全 文 ：应用与环境生物学报 2009，15 ( 5 ): 719~723
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2009-10-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00719
在根瘤菌资源研究和保藏中，研究者往往以结瘤试验
来验证根瘤内分离菌是否为根瘤菌，却忽视了对结瘤试验所
形成根瘤的菌株即结瘤菌株进行研究. 在根瘤菌的分离过程
中，也分离到了土壤杆菌，并且土壤杆菌菌株也能与植物形
成了根瘤，但经过对结瘤菌株的分离，发现结瘤菌株不是接
种的土壤杆菌，而是植物种子所带的根瘤菌菌株 [1]. 因此，仅
依靠结瘤试验来验证根瘤分离菌株是否为根瘤菌是片面的，
不准确的.
含羞草（Mimosa sp.）原产热带美洲，在我国分布于广
东、海南、台湾、云南等地 . 与含羞草植物共 生结 瘤的根瘤
应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证
含羞草根瘤菌的结瘤能力*
刘晓云1** 张 斌2 吴 伟3 李乔仙4
(1河北大学生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用实验室 保定 071002)
(2西南林学院资源学院，西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室 昆明 650224)
(3西南林学院保护生物学院 昆明 650224)
(4云南省草地动物科学研究院 昆明 650212)
Verifi cation of Nodulation Ability of Strains Isolated from Mimosa spp. Nodules
Using Whole Cell Protein SDS-PAGE Molecular Marker Method*
LIU Xiaoyun1**, ZHANG Bin2, WU Wei3 & LI Qiaoxian4
(1College of Life Sciences, Hebei University, Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of
Hebei Province, Baoding 071002, Hebei, China)
(2College of Resources, Southwest Forestry College, Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China of
State Forestry Administration, Kunming 650224, China)
(3College of Conservation Biology, Southwest Forestry College, Kunming 650224, China)
(4Academy of Grassland and Animal Science of Yunnan, Kunming 650212, China)
Abstract The nodules of Mimosa spp. were collected from some areas in Yuanjiang and Xishuangbanna, Yunnan, China.
Bacteria were isolated from these nodules with modifi ed medium, and 40 strains were selected to carry out the nodulation test.
The result showed that 38 strains could nodulate M. pudica. The nodulation rate was approximately 95%. 38 re-isolated strains
and their whole cell protein profiles were obtained. The clustering analysis demonstrated that 26 re-isolated strains had a
protein pattern identical to that of their original strains at the similarity of 100%, indicating that these 26 strains could establish
symbiosis with M. pudica. The whole cell protein profi les of 12 strains were different from those of the re-isolated strains,
indicating that the nodules were not formed by them and further research is needed. This study shows that the whole cell
protein SDS-PAGE can be used in inoculation test, and it is a time-saving and accurate molecular marker to identify rhizobia,
especially for characterizing plenty of isolates from nodules of various plants. Also, this study preliminarily reveals that the
competitive nodulation ability differs among rhizobial strains. Fig 2, Ref 28
Keywords Mimosa; rhizobia; molecular marker; whole cell protein pattern; SDS-PAGE
CLC S154.381
摘 要 对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离，选择其中40株菌为接种菌株，通过结瘤试验并采用
全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力. 经过结瘤试验，发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤
外，其它38株菌株均与含羞草植物结瘤，结瘤率为95%. 从结瘤试验所获根瘤中，分离得到结瘤菌株，采用全细胞蛋白
SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究. 蛋白图谱及聚类分析显示，26株接种菌株与其结瘤菌株
的全细胞蛋白分子图谱完全相同，在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起，说明宿主植物所形成的根瘤确系接
种菌株侵入所致，因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株；而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌
株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异，推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一
菌株，尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力，这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证. 研究结果表明，全细
胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法. 该方法进一步完善了结瘤试验，并
初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力，适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究. 图2 参28
关键词 含羞草；根瘤菌；分子标记；全细胞蛋白；SDS-PAGE
CLC S154.381
收稿日期：2008-10-27 接受日期：2008-12-25
∗国家自然科学基 金项目（No. 30570001）和国家 林业局重点实验室开
放基金（No. KL200703）资助 Supported by the National Natural Science
Foundation of China (No. 30570001) and the Fund of Key Laboratory of the
State Forestry Administration－Laboratory for Biodiversity Preservation in
Southwest China (No. KL200703)
∗∗通讯作者 Corresponding author (E-mail: liuxiaoyunly@126.com)
720 15 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
菌 种类较 其它豆科植物多样、复 杂且特 殊，到目前为止，
已报 道的能与含羞草 植物结 瘤的根 瘤 菌一 共 有7种，分别
为菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）[2]、台湾贪铜菌（Cupriavidus
taiwanensis）[原台湾诺尔斯通菌（Ralstonia taiwanensis）[3]]、
加勒比伯克霍尔德菌（Burkholderia caribensis）[4]、瘤状伯
克 霍 尔德 菌（B. phymatum）[5]、含羞草伯克 霍 尔德 菌（B.
mimosarum）[6]、根瘤伯克霍尔德菌（B. nodosa）[7]和萨比亚伯
克霍尔德菌（B. sabiae）[8]，其中除了菜豆根瘤菌R. etli属于α-
变形杆菌纲外，其他6种较为特殊，隶属于β-变形杆菌纲，因
此对含羞草根瘤分离菌的检测非常重要.
对含羞草根瘤菌的验证已突破了传统的结瘤试验，有研
究者采用菌株特异性引物对23S-5S rRNA基因间隔区（IVS）
进行扩增和序列分析并以此作为分 子标记准确地对含羞草
结瘤菌株进行了检测验证 [9]；也有研究者将绿色荧光蛋白基
因（gfp）转入接种根瘤菌菌株中，直接观察到了根瘤菌对含
羞根部侵染及根瘤形成的全过程 [5, 10~12]. 但是这两种方法均
存在 操作烦 琐、实验 过程较长、不够快 捷的缺 点，仅 适用
于对少数菌株进行标 记研究，对大量菌株进行检测尚存在
不足.
本研究采用全细胞蛋白SDS-PAGE指纹图谱方法对含羞
草根瘤菌进行了结瘤能力的验证，旨在提供一种快速验证根
瘤分离菌是否为根瘤菌的分子标记方法，比上述方法及16S-23S
rRNA基因间隔区（IGS）分析[13~14]、RAPD [15]及AFLP [16]等标记
方法更为简单、快速 [17]，可以满足对大量菌株进行快速检测
的要求.
1 材料与方法
1.1 含羞草根瘤采集及菌株分离
含羞草根瘤采自云南省西双版纳傣族自治州景洪、勐
海、勐腊县及玉溪市的元江县. 采集并剪下健康饱满的根瘤
存入装有变色硅胶的5 mL冻存小管干燥. 干燥的根瘤在分离
之前，于蒸馏水中浸泡复苏过夜后参照Vincent的方法进行分
离[18]，经稀释纯化得到纯培养物后，保存于YMA斜面4 ℃短
期备用，并用15%甘油作为保护剂于－80 ℃超低温冰箱中长
期保藏 [19]. 对结瘤菌株进行分离时，挑选个大、饱满的根瘤，
用上述方法进行分离、纯化及保存.
1.2 种子来源及处理
试验所用含羞草种子采自于云南省西双版纳自治州勐
海县. 种子先用浓硫酸处理5~10 min，再用无菌水漂洗5~10
次，将处理过的种子置于湿润无菌滤纸的培养皿中28 ℃萌
发2 d，待胚根长至0.5~1 cm时即可栽种.
1.3 结瘤试验方法
试验采用水培法，在试管（30 mm×350 mm）内放置约
为1/2试管高度的滤纸使其形成一个可支持含羞草小苗的斜
面，并于试管内装入1/3试管高度的Fahraeus无氮培养液 [20]，
121.3 ℃灭菌30 min，冷却后备用. 将萌发好的含羞草种苗在
菌悬液中浸泡10 min后种于滤纸斜面上，并将 剩余的菌液
浇在种苗周围，每株接种菌株设3个重复，同时设5个不接种
菌液的重复作为对照. 置于人工气候箱中28 ℃，80%湿度，
7 000~8 000 lx每天16 h光照培养；植物生长过程中，视培养
液多少补加无菌水，并注意防止污染，其间观察结瘤情况，
培养40 d后停止培养并收集根瘤.
1.4 SDS-PAGE蛋白指纹图谱检测及聚类分析
将接种菌株及结瘤菌株接种于同一批次的YMA斜面培
养基，28 ℃培养3~4 d后，用10 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）从
斜面上洗下菌体并离心洗涤3次，调节菌体浓度至10 mg L-1，
与2×样品缓冲液[21]按1 : 1混匀后沸水浴20 min，－20 ℃保存
备用. SDS-PAGE为不连续电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓
度15%，上样前先将样品沸水浴10 min，之后迅速上样，起始
电压为80 V，待溴酚兰前沿进入分离胶时加大电压至250 V电
泳7.5 h，按郭尧君的方法进行银染色 [21]，染色结束后将凝胶
短期保存于10%甘油中，并用凝胶成像系统扫描，保存图像以
备分析.
将蛋白图谱条带的有无转换为“1”和“0”，数据输入
M VSP（版本3.1）软件 包中，采用非加权算术平均双 组分
（U P GM A）算法，聚类 生 成蛋白图谱相似性 表 及树状聚
类图.
2 结果与分析
2.1 含羞草根瘤菌分离结果
本研究采用改进的YMA培养基，即将培养基中氮及维
生素B源加大至普通YMA培养基的7.5倍. 共分离获得菌株
177株，根据菌落特征、菌体显微形态及采集地点的差异选
择了40株菌作为接种菌株进行结瘤试验.
2.2 结瘤试验及结瘤菌株的分离
对40株接种菌株 进 行了结 瘤试 验，接种10 d后，观 察
到部 分 含羞草 植物 根部 有瘤状突起；15 d后，根 瘤形成，
随后根瘤逐渐增大；生长40 d后，接种的40株菌中，除菌株
SWF66075和SWF66093未结瘤外，其余菌株全部结瘤，所结
根瘤形 状为椭 球形，颜色为白色 至粉 红色，平均结 瘤个数
2~10个，结瘤率为95%，对照组5个重复均未结瘤，植株矮小，
生长缓慢. 依照1.1的方法对结瘤试验所结根瘤进行了分离，
获得了38株原接种菌株的结瘤菌株.
图1 部分菌株SDS-PAGE蛋白指纹图谱
Fig. 1 SDS-PAGE protein patterns of some related strains
1, SWF65027R; 2, SWF65027T; 3, SWF66001R; 4, SWF66001T; 5,
SWF66074R; 6, SWF66074T; 7, SWF66109R; 8, SWF66109T; 9,
SWF66117R; 10, SWF66117T; M, Marker; 11, SWF66166R; 12, SWF66166T;
13, SWF66174R; 14, SWF66174T; 15; SWF66225R; 16, SWF66225T; 17,
SWF66256R; 18, SWF66256T; 19, SWF66316R; 20, SWF66316T.
菌株名称后“R”为结瘤菌株，“T”为接种菌株 “R” for re-isolated strain,
“T” for original strain. The same below
7215 期 刘晓云等：应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力
2.3 SDS-PAGE蛋白指纹图谱检测及聚类分析结果
经 过 对 结 瘤 菌株与接种菌株 全 细胞可溶性 蛋白SDS-
PAGE指 纹图谱的分型，发现 接种菌株的蛋白图谱类 型共
有17种，其中为a型、b型的菌株数目最多，分别具 有8株、11
株，其余15种图谱类型的菌株较少，数量在1~3株之间；结瘤
菌株的有a、b、c、j、k、n和p共7种. SWF65027、SWF65033、
SWF65044和SWF66001等26株接种菌株的蛋白图谱与其结
瘤菌株的完全相同（部分菌株SDS-PAGE蛋白指纹图谱见图
1），各接种菌株及其结瘤菌株的蛋白图谱类型见图2.
在蛋白图谱聚类树状图（图2）中，这26株菌在100%的
相似水平上与其结瘤菌株聚在一起，表明与含羞草植物形成
根瘤的结瘤菌株与接种菌株为同一菌株，因而验证了它们的
结瘤特性. SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等
12株接种菌株的蛋白图谱与它们的结 瘤菌株差异较大，除
SWF66133与其结瘤菌株的蛋白图谱相似性较高外，其余11株
接种菌株的蛋白图谱与其结瘤菌株的相似性均在50%~70%
之间，在树状图中接种菌株没有在100%的相似性水平上与结
瘤菌株聚在一起，表明这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不
是同一菌株，尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力，因
此这些接种菌株是否为根瘤菌仍需进一步验证.
3 讨 论
采用全细胞蛋白指纹图谱作为分子标记，可以快速、简
单、稳定地对大量结瘤菌株进行鉴定. 在本研究中，从菌株
图2 SDS-PAGE蛋白指纹图谱聚类分析树状图
Fig. 2 Clustering dendrogram of SDS-PAGE protein patterns
722 15 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
的培养到获得SDS-PAGE蛋白指纹图谱仅耗时5~7 d，而且菌
体的收集、洗涤、细胞的破碎等都较为容易. 在相同的培养
条件下，26株接种菌株的蛋白分子图谱类型在100%的相似性
水平上与其结瘤菌株聚群，表明全细胞蛋白SDS-PAGE方法
对含羞草根瘤内分离菌株的鉴定稳定可靠. Liu和Wang等在
进行结瘤菌株检测时，也采用了全细胞蛋白SDS-PAGE指纹
图谱作为分子标记，并且达到了预期结果 [1, 22].
在根瘤菌的结瘤试验中，可能会出现未接种菌株的对照
植物也发生结瘤的现象，排除了外界污染因素后，这通常是
由于植物种子内携带的根瘤菌导致的. 在本研究中结瘤能力
未得到证实的12株接种菌株的蛋白图谱类型与其结瘤菌株
存在差异，它们的结瘤现象可能是由于种子内携带的根瘤菌
引起的. 关于豆科植物种子携带根瘤菌的现象，陈丹明[23]、祁
娟[24]等已有报道.
结瘤能力未得到证实的12株菌，也可能不是根瘤菌. 现
有研究表明，根瘤内分离出的菌株不全都是根瘤菌，从根瘤
内经常分离出属于肠杆菌（Enterobacter）、泛菌（Pantoea）、
埃希氏菌（Escherichia）、假单胞菌（Pseudomonas）、芽孢杆
菌（Bacillus）及土壤杆菌（Agrobacterium）等属群 [1, 25~27]的非
根瘤菌菌株，这些菌株并不是由于分离过程的污染菌所致，
也不是由根瘤衰老腐败引起，它们属于内生菌的范畴，因此
在结瘤试验中不能与原宿主植物结瘤.
此外，接种菌株和植物种子内源根瘤菌间可能存在竞
争结瘤的关系，当接种菌株与种子内源根瘤菌同时存在时，
若接种菌株的结瘤竞争力弱于种子内源根瘤菌，便不能侵入
含羞草植物根部形成根瘤，就会表现出结瘤菌株蛋白图谱与
接种菌株不相同的情况. 试验中具有f型蛋白图谱的接种菌株
SWF66133，其蛋白图谱类型与结瘤菌株不相同，结瘤能力未
能得到确认，而同样具有f型蛋白图谱的菌株SWF66316的结
瘤能力却得到了验证，这说明菌株SWF66133的竞争结瘤能
力可能弱于菌株SWF66316及种子内源根瘤菌.
研究者认为，现今令人信服的根瘤菌验证方法有两类，
除了对结 瘤菌株与原接种菌株进行对比验 证 外，还可以直
接验证菌株的结瘤固氮特性，即对固氮基因(nif )、结瘤基因
（nod）等共生基因进行检测及序列分析 [28]. 在本研究中，尚
有12株菌的结瘤能力未得到结瘤试验的证实，不能据此认为
它们不能与含羞草结瘤，应该进行多次结瘤试验，或直接检
测它们的共生基因并研究其系统发育地位，以判断它们是否
为根瘤菌.
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