全 文 ：　第43卷第12期 原 子 能 科 学 技 术 Vol.43 ,No .12
　2009年12月 Atomic Energy Science and Techno logy Dec.2009
微波诱变选育耐药高效溶磷苜蓿根瘤菌
李剑峰1 , 2 ,张淑卿1 , 2 ,师尚礼1 , 2 , ＊ ,霍平慧1 , 2
(1.甘肃农业大学 草业学院 ,甘肃 兰州　730070;
2.草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:为获得高效溶磷 , 同时具备卡那霉素和青霉素双抗药性的根瘤菌突变株 , 以苜蓿根瘤菌 L-5 为原
始菌株进行微波诱变处理 ,对微波诱变参数进行优化 , 考察突变株的遗传稳定性 、溶磷量和结瘤特性。
经微波(600 W , 30 s)诱变 ,得到 5 株具备较高溶磷能力的双耐药突变株 LW59、LW81 、LW104、LW107、
LW135。多次传代试验证明 , LW107是稳定的高效溶磷双耐药突变株。 突变株 LW107 具备对卡那霉
素 100 mg/ L和青霉素 300 mg/ L 的抗性 , 14 d 的溶磷量达到 16.67 mg/ L , 较原始菌株提高 112.59%,
固氮酶活性高于原始菌株 11.7%。经植株回接试验证明 , 突变株结瘤能力与原始菌株无显著差异。
关键词:根瘤菌;微波诱导;溶磷量
中图分类号:Q936　　　文献标志码:A　　　文章编号:1000-6931(2009)12-1071-06
Screening of Dissolve Phosphorus Rhizobium meliloti
Antibiotic-Resistant Strain Using Microwave Mutagenesis
LI Jian-feng1 , 2 , ZHANG Shu-qing1 , 2 , SHI Shang-li1 , 2 , ＊ , HUO Ping-hui1 , 2
(1.College of Grassland Science , Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070 , China;
2.Key Laboratory o f Grassland Ecosy stem o f Ministry of Education/S ino-U .S .Centers
收稿日期:2009-05-13;修回日期:2009-06-18
基金项目:国家科技支撑项目资助(2007BAD52B06 , 2006BAD04A04 , 2006BAD01A19);农业部行业专项资助项目(nyhyzx07-
022);现代农业产业技术体系建设专项资助项目
作者简介:李剑峰(1979—),男 ,甘肃天水人 ,博士研究生 ,牧草及根瘤菌种质资源研究专业
＊通信作者:师尚礼 ,教授 ,博士生导师 ,从事牧草种质资源研究 , E-m ail:shishl@g sau.edu.cn
f or Grazing Land Ecosy stem Sustainability , Lanz hou 730070 , China)
Abstract:In orde r to obtain highly efficient disso lve pho spho rus Rhizobium meli lot i
st rain w i th tw o antibiotic-resistant , a disso lve pho spho rus rhizobium strain L-5 w as
i rradiated by microw ave.The microw ave mutagenesis parameter s w ere optimized , and
the genetic stability , pho sphate so lubilizing powe r and antibio tic resistance o f the mu-
tant w ere investig ated.Five highly efficient dissolv e phosphorus st rains w ith tw o antibi-
o tic-resistant named LW59 , LW81 , LW104 , LW107 and LW135 w ere obtained through
the microw ave ir radiat ion (600 W , 30 s).In several passage s , a mutant named LW107
wi th steady phospho rus solubilizing capability w as obtained and i t exhibits resistance to
300 mg/L ampicillin and 100 mg/L kanamycin.The pho sphate so lubilizing pow er
reaching 16.67 mg/ L (14 d)and ni t ro genase activi ty are 112.59% and 11.7 %higher
than those o f init ial st rains , respectively .Tw o st rains of the LW107 and L-5 are inocu-
la ted onto the liv e plants and i t is testif ied that nodulation abili ty of them is wi th no sig-
nificant di fferences (P >0.05).
Key words:rhizobium;microwave mutagenesis;pho sphate so lubilization capaci ty
　　在我国 , 74%的耕地土壤缺磷 ,且 95%以
上的磷素为无效态。施入磷化肥的大部分磷素
在土壤中与 Fe2+和 Al3+等结合成闭蓄态难溶
性磷酸盐[ 1] , 积累于土壤不能被植物利用[ 2] 。
解磷菌分泌的有机酸能降低 pH 值 ,与铁 、铝 、
钙等离子结合 ,使吸附态和矿物态的磷素溶解 ,
使植物获得较充足的磷营养[ 3] ,目前已投入应
用的溶磷微生物主要有荧光假单孢菌(Pseud-
omonas f luorescens)[ 4] 和芽孢杆菌(Baci l lus
megaterium)[ 5] 等。张希涛等[ 6] 筛选出的相思
树根瘤菌株 G7-3 和祁娟等[ 7] 分离出的苜蓿根
瘤菌 S L01亦能溶解无机磷。但目前自然状态
下筛选出的溶磷根瘤菌的溶磷能力均较弱 ,采
用菌种诱变法可利用已有菌种资源 ,提高菌种
选育效率 ,弥补野生种解磷能力弱的缺陷。
微波辐照可使微生物细胞壁内外的极性分
子产生电极性振荡[ 8] ,引起 DNA 分子结构变
化 ,电容性结构的细胞膜也易被电击穿而产生
细胞间染色体的交换 ,导致可遗传的变异 ,其优
点是无毒无害 ,操作简便 ,可在短时间内获得大
量的突变体。宋丽等[ 9] 对厌氧产氢菌株 H-8
进行诱变 ,得到的变异株 HW195产氢量比原
始菌提高 50 .7 %。蒲小明等[ 10] 以微波复合诱
变星形孢菌素(S tretomyces sp .)产生菌 ,获得
多次传代后遗传性状稳定 、较原始菌株 H-0 效
价提高了 284 .20%的突变菌株。说明微波诱
导产生的突变菌株具有增产明显 、遗传稳定的
优点;但目前尚未见微波诱变育种技术在溶磷
菌及根瘤菌方面应用的报道。此外 ,在解磷根
瘤菌选育和应用研究中 ,由于土著根瘤菌的竞
争结瘤 ,使目的菌株在定殖 、结瘤和解磷能力测
定方面的试验误差过大。当前测定占瘤率普遍
采用分子标记 、荧光基因标记或农杆菌介导引
入抗药性的方法 ,虽直观精确 ,但昂贵费时 ,且
结果存在一定的不可预见性。这些不利因素对
解磷 、促生根瘤菌的应用和研究造成一定限制 。
本研究拟通过对溶磷苜蓿根瘤菌 L-5进行
微波诱变 ,预期得到溶解无机磷能力强 、具备卡
那霉素和青霉素双抗性的突变菌株 ,从固氮和
溶解难溶性无机磷两个方面提高根瘤菌的促生
能力和应用范围 ,其双抗药特性能够用以跟踪
并研究目标根瘤菌的占瘤率 ,对于解磷根瘤菌
株的开发利用具有重要意义 ,并为根瘤菌株的
定殖和竞争结瘤方面的研究提供物质基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试菌株:原始菌株溶磷苜蓿根瘤菌 L-5
为本实验室从苜蓿根瘤中分离得到 ,经试验 ,初
步确定具有溶解无机磷(Ca3(PO 4)2)的作用 。
培养基:菌种用 YMA 培养基[ 7] 保存活化;
溶磷固体培养基为 PKO(Pikovskava)固体培
养基[ 11] ,液体溶磷培养基为 Pikov skava(磷酸
钙 10 g/L)液体培养基[ 12] 。
1.2　方法
1)处理菌液制备
以活化的 L-5菌株接种于盛有 10 mL 液
体 YMA培养基的试管 ,于 28 ℃、120 r/min下
震荡培养 18 h(菌种对数生长期),离心弃去上
清液 ,沉淀中加入 5 mL 无菌水震荡 ,重复离心
1次 ,最后向沉淀中加无菌水悬浮打匀 ,并稀释
至菌液含菌量约为 1×103 cfu/mL 。
2)微波诱变参数优化
微波诱变处理采用 Hair MD-2480EGC 型
微波炉(2 450 MHz ,最大输入功率 1 200 W ,最
大输出功率 1 050 W)。取制备好的菌液10 mL
于直径为 9 cm 的培养皿内 ,之后放入微波炉
中 ,分别采用 800 、600 、400 W 处理 ,照射时间
分别为 0 、5 、10 、20 、30 、40 、50 、60 、70和 80 s;每
照射 10 s ,在冰上快速冷却 5 s ,以消除热效应
后再照射。取上述各处理菌液 0.2 mL 涂抹于
PKO 固体培养基 ,于 28 ℃下培养 7 d ,记录单
菌落数 、单菌落直径和解磷透明圈直径 ,计算致
死率和正突变率 。
致死率 =(1 -处理后菌落数 /
对照菌落数)×100%
1072 原子能科学技术　　第43卷
正突变率 =(能力提高的突变株数目/
突变株总数)×100%
　　3)高溶磷能力双耐药突变株筛选
经菌株 筛选预 试验发现 , 诱导产 生
300 mg/L青霉素抗性突变菌株的概率低于产
生 80 mg/L 卡那霉素抗性突变菌株的概率 。
为减少得到双抗性菌株所需的工作量 ,故先选
出青霉素 300 mg/L 抗性菌株 ,从中再选出同
时具备 80 mg/L 卡那霉素抗性的突变菌株。
取微波处理后的菌液 0.2 mL 先涂抹于含
氨苄青霉素 300 mg/L 的 YMA 固体培养基 ,
将可良好生长的菌株再接至含80 mg/ L卡那霉
素的 YMA固体培养基 。将在两种含药固体培
养基上均能良好生长的菌株作为双抗性菌株 。
为防止菌株在含药培养基上产生抗药性变异 ,
将选出的双抗性菌株同时接种于含 80 mg/L
卡那霉素和 300 mg/L 氨苄青霉素的 YMA 固
体培养基上进行抗药性复检 ,以在两种含药培
养基上均生长正常的菌株为初筛菌株。
将初筛突变株和原始菌株以 109 cuf/mL
的菌悬液以4 %的接种量接入 Pikovskava无机
磷液体培养基 ,以不接种菌株的培养基作空白
对照 ,于 28 ℃、120 r/min下摇床培养 14 d ,以
测定溶磷量。筛选出溶磷能力强的突变株在
YMA 刚果红培养基上进行培养 ,并在 100 倍
显微镜下进行形态学鉴定 ,选取形态结构和菌
落特征具备苜蓿根瘤菌基本特征 、菌体形态与
野生种一致的菌株作为复筛菌株。
4)突变株遗传稳定性试验
将 5个复筛菌株接种于 YMA 固体培养基
上为第1代 ,于 4 ℃下保存 ,之后 ,间隔36 h ,以
YMA 固体培养基传代 1次 ,接种于 PKO 液体
培养基和含药固体培养基 ,共传代 4次 ,测定每
代菌株的溶磷量及其耐抗生素特性 。
5)溶磷及固氮结瘤能力测定方法
溶磷量测定:将发酵菌液在4 000 r/min下
离心 30 min , 取上清液稀释适当倍数。用
722-E型分光光度计参照鲍士旦[ 13] 的钼锑抗比
色法测定 886 nm 处吸光度值 ,以空白对照作
为参比溶液 ,计算得到的 1 L 上清液中可溶性
磷的量 ,单位为 mg/ L。
菌株结瘤能力:参照陈利云等[ 14] 的方法对
筛选出的菌株和原始菌株以陇东苜蓿进行苜蓿
幼苗的回接 ,每菌株设 4次重复 ,测定各回接植
株处理 50 d时的结瘤率 、单株结瘤数和单株生
物量;突变株及原始菌株对单植株生物量的增
加率为菌液处理植株相对于对照(施入无菌营
养液)处理间的增加量。每处理随机取 4个植
株记录数据 ,并取其平均值 。
固氮酶活性:按照祁娟等[ 15] 的方法用气相
色谱仪(GC-7890 Techcomp F)以乙炔还原法测定
新鲜植株根瘤的固氮酶活性 ,每处理 4次重复。
1.3　数据处理和分析
数据处理采用DPS统计软件和Excel 2003
软件进行统计和分析。
2　结果与分析
2.1　微波照射强度对 L-5诱变效应和致死率
的影响
不同微波照射处理下菌株的致死率和正突
变率示于图 1。致死率随照射功率的增大和时
间的延长而增大 ,正突变率随照射时间的延长
而呈单峰变化趋势;在 800 W 功率照射下 ,菌
图 1　微波照射强度对溶磷根瘤菌诱变效应的影响
F ig.1　Effec t o f microwave ir radiation intensity
on mutagenesis of pho sphate-disso lv ing rhizobia
株的致死率高而正突变率低;在 400 W 功率照
射下 ,致死率和正突变率均低;在 600 W 功率
照射下 ,50 s时的致死率达到 98 .18 %,在 60 s
时全部死亡 。说明溶磷根瘤菌对微波敏感 ,致
死效应明显 ,致死率和正突变率随着照射时间
的增长和照射剂量的累积而提高。当 600 W
功率照射时间达到 30 s 时 ,菌株的致死率为
87 .3%,此时的正突变率达到最大值 14 %,为
最优诱变条件 。照射时间超过 30 s时 ,致死率
持续增大 , 而正突变率却降低 , 这与文献
[ 16-17]的研究结果一致 。在致死率为 84%～
1073第12期　　李剑峰等:微波诱变选育耐药高效溶磷苜蓿根瘤菌
97%时 ,正突变率较高 。在 30 s 时 ,致死率为
91.5 %,正突变率达到最大 ,与 Fincham 等[ 18]
的研究结果也基本一致 ,即分生孢子存活率在
1%～ 10%间突变率最高 。
2.2　诱变结果
1)突变株溶磷能力的变异
在最佳诱变条件 (600 W , 30 s)下对原始
菌株进行微波照射处理 , 分别经含卡那霉素
(100 mg/L)和含青霉素(300 mg/ L)固体培养
基的筛选 ,共选取约 150株对两种抗生素均具
备耐受性的突变株 , 通过进行 PKO 固体和
PKO液体培养基的培养和溶磷量的比较 ,最终
选取 5株溶磷能力较强的菌株(表 1),其中 ,突
变株 LW107溶磷能力最强 ,显著高于对照和
其他突变株(P <0.05),培养 14 d 后在 PKO
液体培养基中的溶磷量和在 PKO 固体培养基
中的 D/d值分别较原始菌株提高了 112 .59 %
和 43.36%;LW135次之 ,溶磷量和 D/d 值分
别较原始菌株提高了 74.1%和 20 .94%。
2)突变株遗传功能稳定性的试验
经人工诱变得到的高效突变菌株遗传基因
不稳定 ,易出现回复突变或产量下降等问题 ,故
需验证其遗传稳定性[ 9] 。本试验测定了 5个突
变株各 4 代菌株的溶磷量和耐药性。结果表
明 ,突变株 LW59 、LW81 、LW104均不稳定 ,溶
磷量逐渐降低(表 2);LW135 溶磷能力较稳
定 ,但失去耐受抗生素的能力。而突变株
LW107稳定性较好 ,每代间溶解难溶性无机磷
的能力差异不明显 ,并在传代 4次后仍保持其
耐药特性 ,其各世代菌株在含刚果红的 YMA
培养基上的菌落呈圆形 、乳白色 、半透明 、边缘
整齐 ,有粘质 ,不吸收色素或吸收色素较少 。菌
体革兰氏染色阴性(G -),镜检为有鞭毛的小杆
菌 ,与原始菌株相同 ,具有根瘤菌典型的形态特
征[ 15] 。证明其遗传性状稳定 ,可选其作为保藏
备用菌株。
2.3　突变株与原始菌株固氮结瘤能力的比较
突变株与原始菌株的性能比较列于表 3 。
从表3可知 ,微波诱变得到的 LW107菌株不仅
具备较高的溶磷能力 ,其固氮能力较原始菌株
亦提高了 11.8 %,差异显著(P<0 .05);其菌液
处理的苜蓿植株结瘤率与原始菌株基本相当 ,
平均结瘤数亦不显著低于原始菌株 ,对生物量
的增加也显著高于原始菌株(P <0 .05)。可
见 ,LW107菌株在提高溶磷能力的同时 ,固氮
结瘤能力亦有所增强 ,说明微波诱导对提高根
瘤菌的固氮能力有明显作用 。通过对突变株与
原始菌株解磷促生能力的比较 ,可证实微波诱
变的效果显著 ,能够迅速高效地得到优良高效 、
性质稳定的根瘤菌突变株 ,这与李宏宇等[ 19] 的
研究结果一致。但微波诱变引起的变异往往是
非定向的 ,不能像基因标记或定向化学药剂诱
变法更易于定位或克隆变异的基因位点 ,因此 ,
需对变异菌株进行细致的筛选和遗传稳定性验
证 ,这是该诱变方法的重要限制。
表 1　复筛高效溶磷菌株的溶磷能力
Table 1　Ability of phosphate-dissolving of mutation second screening
菌株 溶磷圈D/ d值 较原始菌株提高率/ % 溶磷量/(mg· L -1) 较原始菌株提高率/%
原始菌株 1.69±0.06 e 0 7.83±0.09 f 0
LW59 2.11±0.04 b 24.85 11.97±0.17 c 52.75
LW81 1.98±0.03 cd 16.81 9.56±0.07 e 22.04
LW104 1.91±0.04 d 12.68 10.46±0.1 d 33.77
LW107 2.43±0.13 a 43.36 16.67±0.43 a 112.59
LW135 2.05±0.02 b c 20.94 13.64±0.15 b 74.01
　　注:溶磷量的测定数据为 3次重复的平均值 ,表中同列平均值后标注小写字母如不相同 ,表明菌株间差异显著(P<0.05 , LSD
法),下同
1074 原子能科学技术　　第43卷
表 2　突变株不同世代对菌株溶磷量和耐药性的影响
Table 2　Effect of different generations of mutant strain on capacity of phosphate solubilization and antibiotics-resistance
培养代数 菌株溶磷量/(mg· L
-1)
LW59 LW81 LW104 LW107 LW135
抗生素耐药性
LW59 LW81 LW104 LW107 LW135
1 11.97 9.45 10.56 16.72 13.16 ++ ++ ++ ++ ++
2 10.92 8.7 9.63 17.06 13.37 ++ ++ ++ ++ ++
3 9.56 8.1 9.38 16.92 12.75 ++ ++ ++ ++ -
4 8.05 3.33 8.31 16.8 13.19 ++ + ++ ++ -
　　注:“ ++”表示对卡那霉素(100 m g/ L)及青霉素(300 mg/ L)均有抗性 , “ +”表示仅对其中一种有抗性 , “ -”表示均无抗性
表 3　突变株与原始菌株性能比较
Table 3　Character of LW107 compared with initial strain
处理 固氮酶活性/(nm ol · g -1· h -1)
结瘤率/
%
平均结瘤数/
株-1
生物量
增加率/ %
原始菌株 2337.4 b 100 35.33 a 50.66 b
LW107 2612.6 a 100 33.67 a 58.40 a
3　讨论
1)本研究利用 1 株可溶无机磷根瘤菌的
溶磷特性 ,以物理诱变方式增强其溶磷效果 ,使
目的菌株同时具备解磷和固氮结瘤的双重能
力 ,可弥补现有根瘤菌剂效果单一的缺陷 。微
波诱变溶磷根瘤菌的高正突变率产生在
600 W 、30 s 的照射条件下。该条件下的致死
率为 87 .3%,正突变率达 14 %,为最佳诱变条
件。该条件下的选育得到的双耐药突变株
LW107的溶磷能力比原始菌株 L-5 有显著提
高 ,固体和液体 Pikovskava培养基中的溶磷能
力分别提高了 43.36%和 112.59 %,溶磷及耐
抗生素性状能稳定遗传 ,结瘤能力不低于原始
菌株 ,固氮酶活性提高11 .7%。这说明 ,苜蓿根
瘤菌L-5对微波辐射敏感 ,诱变效果较好 。
2)本试验将传统的诱变菌株产生耐药特
性的方法应用于菌株的选育 ,并以两种含药平
板测对植株根瘤进行占瘤率的测定 ,测定出突
变株 LW107的占瘤率为 86.67%,重复间差异
较小 ,说明该占瘤率测定的方法简便可行 。对
于菌剂研制过程中目的菌株的标记和测定有很
好的实用性和可操作性。
3)传统的诱变育种方法包括紫外诱变 、离
子束注入和化学诱变是高产微生物突变株的主
要获得途径 、也是提高微生物工业生产水平的
基本技术手段 。其中 ,紫外照射和化学诱变的
缺陷在于具备一定的危险性 ,对工作人员的健
康易造成危害 ,此外 ,由于基因的诱变点位有
限 ,对同一出发菌株多次反复使用相同方法诱
变处理会出现钝化现象 ,导致正突变类型少而
诱变效果不佳。本试验证明 ,微波诱变高效溶
磷根瘤菌所需的方法易行 ,设备简单而操作安
全 ,诱变效果较好 ,克服了紫外诱变易产生光修
复 、化学诱变毒性大等缺点 ,具有广阔的应用前
景 ,在促生根瘤菌菌种的选育中具有较大的推
广价值 。同时也发现 ,微波诱变选育出的部分
突变株在传代中会产生耐药性的丧失和溶磷能
力的下降 ,因此 ,在对微波诱变株进行筛选时 ,
其主要性状的遗传稳定性验证是必要的。
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1076 原子能科学技术　　第43卷