状体再
生系统 、生殖细胞再生系统)的研究发现[ 8] ,胚状
体再生系统中 ,由于胚状体是由具有卵细胞特性
的胚性细胞发育而来 ,因此具有极强的接受外源
DNA的能力 ,是理想的基因转化感受态细胞 ,并
且由于胚状体的发生多数是单细胞起源 ,因此转
化获得的转基因植株嵌合体少[ 14] 。因而通过东
北刺人参体细胞胚状体的诱导系统建立高效的遗
传转化体系 ,将为基因工程技术在白菜类作物遗
传育种领域中广泛应用开辟新的途径 ,同时也为
提高其他药用植物的遗传转化效率提供试验基
础。
此外 ,胚状体的诱导和发育是植物细胞全能
性的最可靠的试验证明 ,也是研究体细胞胚胎发
生及转化基因表达调控的最佳试验系统 ,因此在
理论研究方面也十分有意义。不仅表明植物细胞
具有全套遗传信息 ,而且重演了合子胚形态发生
的过程 。因此在以后的研究中 ,利用体胚发生系
统深入研究体细胞胚发生与发育的机制对于揭示
细胞分化 、发育 、形态发生与胚胎发生过程重大理
论问题的机制 ,以及真核细胞中基因表达和调节
控制等具有十分重要的意义。
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