全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 November 2008, 27(6): 873-883

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分离培养及分子
鉴定
李海波 1 吴学谦 1,2* 王立武 3 付立忠 1,2 魏海龙 1,2 吴庆其 1,2
1浙江省林业科学研究院 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室 杭州 310023
2 丽水市食用菌研究开发中心 丽水 323000
3西藏那曲地区林业局 那曲 852000


摘 要：首次从采自青藏高原、与高原牧草嵩草属Kobresia草本植物形成外生菌根的黄绿蜜环菌Armillaria
luteo-virens 子实体中分离获得一组织分离菌株，运用 rDNA-ITS 和 rDNA-IGS-1 测序技术对该组织分离菌
株是否为黄绿蜜环菌的纯培养菌种进行分子鉴定，并基于黄绿蜜环菌的 5.8S/ITS 和 IGS-1 序列进行核酸
序列数据库 GenBank 同源性检索比对、构建系统发育树。结果表明，本研究获得的黄绿蜜环菌子实体组
织分离菌株即为其纯培养菌种。基于 ITS 的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与口蘑科内其它属间物种的系
统发育关系较远；基于 IGS-1 的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与蜜环菌属内的其它种序列差异较大，系
统发育关系较远，而与 Lepiota 属内的部分种具有较近的系统发育关系。本研究首次基于分子手段对我国
青藏高原的黄绿蜜环菌种进行了分离培养、分子鉴定和系统发育分析，为黄绿蜜环菌的科学分类提供了
分子依据。
关键词：外生菌根，分离培养，rDNA-ITS 序列分析，rDNA-IGS 序列分析，系统发育

Pure culture isolation, cultivation and molecular
identification of Armillaria luteo-virens from Tibet Plateau
LI Hai-Bo1 WU Xue-Qian1,2 WANG Li-Wu3 FU Li-Zhong1,2 WEI Hai-Long1,2
WU Qing-Qi1,2

基金项目：浙江省科技计划项目（No. 2006F11003；2006R20006）；浙江省省院合作林业科技项目（No. 2005SY05）
*Corresponding author. Tel: 0571-87798215; E-mail: wxq655@163.com
收稿日期：2008-01-24，接受日期：2008-06-24
DOI:10.13346/j.mycosystema.2008.06.014
874 Mycosystema
1Zhejiang Forestry Academy; Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest
Resource, Hangzhou 310023, China
2Lishui Edible Fungal Research and Development Center, Lishui 323000, China
3Nagqu Forestry Bureau of Tibet, Nagqu 852000, China
Abstract: Armillaria luteo-virens is a ectomycorrhizal fungus symbiotic with some species of Kobresia in Tibet
Plateau, China. A strain was recently isolated from fruitbody tissue of the fungus. To determine whether the
strain is the pure culture of the fungus, the internal transcribed spacer (ITS) region and the first intergenic spacer
region (IGS-1) of the nuclear ribosomal DNA of fruiting body and the isolated strain were sequenced and
compared. Further, the 5.8S/ITS and IGS-1 sequences of the species were BLAST matched with GenBank
database on homology and a phylogenetic tree was constructed based on 5.8S/ITS sequence and two
phylogenetic trees were constructed separately based on two IGS-1 sequences. The results demonstrated that the
strain isolated from fruitbody tissue of Armillaria luteo-virens was the true pure culture of the fungus.
Phylogenetic analysis based on 5.8S/ITS sequence indicated Armillaria luteo-virens has a distant phylogenetic
relationship with other genera of Tricholomataceae. Phylogenetic analysis based on two IGS-1 sequences
indicated there were significant differences between the IGS-1 sequence of Armillaria luteo-virens and that of
other species of Armillaria. Armillaria luteo-virens has a relatively close phylogenetic relationship with some
species of Lepiota.
Key words: ectomycorrhizal fungi, rDNA-ITS sequence analysis, IGS sequence analysis, phylogeny


西藏位于我国西南边陲、青藏高原西南部，其独特的自然环境及其生物资源，历来为
世人瞩目。青藏高原是世界上大型真菌分布最高的区域，被称为“高山真菌宝库”（卯晓
岚 2007）。冬虫夏草 Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.和黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens
(Alb. et Schwein. : Fr.) Sacc.是青藏高原真菌资源宝库中的代表种。
蜜环菌属Armillaria (Fr.:Fr.) Staude.隶属于担子菌门Basidiomycota、担子菌纲
Basidiomycetes、伞菌目Agaricales、口蘑科Tricholomataceae。蜜环菌在全世界温带和寒温
带侵染600多种树木，可导致林木根朽病，造成巨大的经济损失。蜜环菌同时也是一类具
有较高药用价值的药用真菌，而且还是名贵中药天麻Gastrodia elata和猪苓Grifola
umbellata栽培所必备的共生菌（秦国夫等 2004）。蜜环菌属种在欧洲、北美、澳洲、非
洲以及亚洲的日本、韩国均有分布（赵俊和赵杰 2007）。我国已经报道的蜜环菌属种有
14个，统称中国生物种（Chinese Biological Species，CBS）（赵俊等 2005；赵俊和赵杰 2007）。
黄绿蜜环菌夏秋季节主要分布在我国的西藏、青海等地海拔2500-4500m的草原或高山草甸
上，与高原牧草嵩草属Kobresia草本植物形成外生菌根（刁治民 1996）。在子实体发生季
节，形成特有的蘑菇圈，当地藏民以其形态特征为识别依据，冠之为“黄金菇”、“黄蘑
菇”、“黄环菇”等。黄绿蜜环菌新鲜子实体肉质肥嫩，干品香气浓郁，味道鲜美，且具
有药效（李渝珍 2005），是产区藏民极为喜欢采食和出售的“草原一宝”，在淡季时的
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市场价格有时高达每公斤200元以上，更被公认为最有开发利用价值的名贵野生食用菌类
之一，也引起了有关食药用真菌资源科研工作者的日益关注。目前，黄绿蜜环菌处于完全
野生的状态，而随着当地藏民年年无节制地采摘，黄绿蜜环菌的生态环境正在不断恶化，
野生产量日益减少，售价也节节攀高，不久的将来野生黄绿蜜环菌资源有被人工野蛮采摘
枯竭的危险。如何有效地开发利用黄绿蜜环菌资源，首先取决于黄绿蜜环菌的引种驯化。
菌根真菌纯培养菌种的分离和培养难度相对较大，而且长期以来菌种的鉴定一直是根
据子实体的形态解剖特征来进行的（黄亦存等 1992），但对于一些不产生子实体或尚未
找到子实体的菌根真菌则无法进行。即使分离得到了纯培养的菌株也须遵循经典的柯赫法
则（Koch’s Postulate）进行真伪鉴定，但回接试验的执行难度很大。因此，对菌根真菌及
其纯培养菌种的快速准确鉴定势必借助现代分子生物学的技术手段，即开展 DNA 亲菌鉴
定。核糖体 DNA（rDNA）的编码区序列具有保守性而非编码区变异丰富，分析真菌核糖
体基因是进行真菌分类鉴定和系统发育的有效方法（Bruns et al. 1991）。近年来，在对蜜
环菌属真菌的研究方面，有基于 rDNA 间隔区 IGS-1（the first intergenic spacer region）的
RFLP（restriction fragment length polymorphism）分子标记多态性（Kim et al. 2000）、基于
大亚基 nLSU（nuclear large subunit rDNA）、rDNA 内转录间隔区 ITS/5.8S （internal
transcribed spacer）、IGS-1 和 AFLP（amplified fragment length polymorphism）分子标记多
态性（Kim et al. 2006）对北美的部分蜜环菌属种进行分子鉴定、亲缘关系分析和基于 ITS
和 IGS-1 序列对南美和印尼、马来西亚的部分蜜环菌属种进行分子鉴定和系统进化地位分
析（Coetzee et al. 2003；Coetzee et al. 2001）的研究报道，在这些研究报道中均未见有黄
绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 种。而在国内仅有关于黄绿蜜环菌生态环境、资源现状以
及人工驯化等方面的零星报道，鲜有基于 DNA 分子手段对黄绿蜜环菌或其它蜜环菌属真
菌进行分类鉴定和系统发育方面的研究。
本研究首先对采自我国青藏高原的珍稀外生菌根真菌黄绿蜜环菌进行组织分离和培
养，并基于 rDNA-ITS 和 rDNA-IGS-1 序列分析技术对组织分离培养的菌株是否为其真正
的纯培养菌种进行分子鉴定。在对分离菌株是否为其真纯培养菌种作出正确判定后，进一
步对测得的黄绿蜜环菌 rDNA-ITS 和 rDNA-IGS-1 序列进行核酸序列数据库 GenBank 同源
性检索比对、构建系统发育树以明确黄绿蜜环菌的分类地位，分析其与蜜环菌属内其它种
的亲缘关系。本研究不仅可为我国黄绿蜜环菌资源的科学分类提供基础数据，而且纯培养
菌种的获得和培养也有望为高原珍稀外生菌根真菌黄绿蜜环菌资源的开发利用提供基础
研究材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试子实体和组织分离菌株：供试的黄绿蜜环菌子实体于 2007 年 8 月采自西藏那曲
海拔 4500m 以上的高原草甸上，在室温下放置 3h 后，取幼嫩子实体，表面消毒后用灭菌
手术刀小心取菌盖与菌柄结合处的组织块移置在改良 Ec-PDM 试管培养基上。组织分离和
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培养均采用改良 Ec-PDM 培养基[去皮马铃薯 200g，葡萄糖 15g，MgSO4 1g，CaCl2 0.25g，
KH2PO4 1g，(NH4)2HPO4 0.5g，KNO3 1g，盐酸硫胺素（Vitamin B1）0.2mg，麦牙浸出粉
3g，琼脂 15g，水 1000mL，pH 5.6]，子实体组织块在 25℃下恒温培养。
1.1.2 主要试剂及引物：rDNA-ITS、rDNA-IGS-1 的 PCR 扩增所用试剂、DNA 纯化试剂盒
和 DNA 凝胶回收试剂盒均购自杭州博日科技有限公司。rDNA-ITS 分析所用的引物
ITS5/ITS4（White et al. 1990）和 rDNA-IGS-1 分析所用的引物 LR12R/O-1（Veldman et al.
1981；Duchesne & Anderson 1990）和 P-1/O-1（Hsiau 1996；Duchesne & Anderson 1990）
由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取及检测：取子实体的菌盖部分（含菌褶）用来提取 DNA；组织
分离菌株先从 Ec-PDM 培养基试管斜面转接到 Ec-PDM 培养基平皿培养，待菌落直径长至
3cm 后，刮取平皿上的菌丝体来提取 DNA。DNA 的提取参照有关文献报道的 SDS-CTAB
法（曾大兴 2003），并使用 DNA 纯化试剂盒对提取的 DNA 进行纯化。纯化后的 DNA 先
用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用 DNA/RNA 紫外分光光度计（GeneQuant Pro，
GE Healthcare 公司）定量检测。
1.2.2 rDNA-ITS 分析：rDNA-ITS 的 PCR 扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5µL，10mmol/L
dNTPs 2µL，25mmol/L MgCl2 2µL，5U/µL Taq DNA 酶 0.3µL，10µmol/L ITS5/ITS4引物各
1µL，17ng/µL 模板 DNA 3µL，ddH2O 14.2µL，反应总体积为 25µL。扩增反应在杭州博日
公司的 TC-XP 型扩增仪上进行，94℃预变性 1min 后；92℃变性 15s，61℃退火 15s，72℃
延伸 1min，共 30 个循环；最后于 72℃补平 5min，终止温度为 4℃。
1.2.3 rDNA-IGS-1 分析：rDNA-IGS-1 的 PCR 扩增体系分别参照 Kim 等（2006）和 Coetzee
等（2003）的方法。
1.2.4 PCR 产物检测和扩增图谱摄取：采用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测 rDNA-ITS 和
rDNA-IGS-1 的 PCR 扩增产物，采用上海培清科技有限公司的 JS-380A 自动凝胶图像分析
仪摄取扩增图谱。
1.2.5 ITS 和 IGS-1 片段的回收、克隆和测序：采用 DNA 凝胶回收试剂盒从 1.5%的琼脂糖
凝胶中回收 ITS 和 IGS-1 的 PCR 扩增片段，并用 DNA/RNA 紫外分光光度计（GeneQuant
Pro，GE Healthcare 公司）检测浓度。回收产物用大连宝生物工程公司的 pMD-18T Vector
连接，转化于大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株感受态细胞，经蓝白斑筛选和 PCR 鉴定后，
每个样品均随机挑选 3 个阳性克隆交付上海基康生物技术有限公司完成测序。
1.3 序列比较和系统发育分析
将本研究测得的 ITS 序列和从 GenBank 中通过 BLASTN 检索获得的部分同源序列均
去掉 5′端的 18S 序列和 3＇端的 28S 序列，保留 5.8S/ITS 区序列，并转换为 FASTA 格式，
同样将 IGS-1 序列和从 GenBank 中通过 BLASTN 检索获得的部分同源序列转换为 FASTA
格式。用 Clustal X（version 1.81）（Thompson et al. 1997）软件中的 Alignment 程序对所有
同源序列进行多重对位排列（multiple alignments），并手动将对位排列结果中 5＇和 3＇
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端的非对位排列区（unalignable region）去除。
用 MEGA（version 2.1）（Kumar et al. 2001） 软件包进行系统发育分析和进化树的
构建。用 Kimura2-parameter 模式计算遗传距离，所有对位排列结果中的空位（gaps）或缺
失数据（missing data）作完全删除（complete deletion）处理，进化距离分析采用邻位相连
法（NJ，neighbor-joining）。系统树的每个分支的统计学显著性分析以自展法（bootstrap）
进行检验，重复次数为 1000 次。
2 结果与分析
2.1 黄绿蜜环菌子实体的组织分离菌株
在 25℃下恒温培养约 5d 后，黄绿蜜环菌子实体组织块开始萌发生长，长出白色菌丝
菌落，但扩展很慢。经转接 Ec-PDM 平皿培养基继续培养至 20d 后（图 1），白色菌丝开始
在平皿培养基表面定殖生长。再经转接 Ec-PDM 平皿培养基持续培养至 4 个月后（图 1），
形成的菌落形态清晰可见，直径约 4.5cm，白色菌丝呈致密的绒毛状匍匐生长在培养基表
面，生长初期形成的菌落中部稍凸，色泽纯白，后逐渐平展，色泽浅白，菌落边缘呈土黄
色。菌落有二个清晰的轮纹。菌落背面色泽呈金黄色，无色素分泌至培养基中。


图 1黄绿蜜环菌子实体的组织分离菌株 A: 培养 20d 后；B: 培养 4 个月后.
Fig. 1 Fruitbody tissue isolate of Armillaria luteo-virens. A: Culture in 20 days; B: Culture in 4 months.

2.2 黄绿蜜环菌 ITS 和 IGS-1 片段的 PCR 扩增及测序
分别以黄绿蜜环菌子实体和组织分离菌株菌丝体的基因组 DNA 为模板，对 ITS 和
IGS-1 片段进行 PCR 扩增（图 2）。图 2 显示，从 2 个材料的基因组 DNA 中，引物 ITS5/ITS4
皆成功地扩增出了惟一的一条带，即位于黄绿蜜环菌核 rDNA-ITS 区（ITS1-5.8S-ITS2）的
一段序列，序列长度皆大于 700bp；引物 LR12R/O-1、P-1/O-1 也分别从 2 个材料的基因组
DNA 中扩增出了位于大亚基 rRNA 基因和 5S rRNA 基因之间的一段 IGS-1 片段，序列长
度皆分别接近 500bp 和 250bp。
进一步对 2 个供试材料的 ITS 和 IGS-1 片段进行测序，测序结果显示黄绿蜜环菌子实
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体与其组织分离菌株的 ITS 片段、2 个 IGS-1 片段不仅序列长度相同，而且碱基排列完全
一致，这充分表明该组织分离培养菌株即为黄绿蜜环菌的纯培养菌种。黄绿蜜环菌的 ITS
序列总长度为 703bp，其中 18S 为 54bp，ITS1 为 216bp，5.8S 为 152bp，ITS2 为 228bp，
28S 为 53bp，5.8S/ITS 区为 596bp。黄绿蜜环菌的 rDNA-ITS 序列提交 GenBank，获得
Accession Number EU365877。IGS-1 片段的测序结果显示，由引物对 LR12R/O-1 扩增的
IGS-1 片段总长度为 428bp，命名为 IGS-1428，其中大亚基 rRNA 序列为 275bp，IGS-1 序
列为 153bp；由引物对 P-1/O-1 扩增的 IGS-1 片段总长度为 249bp，命名为 IGS-1249，其中
大亚基 rRNA 序列为 96bp，IGS-1 序列同样为 153bp。黄绿蜜环菌的 2 个 IGS-1 序列提交
GenBank，获得 Accession Number EU586021、EU586022。


图2黄绿蜜环菌子实体及其分离菌株的rDNA-ITS和 rDNA-IGS-1扩增图谱 M 泳道为 DNA 分子量标准，Al-f、
Al-1 泳道分别为子实体和组织分离菌株.
Fig. 2 rDNA-ITS amplification pattern of the fruitbody and its tissue isolate of Armillaria luteo-virens. Lane M was DNA
marker (DL2000bp), lane Al-f and Al-1 were the fruitbody and fruitibody tissue isolate, respectively.
2.3 系统发育分析
2.3.1 基于 rDNA-ITS 序列的系统发育：将黄绿蜜环菌纯培养菌种的 5.8S/ITS 序列在
GenBank 核酸序列数据库进行 BLASTN 序列相似性（similarity）检索，在同源序列表中显
示的均为口蘑科其它属内的种或不能培养的外生菌根真菌（uncultured ectomycorrhizal
fungus），而未得到与黄绿蜜环菌同源的其它蜜环菌属物种。下载 11 个经 BLASTN 全序
列比较后最大相似率在 80%以上的同源物种的 5.8S/ITS 序列，连同本研究中的黄绿蜜环菌
5.8S/ITS 序列共 12 个序列一起用于系统发育分析。在用 Clustal X 软件做多重对位排列后，
去除 5＇和 3＇端的非对位排列区，最后的对位序列中共包括了空位在内的 646 个位置用
于系统进化树构建（图 3）。图 3 显示在系统发育树上黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens
独立为一大类，明显有别于口蘑科内 Lepista 属、Clitocybe 属和 Tricholoma 属内的其他种，
这表明就从 5.8S/ITS 的序列差异来看，黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 与其他属内各种
的差异很大，发育关系较远。

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图 3 基于黄绿蜜环菌 5.8S/ITS 区碱基序列构建的 NJ 系统发育树 Nucleotide: Kimura 2-parameter, complete
deletion, bootstrap=1000；节间数字代表 bootstrap 支持值(50%以下未显示)；粗体且上标*的样品序列为本文作者所测，其余样
品序列来自 GenBank.
Fig. 3 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree based on 5.8S/ITS region sequences of Armillaria luteo-virens. Nucleotide:
Kimura 2-parameter, complete deletion, bootstrap=1000; The numbers in each node represents bootstrap support value, and the
numbers lower than 50 were not shown. The samples in bold and marked with asterisks were examined by the authors, and others
obtained from GenBank.

2.3.2 基于 rDNA-IGS-1 序列的系统发育：将黄绿蜜环菌纯培养菌种的 IGS-1 序列 IGS-1428
和 IGS-1249分别在 GenBank 核酸序列数据库进行 BLASTN 序列相似性（similarity）检索，
在同源序列表中显示与黄绿蜜环菌 IGS-1428 序列具有较高相似性的有 Tricholoma 属、
Lepiota 属、Armillaria 属以及 Diehliomyces 属内的部分种，与 IGS-1249 具有较高相似性的
有 Lepiota 属、Lepista 属以及 Lyophyllum 属内的部分种。分别下载 8 个经 BLASTN 全序
列比较后与 IGS-1428 序列最大相似率在 89%以上、6 个与 IGS-1249 序列最大相似率在 90%
以上的其他属内部分种的 IGS-1 序列，分别连同 IGS-1428和 IGS-1249序列用于系统发育分
析。在用 Clustal X 软件做多重对位排列后，去除 5＇和 3＇端的非对位排列区，最后的对
位序列中分别包括了空位在内的 449 个和 268 个位置用于系统进化树构建（图 4）。图 4
显示在由 IGS-1428 序列构建的系统发育树上，黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 与 Lepiota
属内的 2个种 Lepiota cristata、Lepiota castaneidisca聚成了一大类群，其 bootstrap值为 99%，
而隶属蜜环菌属内的另外 4 个种则令人信服地聚成了另一大类群，其 bootstrap 值为 100%，
这充分表明尽管同为蜜环菌属，但黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 与蜜环菌属内的其它
种序列差异较大，系统发育关系较远。由 IGS-1249 序列构建的系统发育树进一步显示了与
由 IGS-1428序列构建的系统发育树同样的结果，黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 再次与
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Lepiota 属内的 4 个种聚为了一大类群，在系统发育树上更无蜜环菌属内其它种，这表明就
从 IGS-1 的序列差异来看，黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-virens 应该与 Lepiota 属内的 Lepiota
cristata、Lepiota castaneidisca、Lepiota hymenoderma 等物种具有较近的系统发育关系。

图 4 基于黄绿蜜环菌 IGS-1 区碱基序列构建的 NJ 系统发育树 Nucleotide: Kimura 2-parameter, complete
deletion, bootstrap=1000；节间数字代表 bootstrap 支持值(50%以下未显示)；粗体且上标*的样品序列为本文作者所测，其余样
品序列来自 GenBank.
Fig. 4 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree based on IGS-1 region sequences of Armillaria luteo-virens. Nucleotide: Kimura
2-parameter, complete deletion, bootstrap=1000; The numbers in each node represents bootstrap support value, and the numbers lower
than 50 were not shown. The samples in bold and marked with asterisks were examined by the authors, and others obtained from
GenBank.

3 讨论
不同于大多数的菌根真菌与木本植物形成林木外生菌根，黄绿蜜环菌不仅是我国青藏
高原特有的一种外生菌根真菌，同时也是一种能侵染耐寒的高原嵩草属 Kobresia 草本植物
并形成外生菌根的模式真菌。我们在对黄绿蜜环菌子实体的营养价值进行全面的分析并与

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香菇和双孢蘑菇比较后发现，黄绿蜜环菌的蛋白质、氨基酸含量、矿质元素含量以及抗肿
瘤活性成分多糖含量均显著高于香菇和双孢蘑菇（数据待发表）。我们在研究中还初步发
现黄绿蜜环菌同样可以侵染遗传学和植物发育研究中常用的试验材料拟南芥 Arabidopsis
thaliana，并对侵染后的拟南芥植株生长有显著影响，这提示黄绿蜜环菌很可能是可以用于
探索研究外生菌根真菌侵染草本植物分子机理的珍贵材料。可见，黄绿蜜环菌纯培养菌种
的成功分离不仅为今后研究黄绿蜜环菌的引种驯化栽培乃至活性成分分离提取提供了宝
贵的种质材料，而且也在一定程度上为今后从分子水平上研究外生菌根真菌侵染草本植物
的机理提供了可能性。
尽管我们从西藏成功分离获得了黄绿蜜环菌的纯培养菌种，但由于黄绿蜜环菌属于外
生菌根真菌，寄主专一性强，采用本文的半综合培养基即使能够分离获得黄绿蜜环菌纯培
养菌丝体，其生长速度也很慢，菌种的长期保藏也不容易。在野外调查中发现，黄绿蜜环
菌散生或单生于高寒嵩草草甸上，形成蘑菇圈，而且其白色菌丝并不局限于某一点生长，
而是环绕在嵩草根系周围较大面积的区域内，形成“菌塘”。可见实验室的纯培养条件并
非黄绿蜜环菌菌丝最佳的生长条件，因此有必要继续对黄绿蜜环菌的生存环境进行详细和
全面的调查，并从生理和分子水平上探索黄绿蜜环菌与草本植物的共生机制，进而优化纯
培养条件，以找出菌丝生长的最佳培养配方，为今后黄绿蜜环菌的引种驯化栽培创造条件。
与传统的基于子实体形态解剖特征来鉴定目前极难人工培养的林木共生菌纯培养菌
种相比，基于分子水平上 rDNA 部分区段测序比对更加直接、可靠、方便（White et al. 1990），
优势非常明显。据文献报道，rDNA-ITS 测序技术已成功应用于对致命鹅膏菌 Amanita
exitialis（Zhang et al. 2005）、葡酒红菇 Russula vinosa（王桂文和孙文波 2004）、松乳菇
Lactarius deliciosus（熊涛等 2006）、乳牛肝菌 Suillus bovinus（佟丽华和连宾 2005）、
缘盖牛肝菌 Boletus appendiculatus（李海波等 2007）等珍稀外生菌根菌纯培养菌种的鉴定。
在本研究中，我们同样基于 rDNA-ITS 和 rDNA-IGS-1 序列分析二种分子手段成功对我国
青藏高原的珍稀外生菌根菌黄绿蜜环菌进行了快速准确的鉴定，这为今后一些珍稀共生菌
纯培养菌种的保护利用、长期保藏提供了必要的技术支撑。
蜜环菌在全球均有分布，传统的依据形态特征进行分类由于受环境的影响较大，主观
性非常强。自 1978 年 Ullrich 和 Korhonen 发现蜜环菌的遗传交配机制以来，蜜环菌的分
类由过去纯形态的、人为的主观分类转向了以互交不育群（intersterility group）即生物种
(biological species)为基础的客观分类。近年来的研究表明，原有蜜环菌属的分类体系中，
大部分种类已经不属于蜜环菌属，相继转移到伞菌目其他属中，黄绿蜜环菌已由过去的
Armillaria luteo-virens (Alb. et Schwein.: Fr.) Sacc.更改为现在的 Floccularia luteovirens (Alb.
et Schwein.: Fr.) Pouzar（赵俊等 2005）。在本研究中我们基于 5.8S/ITS 和 IGS-1 序列对黄
绿蜜环菌进行的系统发育分析也从分子水平上表明黄绿蜜环菌与在NCBI的GenBank登录
的蜜环菌属内其它种的序列差异较大，系统发育关系较远，而与口蘑科环柄菇属 Lepiota
内的部分种有着较近的系统发育关系。但从目前的国内文献来看，黄绿蜜环菌的学名
Armillaria luteo-virens (Alb. et Schwein.: Fr.) Sacc.仍在沿用。
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