全 文 ：第 2 卷第 4 期
2 000 年 12 月
辽宁农业职业技术学院学报
Jo u rn a l o f L ia o n in g A g r ie u l t u r a l V o e a t io n
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龙牙穗木体细胞胚状体发生及植株再生
谢永刚 ` 曲 芳 ` 宁德佳 “
(
` 辽宁农业职业技术学院 , 2 熊岳镇政府农业 站 )
摘 要 龙牙穗木叶柄培养诱导胚性愈伤组织 , 进一步分化形成体细胞胚状体 , 并发育成完整
植株 。 初代培养以 M S 十 B A 十 N A A 培养顶芽 , 当芽萌发后取幼嫩 叶柄在含有 2 , 4 一 D 的 M S 培
养基上进行愈伤组织诱导 , 将胚性愈伤组织继代培养 , 成熟 的体细胞胚状体经分化形成 完整植
株 。
关键词 龙牙穗木 体细胞胚状体 植株再生
中图分类号 : 56 64 . 9
龙牙掩木 [A r a l i a e l a t a (m i q ) S e e m ] 又名刺嫩芽 、 刺老芽 、 辽东概木等 , 五加科 ( A r a l ia
ce ae ) 植物 。 食药两用 , 早春嫩芽作蔬菜用 , 被 日本人称为 “ 山珍之王 ” , 味清香 、 鲜脆 , 富
含蛋 白质 、 维生素 、 多种人体必需的氨基酸 、 微量元素 , 深受国内外市场欢迎 ; 根皮人药 , 主
要成分为龙芽穗木皂贰 A 、 B 、 C , 贰元均为齐墩果酸 , 此外 , 尚含有醛类物质 , 生物碱及挥
发油 , 主治神经衰弱 、 胃及十二指肠溃疡 , 肾炎水肿慢性病后气虚无力等症 。
龙牙掩木主产我国东北部低山森林 中 , 日本 、 朝鲜及俄罗斯远东地区仅有少量分布 。 现所
用龙牙魂基本来 自野生资源 , 人工大面积栽培还未见报导 。 近几年来 , 由于市场需求量大 (冬
季 5 0 元 /公斤 ) , 野生资源受到严重破坏 。 人工组织培养 , 进行工厂化育苗 , 实行大面积推广
栽培势在必行 。 但龙牙秘木组织培养国内尚没有文献记载 。 我们通过组织培养 , 经过近一年的
试验 , 终于就龙牙袍木体细胞胚状体发生及植株再生和驯化栽培获得成功 。
1 材料和方法
1
.
1 材料的采集
本试验供试材料来自辽宁省盖州市杨运 乡的森林 中 , 早春 ( 2 月份 ) 当树体刚要萌动时 ,
将带有顶芽或腋芽的一年生枝条剪取 , 然后放人冰箱 中冷藏备用 。
1
.
2 试验方法
当培养基备好后 , 进行外植体处理和消毒 , 先在准备室中用剪刀和镊子 , 将顶芽和腋芽瓣
下 , 轻轻剥去芽鳞片 , 将带有幼叶的芽取 0 . 5一 0 . 8 Cm大小 , 然后用 自来水反复冲洗数分钟 ,
沥干后用 75 % 的酒精浸泡 30 秒 , 然后用 0 . 1 % 的升汞浸泡 7 分钟 , 无菌水 冲洗 4一 5 次 , 最后
用无菌滤纸吸干水分 , 无菌条件下接种到培养基上 。
1
.
3 培养墓及培养条件
茎尖生 长 培养基 采用 M场 及 M S 附加 不 同 比例 的 BA 和 N A A
, 琼脂 0 8 % , 活性 炭
1
.
5 9 L/
, 详见表 I 。
收稿 日期 : 2 000 一 1 0 一 10
谢永刚 , 男 , 讲师 , 熊岳城
第 2 卷 第 4 期 谢永刚等 : 龙牙稳木体细胞胚状体发生及植株再生
叶柄胚性愈伤组织诱导培养基采用 M S 附加不同比例的 2 , 4 一 D 及 B A , 琼脂 0 . 9 % , 活
性炭 1 . 5 9 l/ 一 , 详见表 n 。
胚状体继代培养基采用 M s 附加 , 2 , 4 一 D 。 活性炭 1 . 5 9几 , 琼脂 0 . 8 % 。
胚状体分化再生植株采用 M s 附加 IB A 。 琼脂 0 . 8 % , 活性炭 1 . 5 9 / L 。
以上培养基蔗糖浓度均为 3 % , p H 为 5 . 7 , 在 1 . 2 k g c/ m Z压力下灭菌 20 分钟 。
接种后置 2 5℃ 、 光照 2 0 0 0 L x , 每天光照 12 小时条件下培养 。
1
.
4 驯化及移栽
将灭菌后的珍珠岩和蛙石 ( 1 : l) 装入塑料育苗盘 中 , 驯化时 , 要求棚室相对湿度 80 一
90 %
。 温度 2 0一 2 ℃ 。 先将试管苗去除瓶塞 , 室温下放置 3 天 , 然后用清水洗去根部琼脂 ,
用 5 0一 10 0 P m IB A处理苗基部 , 移栽到育苗盘中 , 移栽时 , 先用清水将基质浸透 , 然后用竹
签挖小孔将根栽人 , 轻压 , 然后用水浇平 。 将育苗盘置棚室中 , 上面罩上塑料小棚 。 待苗生长
后 ( 7一 10 天 ) 逐渐过渡到正常棚室条件下 , 再过 7一 10 天方可带土移人 田地 中 。
2 结果与分析
2
.
1 不同培养基对芽萌发和生长的影响
顶芽和腋芽在 M S 和 M S 附加不同比例6 B A和 N 记气A 培养基上 , 生长情况不同 。
表 I 不同的激素水 平对 芽生长的影响
组别 培养基 (m g几 ) 芽生长情况
M S 十 B 了、 2 一+ N A八0 . 0 5
M S + B A Z + N A A O
.
1
M S + B A I + N才、 A O . 1
M S + B A I + N A A ( )
.
0 5
生长缓慢 , 且有玻璃化 现象
生长较慢 , 大部分玻璃化
生长最快 , 长势好 , 基部略有愈伤组织
生长较快
芽萌动 , 伸展缓慢
上述结果表明 , 芽在不同培养基上 , 均能萌动 , 其中以 B A I 、 N A A O . 1 中最快 , 玻璃化现
象明显与 B A 含量有关 , 提高 N A A 含量 , 会导致愈伤组织的堆积 。
2
.
2 不同培养基对胚性愈伤组织诱导的影响
当芽生长 1一2 周后 , 从培养基中取出 , 切取叶柄 0 . 5 Cm长 , 接种到不 同培养基上 , 结果
如表 1 。
表 l 不同培养基对胚性愈伤组织诱导 的影响
组别 培养基 ( m g几 )
M S + 2
,
4 一 D I
M S + 2
.
4 一 D Z
接种数 胚性愈伤组织诱导率
63 %
7 0 %
M S + B AO
.
5 + 2
,
4 一 D I
M S + B AO
.
5 + 2
,
4 一 D Z
6 5 %
8 5%
nUC6,一476戈」
以上结果表明 , ’ 在含有 2 , 4 一 D 培养基上 , 均有胚性愈伤组织产生 , 随 2 , 4 一 D 浓度提
高 , 诱导率有上升趋势 , 如果添加少量 B A 效果更好 。 胚性愈伤组织 的颜色 、 形态与非胚性愈
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伤组织不同 , 两者在诱导过程中都出现 。
2
.
3 胚性愈伤组织的继代培养
将愈伤组织块 , 选取 比较好的 (疏松 、 淡黄白色 、 柔软 ) 切成 0 . 5 c m见方小块 , 接种到
M S + 2
,
4 一 D Z + BOA
.
5 的培养基上继代培养 , 扩大繁殖系数 。 在继代培养 中 , 注意每月转
接 , 以保证胚性愈伤组织的不断增殖 , 如果超过 7一 8 周 , 则继代无效 。
2
.
4 胚状体的分化和植株再生
将继代培养 6 0 天的胚状体接种到不同 BI A 培养基中 , 结果如表 m
表 l 不同培养荃对胚状体分化的影响
组别 培养基 ( m g几 ) 接种大小
M S + 2
,
4 一 1) )
.
0 1 + IB A I
M S + 2
,
4 一 IX) . 0 1 + I B AZ
M S + 2
,
4 一 1刃 . 0 1 + I B A 3
M S + 2
,
4 一 D I
1
e m Z
1 em Z
1
e
m
Z
1 e m
Z
苗分化情况
成苗 、 根短
成苗 、 根较一般
成苗 , 根较长
成苗 , 根细弱 , 有毛
试验发现 , 胚状体在含不同浓度 BI A 中 , 都能成苗 , 但质量有所不 同 。 胚根先伸长 , 然
后出现子叶 、 胚芽 , 下胚轴伸长较快 。 最适培养基为 M S + 2 , 4 一 D O . 01 + IB A 3 。
2
.
5 移栽 试管苗的驯化 , 移栽较困难 , 目前的成活率为 60 % 左右 , 主要原因是基质 内易感
染 , 湿度和温度控制不够 。 移栽的手段和小环境的控制还有待进一步完善 。
3 讨论
在诱导胚状体形成的过程中 , 我们发现琼脂的用量以及活性炭也有一定的影响 , 但主导因
素是 2 , 4 一 D 。 在诱导过程中 , 往往先有许多愈伤组织 , 然后再有许多胚性细胞团 。 也就是
说 , 诱导产物实际是非胚性愈伤组织和胚性胚性愈伤组织的混合物 。 通过不断继代培养 , 非胚
性愈伤组织仍可继续转化为胚状体 。 在胚状体的分化 、 发育中 , 除去 2 , 4 一 D 是必要的 , 相
应还得加人一定 比例的 B A 和 IB A 。 胚状体发育很不一致 , 有 的苗长成很高 , 但还有刚分化
的 。 胚状体成苗质量也参差不齐 。 为便于统一管理 , 往往需要进一步复壮 。 根发育不 良的 , 可
切断后重新生根 , 效果很好 。
目前 , 该试验中 , 试管苗的快速繁殖 , 主要通过胚状体继代形成大量体细胞胚状体 , 以此
为无性系 、 不断增殖 。 其它无性系繁殖手段 (如诱导芽丛 、 微茎段扦插 ) 还正在进一步探讨之
中 。
主要参考文献
金波 . 《中国多年生蔬菜》 . 北京 : 中国农业出版社 , 19 97 : 79 一 82
葛惠贤 . 张万国 . 《珍贵野特蔬菜的开发利用》 . 北京 : 中国农业出版 , 1 99 5 : 17 0一 17 8
戴宝合 . 《野生植物栽培学》 . 北京 : 中国农业出版社 , 1 997 : 17 4一 17 6
(责任 编辑 杨秋 英 )