全 文 ：南京农业大学学报 2013，36(2) :137 － 144 http:/ /nauxb． njau． edu． cn
Journal of Nanjing Agricultural University doi:

10． 7685 / j． issn． 1000 － 2030． 2013． 02． 023
收稿日期:2012 － 04 － 07
基金项目:国家自然科学基金项目(31071586) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介:赵育卉，硕士研究生。* 通信作者:辛志宏，副教授，博士，研究方向为食品营养与化学，E-mail:xzhfood@ njau． edu． cn。
赵育卉，李连强，湛东锐，等．盐生海芦笋内生真菌 S19 的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化［J］．南京农业大学学报，2013，36(2) :137 － 144
盐生海芦笋内生真菌 S19 的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化
赵育卉，李连强，湛东锐，王惠，刘天行，辛志宏*
(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)
摘要:以盐生海芦笋中分离的 1 株内生真菌 S19 菌株为研究对象，对 ITS 区域序列进行 PCR 扩增测序并进行系统发育分
析，结合形态学观察，将其鉴定为 Gibberella avenacea。采用 Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应曲面法对 S19 菌株的
发酵条件进行优化，最大限度地提高其抗氧化活性。优化后的最佳培养基配方为:16 g·L －酵母膏，17 g·L －1蛋白胨，300
g·L －1 土豆，30 g·L －1麦芽糖，30 g·L －1甘露醇，5 g·L －1葡萄糖，10 g·L －1味精，10 g·L －1氯化钠，pH为 7。采用此培养基所得
发酵产物对 2，2 －二苯基 － 1 －苦肼基(DPPH)自由基的最大清除率为 78． 25%，比优化前(清除率 66． 55%)有显著提高。
关键词:盐生海芦笋;rDNA-ITS序列分析;抗氧化;响应曲面法
中图分类号:TS255． 1 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2030(2013)02 － 0137 － 08
Isolation and identification of an endophytic fungus strain S19
from Salicornia bigelovii and optimization of its antioxidative
fermentation conditions
ZHAO Yuhui，LI Lianqiang，ZHAN Dongrui，WANG Hui，LIU Tianxing，XIN Zhihong*
(College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:An endophytic fungus strain S19 isolated from Salicornia bigelovii was used as the material． It was identified as Gibberella
avenacea by ITS rDNA sequencing and phylogenetic analysis combined with morphological observation． The fermentation conditions of
S19 were optimized by using the Plackett-Burman，the steepest hill-climbing experiment and the response surface method，to maxi-
mize its antioxidant activity． The optimum medium was as follows:16 g·L －1 yeast extract，17 g·L －1 peptone，300 g·L －1 potato，30 g
·L －1 maltose，30 g·L －1 mannitol，5 g·L －1 glucose，10 g·L －1 monosodium glutamate and 10 g·L －1 sodium chloride，pH 7． Using the
optimum culture medium，the maximum DPPH free radical scavenging rate of the fermentation products was 78． 25%，which was sig-
nificantly higher than before(66． 55%)．
Key words:Salicornia bigelovii;rDNA-ITS sequence analysis;antioxidation;response surface methodology
寻找和发现有效易得的天然抗氧化剂一直是食品工业中研究的重点和热点之一。众多研究者已经从
中草药类、茶叶类、香料类、蔬菜类、水果类和谷物类等植物中发现了大量的天然抗氧化剂，包括甘草抗氧
化物、茶多酚、迷迭香、植酸类等［1］。但是植物大都生长周期长，有效成分含量低，资源有限且不可再生，
大量采集或砍伐对生态环境易造成破坏，使工业化生产受到一定限制。因此，寻找新的、可持续发展的抗
氧化活性物质来源无疑是解决这一问题的关键。1993 年，美国蒙大拿州立大学的 Stierle 等［2］从短叶红豆
杉(Taxus brevifolia)的韧皮部分离出一株能产紫杉醇的内生真菌———安德烈亚紫杉霉(Taxomyces andrean-
ae)后，掀起从药用植物中寻找与寄主植物产生相同或相似的生物活性物质真菌的热潮。此后，人们又从
多种植物中发现大量产活性物质的内生真菌，其中包括产抗氧化活性物质的内生真菌，如杜仲［3］、银
杏［4］、枸杞［5］内生真菌等。研究表明，植物内生真菌往往会产生和其寄主相同或相似的生物活性成分［6］，
这为寻找新的抗氧化活性物质提供了理想的途径。此外，微生物具有繁殖快、易培养等优点，可以结合现
代发酵工程技术，使之工业化生产，降低生产成本。因此，开发和利用植物内生真菌在保护濒临灭绝植物、
探索新的活性产物以及提高活性成分的生产效率等方面都具有重要价值。
盐生海芦笋俗称海蓬子或海豆，学名盐角草(Salicornia bigelovii) ，是一种鲜美多汁、口感咸脆的绿色
时令海水蔬菜。海芦笋有梗无叶且抗盐能力极强，内茎的可溶性盐分含量高达 37%［7］。海芦笋胡萝卜素
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
含量丰富，含量超过普通蔬菜 40 倍，嫩茎中富含天然植物盐和植物碱(微角皂甙) ，食用后与人体血液中
的脂肪酸中和，能够清除血管壁上的胆固醇，降低血压、血脂，促进脂肪向肌肉细胞转化，促进肝脏的新陈
代谢，提高人体免疫力及预防帕金森病［8 － 9］。体外活性研究表明，海芦笋提取物具有显著的抗氧化活
性［10］。最新研究结果表明，海芦笋多糖具有抑制结肠癌细胞 HT － 29 增殖并诱导癌细胞凋亡的活性［11］。
这些研究结果为从海芦笋中分离产抗氧化活性物质的内生真菌提供了可能。
本研究以从盐生海芦笋中分离出的 1 株内生真菌 S19 为研究对象，对其 rDNA ITS序列进行扩增测序
和系统发育分析，鉴定其种属地位，采用 Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应曲面法对该菌株的发
酵条件进行优化，以最大限度地提高发酵产物的抗氧化活性，为进一步分离鉴定其中的活性物质奠定
基础。
1 材料与方法
1． 1 原料
野生盐生海芦笋(Salicornia bigelovii) ，采自盐城市大丰港海滩，于无菌保鲜袋 4 ℃冰箱保存。
1． 2 主要试剂
Taq酶及 PCR相关试剂购于上海天根生化科技有限公司;引物(ITS1 / ITS4)购于上海捷瑞生物工程有
限公司;其他分析纯试剂购于南京寿德试剂器材有限公司。
1． 3 内生真菌的分离培养
菌株分离采用 PDA固体培养基:200 g·L －1土豆，20 g·L －1葡萄糖，20 g·L －1琼脂，30 g·L －1氯化钠，自
来水配制。取 1 根清洗干净、新鲜健康的野生海芦笋在 1%(体积分数)次氯酸钠溶液中浸泡 1 min，取出
后在 70%乙醇中浸泡 1 min，再在 1%次氯酸钠溶液中浸泡 1 min，然后用无菌水漂洗 3 次，无菌滤纸吸干。
用灭菌剪刀将海芦笋剪成小丝放在 PDA平板上，每板 3 ～ 5 根，于 28 ℃恒温培养箱培养 5 ～ 10 d。当观察
到各植物组织内部向培养基四周长出菌丝时，将真菌转移到新的平板培养基上划线分离得到单个菌落，然
后转移到 PDA斜面试管中，编号备用。
1． 4 内生真菌鉴定
1． 4． 1 内生真菌的形态学鉴定 1)菌落形态特征。挑取少量菌丝接种于 PDA培养基中央，于 25 ℃连续
3 周培养观察菌落的形态特征，并记录生长速度［12］。2)显微形态特征。显微形态观察采用直接制片观察
法［13］。对照真菌鉴定手册［14］，确定菌株的种属地位。
1． 4． 2 分子生物学鉴定 1)ITS rDNA 基因序列的 PCR 扩增与测序。采用裂解法提取基因组 DNA［15］，
使用真菌 ITS rDNA基因通用引物 ITS1 / ITS4 扩增，引物序列如下:ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3;
ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反应体系 50 μL:双蒸水 33． 75 μL，PCR Buffer(含 Mg2 +)
9 μL，2． 5 mmol·L －1的 dNTP 4 μL，10 μmol·L －1的引物 ITS1 与 ITS4 各 0． 5 μL，DNA 模板 2 μL，500 U 的
Taq polymerase 0． 25 μL。PCR反应程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 75 s，35 个循环;72 ℃
10 min。取 3 μL PCR产物，进行 1%琼脂凝胶电泳，EB染色，紫外灯下检测，并使用紫外成像仪进行拍照。
PCR产物的序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
2)系统发育树构建。获得菌株 ITS rDNA基因序列后，用 NCBI 中 BLAST进行同源性搜索，选出与该
序列相似性较高的核酸序列。使用 ClastalX(1． 83)软件进行多重序列匹配排列和聚类分析，使用 Mega
4． 0软件，采用邻接法(Neighbor Joining Method)构建系统发育树，并通过自举分析(bootstrap)进行置信度
检测，自举数据集为 1 000 次。
1． 5 抗氧化活性的测定
发酵产物抗氧化活性采用 Yang 等［16］所述 DPPH 法测定，略有改进。将发酵菌悬液用超声波破碎仪
在振幅 60%条件下破碎 3 min，抽滤后收集滤液，将发酵液稀释 5 倍制得稀释液。准确称取 0． 019 7 g DP-
PH，用无水乙醇定容至 250 mL，配成 0． 2 mmol·L －1的 DPPH溶液。取样品稀释液和 0． 2 mmol·L －1 DPPH
溶液各 3 mL分别加入试管中，摇匀，25 ℃放置 30 min，使其充分反应。以无水乙醇为参比在 517 nm下比
色，测定其吸光度(Ai) ;同时测定 3 mL无水乙醇与 3 mL DPPH溶液的混合液的吸光度(Ac)和3 mL 样品
溶液与 3 mL无水乙醇的吸光度(Aj)。DPPH自由基清除率 =［1 －(Ai － Aj)/Ac］× 100%。
831
第 2 期 赵育卉，等:盐生海芦笋内生真菌 S19 的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化
1． 6 内生真菌发酵条件优化
本研究采用的基础液体培养基配方为:200 g·L －1马铃薯，20 g·L －1麦芽糖，20 g·L －1甘露醇，10 g·L －1
葡萄糖，5 g·L －1味精，5 g·L －1蛋白胨，3 g·L －1酵母膏，30 g·L －1氯化钠，pH 为 6． 0。将目的菌株接种到含
100 mL液体培养基三角瓶中，置于摇床中，30 ℃、120 r·min －1培养 2 周后，测定发酵产物抗氧化活性。
1． 6． 1 生长曲线测定 用原培养基配方配制 500 mL培养基，平均分装至 250 mL三角瓶中，灭菌后使用。
将纯菌种分别接种到培养基中，在 30 ℃、120 r·min －1的条件下摇床培养。从第 3 天开始取出第 1 批 3 瓶
(3 个平行) ，测其发酵产物的抗氧化活性以及生物量，隔 1 d再测第 2 批，依此类推，分别测定发酵产物抗
氧化活性和生物量随发酵时间的变化。
1． 6． 2 培养基优化试验设计 1)Plackett-Burman设计［17］。2)最陡爬坡试验。根据 Plackett-Burman 试验
结果，得到影响试验结果的各显著影响因素及效应大小，设定步长及变化方向，以最快的速度逼近最佳区
域，其他因素的取值则由其效应的正负和大小确定，正效应一般取较大值，负效应一般取较小值。3)Box-
Behnken设计。根据 Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验确定的试验因素与水平，采用 Box-Behnken试验
设计 3 因素 3 水平试验优化发酵培养基。
2 结果与分析
2． 1 内生真菌的分类鉴定
2． 1． 1 菌株形态学特征 S19 菌株菌落正面为白色菌丝，絮状棉质，生长茂密。菌落生长初期为白色，然
后白 －玫瑰色，直至白 －洋红色，且中间有少量黄色菌丝;反面则呈紫红色。菌株生长速度较快，28 ℃培
养 7 d菌落半径为 45 ～ 60 mm。显微观察下菌丝有分支，有隔，光滑透明，产生小型分生孢子，成卵形或球
形(图 1)。根据菌株的菌落、显微形态特征，参照《真菌鉴定手册》［14］，初步鉴定 S19 菌株属于半知菌类
Fungi Imperfecti、肉座菌目 Hypocreales、肉座菌科 Hypocreaceae、赤霉属 Gibberella。
图 1 菌株 S19 的菌丝(×400)(A)和分生孢子(B)
Fig． 1 The hyphae(A)and conidiophores(B)of strain S19
a:分隔 Septum;b:分枝 Ramification
2． 1． 2 ITS rDNA扩增与序列测定 采用分子生物学方法对其进行鉴定。首先提取菌株基因组 DNA，得
到 1 条大小与预期大小相符的菌株 S19 基因组 DNA条带，以此为模板进行 ITS rDNA扩增，PCR产物经测
序得到该序列长度为 534 bp。
2． 1． 3 系统发育分析 将该序列与 GenBank 数据库中收录的真菌 ITS rDNA进行 BLAST分析(GenBank
登录号:JX110823)。经过比对发现菌株 S19 的 ITS rDNA 序列与赤霉属(Gibberella)和镰刀菌属(Fusari-
um)的菌株相似性较高，同源性达 99%。因此，推断该菌株属于赤霉属或镰刀菌属。选取同源性较高菌株
的 ITS rDNA基因序列，使用 Mega 4． 0 软件构建系统发育树(图 2)。从系统发育树中可以看出，菌株 S19
与燕麦镰刀菌 Gibberella avenacea(同 Fusarium avenaceum)亲缘关系最近。
综合菌落、显微形态特征和 ITS rDNA 基因序列分析结果，将菌株 S19 鉴定为燕麦镰刀菌 Gibberella
avenacea(同 Fusarium avenaceum)。
931
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
图 2 基于菌株 S19 ITS rDNA序列构建的系统发育进化树
Fig． 2 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequence of strain S19
图 3 抗氧化活性与培养时间的关系
Fig． 3 Relationship between antioxidant activity
and culture time
2． 2 发酵条件的优化
2． 2． 1 最佳培养时间的确定 由图 3 可见，发酵产
物抗氧化活性在 0 ～ 4 d 内，随着培养时间的增加呈
上升趋势，在 4 ～ 7 d 中发酵产物抗氧化活性随时间
的递增而逐渐减小，发酵产物抗氧化活性在第 4 天
达到最大值，清除率为 66． 55%，所以推断最佳培养
时间为 4 d。
2． 2． 2 Plackett-Burman试验筛选主要影响因子
本试验选用试验次数为 12 的 Plackett-Burman 设计，
对土豆、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、味精、蛋白胨、酵母
膏、氯化钠、pH值 9 个因素进行考察，每个因素取高
(+ 1)、低(－ 1)2 个水平，响应值为 DPPH清除率，试验设计和试验结果见表 1，各因素主效应分析见表 2。
由表 1 和表 2 可知，在真菌 S19 产生抗氧化活性物质过程中，蛋白胨、酵母膏、土豆 3 个因素对活性物
质产量影响显著，可考虑作为重要因素进一步做响应曲面分析，而其他因素取值则根据各因素效应的正负
和大小，正效应取较高值，负效应取较低值。本研究选取表 1 中抗氧化活性最高(77． 28%)的试验组所对
应的两水平数值来确定除上述 3 个因素以外的 6 个因素的取值(表 2) ，即取 30 g·L －1麦芽糖，30 g·L －1 甘
露醇，5 g·L －1葡萄糖，10 g·L －1味精，10 g·L －1氯化钠，pH为 7。
表 1 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 1 Plackett-Burman design and corresponding results
组别
Groups
土豆
Potato
麦芽糖
Maltose
甘露醇
Mannitol
葡萄糖
Glucose
味精
Monosodium glutamate
蛋白胨
Peptone
酵母膏
Yeast extract NaCl pH
抗氧化活性 /%
Antioxidant activity
1 1 1 1 － 1 － 1 － 1 1 － 1 1 75． 76
2 1 － 1 － 1 － 1 1 － 1 1 1 － 1 59． 13
3 － 1 － 1 1 － 1 1 1 － 1 1 1 63． 49
4 － 1 1 1 － 1 1 1 1 － 1 － 1 77． 28
5 1 1 － 1 1 1 1 － 1 － 1 － 1 70． 28
6 － 1 1 1 1 － 1 － 1 － 1 1 － 1 17． 14
7 － 1 1 － 1 1 1 － 1 1 1 1 46． 25
8 1 1 － 1 － 1 － 1 1 － 1 1 1 72． 01
9 1 － 1 1 1 － 1 1 1 1 － 1 69． 17
10 1 － 1 1 1 1 － 1 － 1 － 1 1 43． 51
11 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 6． 36
12 － 1 － 1 － 1 1 － 1 1 1 － 1 1 70． 48
041
第 2 期 赵育卉，等:盐生海芦笋内生真菌 S19 的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化
表 2 Plackett-Burman试验设计的因素水平及效应分析
Table 2 Design factors，levels and effect analysis of Plackett-Burman
因素
Factors
水平 Level
－ 1 + 1
影响
Effect
平方和
SS
贡献率 /%
Contribution rate
重要性
Significance
土豆 Potato 15． 0 25． 0 18． 14 987． 54 16． 52 3
麦芽糖 Maltose 1． 0 3． 0 7． 76 180． 81 3． 02 6
甘露醇 Mannitol 1． 0 3． 0 3． 64 39． 75 0． 66 8
葡萄糖 Glucose 0． 5 1． 5 － 6． 20 115． 32 1． 93 7
味精 Monosodium glutamate 0． 1 1． 0 8． 17 200． 25 3． 35 5
蛋白胨 Peptone 0． 1 1． 0 29． 09 2 539． 27 42． 48 1
酵母膏 Yeast extract 0． 1 0． 6 20． 88 1 307． 92 21． 88 2
氯化钠 NaCl 1． 0 6． 0 － 275． 00 22． 63 0． 38 9
pH 5． 0 7． 0 12． 02 433． 68 7． 25 4
2． 2． 3 最陡爬坡试验设计及结果 根据 Plackett-Burman试验结果选取蛋白胨、酵母膏、土豆这 3 个对发
酵产物抗氧化活性提高最显著因素进行最陡爬坡试验。根据这 3 因素的效应大小比较，设定它们的变化
方向和步长，具体设计如表 3 所示。从表 3 可以看出，第 3 组的抗氧化活性最高。因此，以第 3 组的水平
作为响应曲面的中心点，即 12 g·L －1 蛋白胨、12 g·L －1酵母膏、300 g·L －1土豆，其他成分为 30 g·L －1麦芽
糖，60 g·L －1甘露醇，5 g·L －1葡萄糖，10 g·L －1味精，10 g·L －1氯化钠，pH为 7。
表 3 最陡爬坡试验设计及结果
Table 3 Steepest ascent design and corresponding results
组别
Groups
蛋白胨 /(g·L －1)
Peptone
酵母膏 /(g·L －1)
Yeast extract
土豆 /(g·L －1)
Potato
DPPH自由基清除率 /%
DPPH radical scavenging rate
1 8 4 200 55． 37
2 10 8 250 81． 19
3 12 12 300 83． 29
4 14 16 350 75． 12
5 16 20 400 78． 27
表 4 Box-Behnken设计因素水平
Table 4 Design factors and levels of Box-Behnken
编码
Code
因素
Factors
水平 Levels
－ 1 0 1
X1 蛋白胨 /(g·L －1)Peptone 1 12 18
X2 酵母膏 /(g·L －1)Yeast extract 1 12 22
X3 土豆 /(g·L －1)Potato 150 300 450
2． 2． 4 Box-Behnken 试验设计与分析 根据最陡
爬坡试验结果设计 Box-Behnken 试验的因素与水平，
设计结果见表 4。依据 Box-Behnken 试验设计原理，
进行 3因素 3水平的响应面试验设计，包括 12个析因
试验和 5个中心试验。Box-Behnken 设计每个因素取
3个水平，以(－1，0，+1)编码，对数据进行二次拟合，
得到包括一次项，平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后求得最佳值。
本试验以 DPPH自由基清除率为响应变量，以蛋白胨、酵母膏及土豆为影响因子进行 Box-Behnken 响
应面设计，具体设计与结果分析分别如表 4 和表 5 所示。根据表 5 试验结果，以发酵产物抗氧化活性为响
应值，对回归模型系数显著性进行检验(表 6) ，寻求最优响应水平，建立抗氧化活性(Y)与蛋白胨质量浓
表 5 Box-Behnken试验设计及相应结果
Table 5 Box-Behnken design and corresponding results
组别
Groups
蛋白胨
Peptone
酵母膏
Yeast extract
土豆
Potato
DPPH自由基清除率 /%
DPPH radical scavenging rate
拟合值
Fitted value
误差
Error
1 － 1 0 + 1 62． 24 64． 75 － 2． 51
2 0 0 0 74． 45 75． 01 0． 56
3 + 1 0 + 1 70． 45 71． 21 0． 67
4 － 1 + 1 0 70． 53 70． 12 0． 41
5 0 + 1 － 1 69． 66 71． 19 － 1． 53
6 － 1 － 1 0 49． 49 48． 23 1． 26
7 0 + 1 + 1 71． 68 69． 55 2． 13
8 － 1 0 － 1 52． 34 51． 56 0． 87
9 0 0 0 75． 59 75． 01 0． 48
10 0 － 1 + 1 65． 14 64． 06 1． 08
11 + 1 － 1 0 68． 35 68． 73 － 0． 18
12 + 1 + 1 0 73． 31 74． 65 － 1． 34
13 0 0 0 75． 64 75． 01 0． 53
14 0 0 0 74． 78 75． 01 － 0． 23
15 0 － 1 － 1 46． 36 47． 87 － 1． 51
16 + 1 0 － 1 72． 72 70． 30 2． 42
17 0 0 0 74． 59 75． 01 － 0． 51
141
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
度(X1)、酵母膏质量浓度(X2)和土豆质量浓度(X3)的二次多元回归方程:Y = 75． 010 00 + 6． 278 75X1 +
6. 980 00X2 +3． 553 75X3 －4． 020 00X1X2 －3． 042 50X1X3 －4． 190 00X2X3 － 4． 181 25X1
2 － 5． 408 75X2
2 － 6． 391
25X3
2。由表 6 可知，交互项 X1X3 的 P值为 0． 023，说明其交互作用显著;交互项 X1X2 和 X2X3 的 P值分别
为 0. 006 5 和 0． 005 2，说明其交互作用极显著。方程模型的相关系数 R2 = 0． 978 3，说明方程模型与试验
数据有 97． 83%的符合度，调整后的 R2Adj = 0． 950 3，变异系数为 3． 11%，表明方程模型具有较高的可信度。
表 6 回归模型系数显著性检验
Table 6 Significant test of regression coefficient
变异来源
Source
自由度
DF
平方和
SS
均方和
MS
F值
F-value Prob ＞ F
X1 1 315． 38 315． 38 71． 59 ＜ 0． 000 1
X2 1 389． 76 389． 76 88． 47 ＜ 0． 000 1
X3 1 101． 03 101． 03 22． 39 0． 002 0
X1X2 1 64． 64 64． 64 14． 67 0． 006 5
X1X3 1 37． 03 37． 03 8． 40 0． 023 0
X2X3 1 70． 22 70． 22 15． 94 0． 005 2
X1 2 1 73． 61 73． 61 16． 71 0． 004 6
X2 2 1 123． 18 123． 18 27． 96 0． 001 1
X3 2 1 171． 99 171． 99 39． 04 0． 000 4
注:P ＜ 0． 01 为极显著;P ＜ 0． 05 为显著;P ＞ 0． 05 为不显著。
Note:Significant difference(P ＜ 0． 01) ;Distinct difference(P ＜ 0． 05) ;No distinct difference(P ＞ 0． 05)．
根据回归方程绘出响应曲面图及等高线图，以确定蛋白胨质量浓度、酵母膏质量浓度和土豆质量浓度
3 个因素对发酵产物抗氧化活性的影响，响应曲面图和等高线图如图 4 所示。由响应曲面图可以看出，两
因素之间的影响趋势均表现为先增大后减小，当三者分别达到一定浓度时，响应曲面均有一个极大值点。
图 4 中等高线均成椭圆形，表明每 2 个因素之间的交互作用显著，这与回归模型方差分析结果一致。
获得非线性回归模型和响应曲面后，为求得到培养基最佳浓度，对回归拟合方程分别求各自变量的一
阶偏导数，得到三元一次方程组。求解方程得到最大抗氧化活性所对应的最佳条件，即 X1 = 0． 53(蛋白胨
17 g·L － 1) ，X2 = 0． 45(酵母膏 16 g·L
－ 1) ，X3 = 5． 3 × 10
－5(土豆 300 g·L － 1) ，Y = 78． 25%。最终得出最佳
培养基配方:17 g·L － 1蛋白胨，16 g·L － 1酵母膏，300 g·L － 1土豆，30 g·L － 1麦芽糖，30 g·L － 1甘露醇，5 g·L － 1
葡萄糖，10 g·L － 1味精，10 g·L － 1氯化钠，pH为 7，该培养条件下发酵产物的最大清除率为 78． 25%。
3 讨论
某些植物内生真菌能够产生天然抗氧化活性物质。Harper 等［18］从 Terminalia morobensis 的一株内生
真菌中得到两种异构体 pestacin和 isopestacin，二者既表现出抗菌活性，又显示出抗氧化活性;Huang 等［19］
从植物 Nerium oleander L．中分离出的 NoS3 菌株具有最强的抗氧化能力，对黄嘌呤氧化酶的抑制活性比
阳性对照都高很多;谢辉等［20］发现杜仲内生球毛壳菌的抗氧化能力与维生素 C 基本相当，清除超氧阴离
子的能力比芦丁要好。因此，从植物中分离内生真菌并通过现代发酵技术进行大量培养为寻找和开发天
然抗氧化剂提供了一条有效途经。
在植物内生真菌的筛选过程中，由于一般侧重于活性研究，而忽略真菌的分类鉴定导致大量的重复研
究，因此，确定不同来源植物内生真菌的种属地位就显得尤为必要。传统分类方法只是基于简单的形态学
特征，仍存在许多争议。目前，随着分子生物学技术的发展，利用 DNA序列分析对真菌进行鉴定成为有效
的手段并有了广泛的应用。基于 rDNA-ITS 的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析，可以
从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息来反映生物亲缘关系与分类情况，目前已广泛应用于真菌的
属种间及部分种内组群水平的系统学研究。但是，rDNA-ITS 序列分析的应用仍存在一定限制［21］:某些物
种的 ITS区序列可变程度相对有限，并不足以用来分析其属种或组群间的差异;另外，ITS序列分析结果还
受到比对使用的基因库完善程度的影响。因此，将 ITS序列分析结果与传统的真菌形态学鉴定结果(真菌
培养特征、镜检特征等)相结合才能正确地对真菌进行鉴定，防止误检、错检。
镰刀菌是一类分布广泛的致病菌，主要污染谷类(如小麦、玉米、大麦) ，通常产生真菌毒素和真菌雌
激素污染作物，其中 3 种最具破坏性的镰刀属菌分别为禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌
(Fusarium culmorum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)［22］，这 3 种镰刀菌在仲夏湿热天气感染大麦和
241
第 2 期 赵育卉，等:盐生海芦笋内生真菌 S19 的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化
图 4 蛋白胨、酵母膏和土豆质量浓度对发酵产物抗氧化活性影响的响应曲面和等高线图
Fig． 4 Response surface and contour plot showing the effects of peptone，yeast extract
and potato concentration on the antioxidant activity of fermentation product
小麦产生赤霉病，也产生小分子次级代谢产物单端孢霉烯族毒素类化合物，如脱氧萎镰菌醇、念珠镰刀菌
素等［23］。因此，这些小分子次级代谢产物通常被认为是谷类中的有害天然污染物，也是许多国家检测谷
类真菌毒素的检测指标。令人感兴趣的是，镰刀属在产生有害污染物的同时，也产生一些具有重要生物活
性的次级代谢产物，如燕麦镰刀菌能产生抗生素———恩镰孢菌素、抗生素 Y(结构类似于真菌毒素 －橘霉
素)等［24］。恩镰孢菌素具有抑制细菌和真菌的作用，其驱虫、杀虫、除草等特性被大量报道证实［25 － 26］，恩
镰孢菌素也是潜在的乙酰辅酶 A胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂，其能抑制三甘酯的合成减少细胞内游
离脂肪酸，从而降低胆固醇酯的合成［27］;抗生素 Y对细菌具有很强的抑制作用并具有高度特异性，但毒性
很低，可用于药物治疗［24］。因此，镰刀属菌是一类病原菌，也是有益菌，其有害或有益作用取决于多种因
素，如生长环境、培养条件、生长基质等。
盐生海芦笋是一种高度耐盐的海水蔬菜，研究表明其提取物具有显著的抗氧化活性，推断其组织内部
341
南 京 农 业 大 学 学 报 第 36 卷
可能含有与之共生并能产生强抗氧化活性物质的内生真菌。在本研究中，通过形态学鉴定与 rDNA-ITS 序
列分析，将源于盐生海芦笋的内生真菌 S19 鉴定为燕麦镰刀菌 Gibberella avenacea(同 Fusarium avenace-
um)。采用 Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应曲面法对该菌株的发酵条件进行优化，优化后的最
佳培养基配方为:16 g·L － 1酵母膏，17 g·L － 1蛋白胨，300 g·L － 1土豆，30 g·L － 1麦芽糖，30 g·L － 1甘露醇，5 g
·L － 1葡萄糖，10 g·L － 1味精，10 g·L － 1氯化钠，pH为 7;采用此培养基所得发酵产物对 DPPH的最大清除率
为 78． 25%，比优化前(清除率 66． 55%)有显著提高。燕麦镰刀菌为首次从海芦笋中分离得到，该研究结
果表明燕麦镰刀菌不仅在谷类中广泛存在，而且在盐生海芦笋中能够寄生，进一步说明该菌能够在多种环
境中生存，其发酵产物具有较强的抗氧化活性，提示其中可能存在具有抗氧化活性的有机小分子物质，为
深入研究该菌的生物特性和代谢产物提供了依据。
参考文献:
［1］ 侯军，刘方，李乐，等．真菌来源的抗氧化活性物质研究进展［J］．食品科学，2008，29(9) :648 － 653
［2］ Stierle A，Strobel G，Stierle D． Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of pacific yew［J］． Science，1993，
260(5105) :214 － 216
［3］ 谢辉，李莉，吴鸣谦，等． 1 株杜仲内生真菌的抗氧化活性分析和菌种鉴定［J］．安徽农业科学，2009，37(1) :230 － 232
［4］ 严铸云，庞蕾，罗静，等．银杏内生真菌菌种的分离及鉴定［J］．华西药学杂志，2006，21(5) :425 － 427
［5］ 刘建利．宁夏枸杞内生真菌的分离及抗氧化活性的测定［J］．时珍国医国药，2011，22(4) :857 － 860
［6］ 朱伟明，王俊锋．海洋真菌生物活性物质研究之管见［J］．菌物学报，2011，30(2) :218 － 228
［7］ Attia F M，Alsobayel A A，Kriadees M S，et al． Nutrient composition and feeding value of Salicornia bigelovii torr meal in broiler diets［J］． Ani-
mal Feed Science and Technology，1997，65(1 /2 /3 /4) :257 － 263
［8］ Jang H S，Kim K R，Choi S W，et al． Antioxidant and antithrombus activities of enzyme-treated Salicornia herbacea extracts［J］． Annals of Nutri-
tion and Metabolism，2007，51(2) :119 － 125
［9］ Kim Y A，Kong C S，Um Y R，et al． Evaluation of Salicornia herbacea as a potential antioxidant and anti-inflammatory agent［J］． Journal of Me-
dicinal Food，2009，12(3) :661 － 668
［10］ Kong C S，Kim J A，Qian Z J，et al． Protective effect of isorhamnetin 3-О-β-d-glucopyranoside from Salicornia herbacea against oxidation-induced
cell damage［J］． Food and Chemical Toxicology，2009，47(8) :1914 － 1920
［11］ Ryu D S，Kim S H，Lee D S． Anti-proliferative effect of polysaccharides from Salicornia herbacea on induction of G2 /M arrest and apoptosis in
human colon cancer cells［J］． Microbiol Biotechnol，2009，19(11) :1482 － 1489
［12］ 张晨炜，纪燕玲，杨守玲，等．禾本科植物内生真菌研究 12:吉林犬草内生真菌的分离和鉴定［J］．南京农业大学学报，2011，34(2) :78 －84
［13］ 张志华，洪葵，高昊，等．具有细胞毒活性红树林真菌 094811 的鉴定［J］．微生物学杂志，2006，26(4) :6 － 11
［14］ 魏景超．真菌鉴定手册［M］．上海:上海科学技术出版社，1979:632 － 634
［15］ Gonzalez V，Arenal F，Platas G，et al． Molecular typing of Spanish species of Amanita by restriction analysis of the ITS region of the DNA［J］．
Mycological Research，2002，106(8) :903 － 910
［16］ Yang B，Zhao M，Shi J，et al． Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan
fruit pericarp［J］． Food Chemistry，2008，106(2) :685 － 690
［17］ 张田田，沈明浩． Plackett-Burman设计和响应面法优化火红密孔菌发酵产漆酶培养基［J］．食品工业科技，2011，32(9) :223 － 226
［18］ Harper J K，Arif A M，Ford E J，et al． Pestacin:a 1，3-dihydro isobenzofuran from Pestalotiopsis microspora possessing antioxidant and antimycotic
activities［J］． Tetrahedron，2003，59(14) :2471 － 2476
［19］ Huang W Y，Cai Y Z，Hyde K，et al． Endophytic fungi from Nerium oleander L．(Apocynaceae) :main constituents and antioxidant activity［J］．
World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23(9) :1253 － 1263
［20］ 谢辉，陈双林．杜仲内生球毛壳菌的抗氧化活性研究［J］．菌物学报，2009，28(4) :591 － 596
［21］ 燕勇，李卫平，高雯洁，等． rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用［J］．中国卫生检验杂志，2008，18(10) :1958 － 1961
［22］ Abramson D，McCallum B，Smith D M，et al． Moniliformin in barley inoculated with Fusarium avenaceum［J］． Food Addit Contam，2002，19(8) :
765 － 769
［23］ Burgess L W，Nelson P E，Toussoun T A，et al． Distribution of Fusarium species in sections Roseum，Arthrosporiella，Gibbosum and Discolor recov-
ered from grassland，pasture and pine nursery soils of Eastern Australia［J］． Mycologia，1988，80(6) :815 － 824
［24］ Golinski P，Wnuk S，Chelkowski J，et al． Antibiotic Y:biosynthesis by Fusarium avenaceum(Corda ex Fries)Sacc．，isolation，and some physico-
chemical and biological properties［J］． Appl Environ Microbiol，1986，51(4) :743 － 745
［25］ Herrmann M，Zocher R，Haese A． Enniatin production by fusarium strains and its effect on potato tuber tissue［J］． Applied and Environmental
Microbiology，1996，62(2) :393 － 398
［26］ Nilanonta C，Isaka M，Chanphen R，et al． Unusual enniatins produced by the insect pathogenic fungus Verticillium hemipterigenum:isolation and
studies on precursor-directed biosynthesis［J］． Tetrahedron，2003，59(7) :1015 － 1020
［27］ Trenin A S，Tolstykh I V，Terekhova L P，et al． The hypolipidemic action of antibiotic 86 /88(enniatin B)in a hepatoblastoma G2 cell culture［J］．
Antibiot Khimioter，2000，45(4) :6 －9
责任编辑:范雪梅
441