全 文 ：98 5年第 1 期 华 南 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版
`
)
O JU R N L AO F SO U T H C H I N AN O R M AL U N I VE R SI T Y
N 08 5 9( N AT U R AL SC I E N C E E DI T 1 N 0)
旋扭山绿豆根瘤菌的分离与回接
林德球 黄文芳
提 要
用纯培养方 法 , 从旋扭 山绿豆 ( D e s m o d i u n l i n t o r t u m ) 根瘤中分离获得快
生型和慢 生型菌株 , 经回接试验表明这两种菌株都能使旋扭山绿豆 结 瘤 , 但 结 瘤
数 , 固氮活性及植株生 长都有差异 。
关键词 : 旋扭 山绿豆 , 根瘤 菌 , 固氮 , 根瘤菌接种 。
豆科 植物共生固氮研究中的根瘤菌分离工作 , 从 1 8 8 8年开始 , M . W 。 B` j e r i en k 〔 l 二
成功地分离培养了根瘤中的细菌 , 并证明几用所分离的细菌回接纯培养处理 灭菌种子能产生根
瘤 。 随后 固氮作用在农业上的重要性 , 促使人们对根瘤菌进行广泛研究 。
1 9 7 6年 I之. 八 . D a t e 〔 Z J , 和 1 9 7 7年 P . J . S k e r m a n 仁 3 〕 对旋扭山绿豆根瘤菌进行 研
究 , 但其中的快生型菌株形态和生理特点未见报道 。 我们在 1 9 8 1年从澳大利亚引进旋扭山绿
豆及其慢生型菌株 C B 6 2了。 为了筛选适合本地生长 , 能结瘤 , 固氮效率高 , 使植株生长量明
显增加的根瘤菌株 , 从 1 9 8 2年开始 , 我们对旋扭山绿豆根瘤菌进行分离和回接 , 并从根瘤中
分离了快生型和慢生型菌株 , 从形态和部分生理试验中发现它们之间有差异 。 为了 一证明这两
种菌株确属旋扭山绿豆根瘤菌 , 选典型菌株进行三次重复回接获得成功 , 证实旋扭山绿豆根
瘤菌中存在快生型和慢生型根瘤菌株 。
材料与方法
( 一 ) 分离与培养
选白当年栽种植株根部新鲜浅红色而大粒的旋扭山绿豆根油 , 用 自米水洗净根瘤表 面的
脏物后 , 浸入 75 % 酒精片刻 , 然后用 0 . 1 % H g C I : 进行消毒 , 用无菌水充分漂洗 , 通过无
菌操作将 浪瘤切开 , 取出瘤内鲜红色汁液 , 在琼脂平板培养丝表 向划线 分离 , 同时进行旦自
陈牛肉膏培 养拢检查分离过程消毒是否彻底 。 经 25 “ C一 2 8 “ C培养后 , 用草兰氏染色法 镜 检
是否根瘤菌 。 经一段时间培养 , 再分离提纯 , 用普通光学显微镜和西德 L二 比 公 ,小 一 ; 的相差
显微镜肠观察 。 「( 二 ) 根祖菌的生理生化反应— 石蕊牛乳试验1 . 西决生型 尺。 D 工F 和慢生型 R . D IS 旋扭山绿夏根冶菌株孩八琼脂斜 叫分别 以 ;: 一
米 本工作承莫熙穆教授指导 , 揭志茂同志参加部分拭验的准备工作 , 翘此致谢 。
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4 2小时和扮 8一 7 2小时培养 。 .
. 2制各石蕊牛乳培养基 ( 略 )
3
。 接种 。 把快生型和慢生型旋扭山绿豆根瘤菌分别接种于石 蕊半乳培 养 某 巾 , 置 于
37
O
C温箱内培养 7 天后进行观察 。 另保留一支不接种的石蕊牛乳培养墓作为对照 。
( 三 ) 回接结瘤试验
1
. 供试菌株培养 : 供试菌 R . D IS 和 R . D I F菌株 , 在 R M Y气 R S Y 牛 培 养 基 25 O C一
2 8
O
C培养 一民出菌苔后供感染植物用 。
2
。 回 }妾方法和水培 养液的配制 : 回接试验采用以砂作支持物的水培沙 , 塑料水培盒用
4 % 甲醛液灭菌后 用无菌水清洗 , 再用无菌的纱布穿过塑料盒的两缝 口作吸收营养液用 , 水
培养液采用修改的旁氏植物培养液 。
3
. 种 子提而 灭菌及催芽 : 选择大小均一饱满 、 无伤残的旋扭山绿豆种子 在 0 . 1% 酸 性
l[ ; 1C
: 中灭 i省绪一 6 分钟 , 然后用无菌水充分冲洗后置于培养皿中 , 7。 。 C无苗水浸 种 半 小
11寸。 种子催芽采用培 养皿法 , 于 27 O C遮光条件下催芽 5 天 , 待根长到 5 一 6 m m 时 即 可 接
种 。
、 . 楼种和幼苗的培养条件 : 用无菌水将菌苔配成菌液 , 将发芽的种子县泡在菌液半个
小时 , 然后播人在已高压 灭菌过的旁氏营养液砂培养基中培养 。 侮株加门 悬浊液 ; ; 1n , 对照
加等最的旁氏营养液 。 在玻璃培养室中自然光照 ( 根部需遮光 ) 培养 。 昼代平均派度变化在
2 3
. ` 。 C一 2 6 . 7 “ C之间 。
5
。 根瘤内生菌的形态 观察 : 回接根瘤中菌体形态的光学显微镜和相 笙显微镜观察 , 均
在相 同测试条件下 , 按涂片法进行 。
6
. 根瘤固氮活性和植物生长量测定 : 供试材料来 自培养室 。 川 乙快还 付、法测定根瘤 固
氮活性 。 测试仪器 : 上海 1 0 型气相色谱仪 。 植株生长量以干重重最汀一测定 。
结 果
( 一 ) 根戒菌的一般特性
兮离菌有快生型 R . D I F 06 和 R . D I F 02 , 在平板培养基长出的菌落 , 较 大 、 突 起 , 粘
液多。 慢生型的较小 , 表面平整 , : 直径约 1一 3 m m左右 , 粘液少 。 在不同 培 宁 斜 面 _ l: 好
气 , 生长速度和能否刊用多糖和单搪都有差异 。 分离菌形态慢生型为短杆状 , 不规则排列 ,
着色不均匀 ; · 快生 少吻衫态为履杆状 , 近似球形着色深 , 排列成有规则的线状或链状 ( 见图 一
和图二 ) , 。 革兰氏染色为阴性 , 对 p H值要求不严格 , 在 6 . 5一 7 . 2的范围内均能生长 , 但 在
6
.
7一 6 . 8为好 。 石蕊牛乳试验 , 快生型产酸而慢生型产碱 。
( 二 ) 回接寄主形 成根瘤
用 R . D 丁S和 R 。 D I F菌液分别接种旋扭山绿豆 10 一 20 天即可见小根瘤 , 目毛生型 R . D I F
根瘤筒结瘤慢 , 而慢生型 R . D IS 根瘤菌结瘤快 , 它们之差约为 4 一 5 天 。 每试验组 3 次 重
复能结瘤的苗株结瘤率为 10 % , 不接种对照植株未结瘤 , 生长慢 , 叶黄色 。
( 三 ) 回接根瘤的乙块还原活性
R M Y
、
R S Y均为华中农学院土化系生物固氮研究室培养根瘤菌的常用培养基 。
10 3
用分离菌回接结瘤4 5天后 , 测定根瘤乙炔还原活性 。 旋扭山绿豆慢生型根瘤菌株固氮能
力最高的是 R . D I S o 二 ,为 8 4 . 2 4 n m o l C Z H ` / g · 鲜重加 i n 和 14 . 4 9 n m o l C : H . /株 / m i n 。
而快生型苗株 R . D ; F o 6为 4 s . 5 7 n m o l C Z H 4 / g ` · 鲜重 / m i n 和 6 . 6 5 n m o 1 C : H ` /株 / m i n 测
定结果表明分离菌慢生型的 R . D IS 0 3比快生型 R . D I F 06 具有较高的固氮能力 。 ( 见表一 )
( 四 ) 回接结瘤植株的无氮栽培
回接植株培养巧天后 , 旋扭山绿豆对照植株为。 . 02 克千重 /株 , 而 R . D I S o Z、 03 、 04 、
肠以及 R . D工F 0 6接种株结瘤植株每 株 干 重 分 别为 : 0 . 0 9 3 、 0 . 1 8 2 、 O。 14 、 0 . 15 、 O。 1 2 、
0
.
1 6克 。 平均增重为 0 . 1 2 1克 。 而 R . D I S灯3增重 0 . 1 6 2克 , R . D I F o 6增重为 0 . 1 4克 。 此外 ,
慢生型结瘤植株叶色深绿 , 叶片大 , 叶腋开始分枝 , 生长迅速 ; 快生型结瘤菌 株 生 长 较迟
缓 , 叶色黄 。 ( 见图 3 )
讨 论
1
. 在分离根瘤菌的时候 , 表面消毒会影响分离的根瘤菌的成活 。 一般常用消毒剂的浓
度和消毒时间长短有关 , 因为消毒剂对内部有机物有损害 。 这是分离过程中不可 忽 视 的 因
素 [ 5 · 6 〕 。
2
. 回接结瘤试验植株幼苗培育 是一个关键 , 在未形成根瘤前应加微量的氮 , 使其从种
子营养消耗完到能结瘤固氮的过渡时间有少量氮供应 , 使幼苗能正常生长 , 因为这时幼苗最
容易死亡 。
3
. 试验结果表明 : 经分离选育 的慢生型 R . D ls 和快生型 R . D IF 菌株不 论 从根
启菌体 ( 个体和群体 ) , 形态学方面特征 、 生化反应 、 或从结瘤最早出现时间 、 结瘤数 、 固
氮能力 、 植株生长量等方面都有明显差异 , 证明慢生型 R . D I S o 3菌株是旋扭山绿豆 最 有效
的菌 株 , 而我们分离的快生型菌株究竟是引进澳大利亚旋扭山绿豆慢生型根瘤菌 C B 62 7中变
异的 , 还是我 国本地土壤中具有的 , 仍有待进一步研究探讨 。
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图 1 。 旋扭山绿豆慢生型根瘤菌 ( R肠盆。加 u .
0 . 5 . o d i u . 主o t o时 u . 5 0 2 ) 1 2 5 0 x
不规则排列 , 形状短杆
]
.
0 4
图 2 。 旋扭山绿豆快生型根瘤菌 ( 砚址“ 班二
D . , . 0 目l u m 纽盆o rt 二 r 0 6 ) 1 2 50 x
排列规则 、 球形 、 姐杆状

参考文献
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J
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G e n M l
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I S O L A T IO N O F R手于I Z O B I A O F D E S M O D l l JM I N T O R T U M A N D
P L A N T 一 I N F E C T I O N T E S T S
L i n D e q i u H u a n g w e n f a n g
A b s t r a e t
F a s t a n d s l o w
一
g r o 、 v i n g f o r m s o f R h i z o b i a w e r e o b t a i n e d f r o m t h e
i s o l a t i o n o f r o o t n o d u l e s o f D e s m o d i u m i n t o r t u m b y p u r e e u l t u r e
.
P l a n t
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i n f e e t i o n t e s t s 5 1, o w t ll a t t h e y e a n a l s o d e v e l o p i n t o n o d u l e s o f D e s m o 谈i u m
i n t o r t u m
,
b u t t h e r e a r e d i f f e r e n e e s i n t h e i r a b i l i t y o f n o d u l e f o r m a t i o n
,
i n t h e i r a e e t y l e n e
一 r e d u e i n g a e t i v i t y a n d i n t h e i r g r o w t h s
-
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:
D e s m o d i u m i n t o r t o m
,
R h i z
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,
N i t r o g e n F i x a t i o n ,
I n o e u l a t i o : 1 ( ) f R h i z o b i a
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