全 文 ：中国农业科学 2005, 38(7):1425-1430
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2005-03-02
基金项目：国家转基因植物研究与产业化课题（J2002-B-004）和北京市科委“抗逆地被植物的培育”项目（H020620110130）
作者简介：赵小兰(1968-)，女，湖北宜昌人，副教授，博士研究生，主要从事园林植物生理生态及育种研究。E-mail:xiaolanpeng@163.com。赵梁军
为通讯作者，Tel: 010-62733315; E-mail: zhaolj5073@sina.com.cn


根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇（Rosa multiflora
‘Inermis 4’）的基因表达分析
赵小兰１，3，苏晓华２，田传卫１，赵梁军１
（１中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100094；２中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091；
3湖北民族学院生物科学与技术学院，恩施 445000）

摘要: 多花蔷薇无刺 4号（Rosa multiflora‘Inermis 4’）对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)接种多花蔷薇无刺 4号为目的材料，刺伤处理为对照，采用抑制差减杂交（suppression subtractive
hybridization，SSH）方法，构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减 cDNA 文库。差异筛选差减 cDNA 文
库后，随机选取增强表达的 92个克隆进行测序，去除冗余的 cDNA 和病菌的基因片段，共得到 53 个单一序列。利
用 GenBank 数据库进行核酸和蛋白质同源性比较，获得的 cDNA 片段功能涉及：细胞分裂、生长（22 个克隆），
逆境防御、信号转导及激素调节（11 个克隆）以及初生与次生代谢（10 个克隆）。另有 10 个基因片段功能未知,
可能为新的 EST。根据测序及比对分析结果，对多花蔷薇无刺 4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。
关键词：多花蔷薇（Rosa multiflora）；抑制差减杂交(SSH)；差异筛选；病原菌诱导基因

Analysis of Genes of Rosa multiflora ‘Inermis4’ Expressed in
Response to Agrobacterium tumefaciens Infection
ZHAO Xiao-lan1,3, SU Xiao-hua 2, TIAN Chuan-wei1, ZHAO Liang-jun1
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, China Agricultural University, Beijing 100094; 2Forestry
Research Institute, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091; 3 Biological Science and Technology School, HuBei Institute for
Nationalities, Enshi 445000）

Abstract: Rosa multiflora ‘Inermis 4’ is a crown gall disease resistant ecotype. Suppression subtractive hybridization (SSH)
was utilized to identify the host genes that were differentially expressed in the host-pathogen interactions. In vitro cultured shoots
inoculated with Agrobacterium tumefaciens were used as “tester” and needle pricking shoots as “driver”. Subtractive cDNA library
was constructed, which enriched for resistance-related genes to A. tumefaciens. Ninety-two cDNA clones were sequenced after
differential screening through cDNA macroarray. After removing redundant and bacteria cDNA fragments, 53 unique cDNA clones
were obtained. The putative function of these genes involved in:（1）cell division and growth and chaperones;（2）defense/stress,
signaling, hormone regulation;（3）primary and secondary metabolism. Ten clones were designated as unknowns, these clones had
either substantial similarity to genes with unknown functions, or only low similarity matches to GenBank database sequences.
Furthermore, the probable molecular mechanism of R. multiflora ‘Inermis 4’ resistance to crown gall development was discussed
according to the sequencing and blasting results.
Key words: Rosa multiflora; Suppression subtractive hybridization (SSH); cDNA macroarray; Bacteria-induced genes

月季根癌病是由根癌农杆菌（Agrobacterium
tumefaciens）引起的土传根系病害，具有潜伏侵染和
系统侵染特性。据研究，该病害使月季茎的增粗减少
63%，产量减少 36%，并缩短植株寿命[1]。根癌病病
原菌主要在土壤和植物残体上存活，随苗木传播。近
10年来，中国月季根癌病不断蔓延，造成严重危害[2]。
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有效控制月季根癌病成为中国月季生产及园林应用迫
切需要解决的重要课题。
目前对月季根癌病主要采用放射性土壤杆菌
K-84（A. radiobacter strain 84）进行生物防治，但其
应用有很大的局限性[3]。利用和提高寄主的抗病性便
成为解决月季根癌病的重要途径。筛选和应用月季抗
病砧木和栽培品种在法国、日本有较多研究 [4~6]。但
在中国此方面的研究尚属空白。多花蔷薇原产中国，
是目前月季生产上最广泛使用的砧木种类，但种内各
生态型之间对根癌病的抗性存在很大差异[4~6]。本课题
组大量收集并筛选了蔷薇属种质资源，获得了抗肿瘤
扩展的多花蔷薇无刺 4 号。本研究以多花蔷薇无刺 4
号为研究对象，利用抑制差减杂交技术[7]分离其受根
癌农杆菌侵染诱导表达的基因，探讨其抗肿瘤扩展的
分子机理，并为利用同属或同种植物的抗病相关基因
来提高月季砧木和品种对根癌病的抗性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料培养
1.1.1 供试材料 选取多花蔷薇无刺 4 号生长一致
的当年生幼嫩茎段作外植体，按常规方法进行外植体
表面灭菌，然后置于MS+6-BA 0.70 mg·L-1+GA3 0.04
mg·L-1+3%蔗糖+0.5%琼脂（pH 5.8）的培养基上培养，
培养条件为：温度 25℃，光照 250 µmol·m-2·s-1，光周
期 14 h/10 h。待侧芽萌发至 3～4 cm时处理。
1.1.2 根癌农杆菌培养 供试菌株 J-5-1从月季品种
金玛丽的天然根部肿瘤中分离。该菌株经过 PCR 检
测、MW选择性培养基培养及接种根癌病指示植物向
日葵证实其为致病性的根癌农杆菌。菌体在 YEB固体
斜面培养基上于 28℃活化培养 3 d后用于接种。
1.2 材料处理
用解剖针蘸取菌苔针刺新萌发的侧芽 4次作为接
种处理，对照则不蘸菌苔做刺伤处理。处理 3、7、14
d后取侧芽，液氮中速冻，置于-80℃冰箱中保存备用。
1.3 抑制差减杂交
总 RNA提取基本按照 Qiagen 的 RNAeasy Plant
Mini Kit的说明进行，并略作改进；各时期总 RNA等
量混合后进行 mRNA 纯化，纯化步骤按照 Clontech
的 NucleoTrap® Nucleic Acid Purification Kits 的使用
说明进行。正反向抑制差减杂交按照 Clontech 的
PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kits 的使用说明进
行。正向差减杂交时接种处理的 cDNA作为目的材料，
针刺处理的 cDNA为对照，而在反向差减杂交时目的
材料和对照互换。差减杂交后 2%琼脂糖凝胶电泳检
测正、反向差减 cDNA片段的二次 PCR产物。
1.4 应用 T/A 克隆法构建正、反向差减文库
取正、反向差减杂交 cDNA片段的二次 PCR产物
各 3 µl连接到 Promega的 pGEM-T Easy载体上，4℃
过夜。连接产物转化感受态DH5α，在涂有 IPTG/X-gal
的 LB(添加 50 µg·ml-1氨苄青霉素)的平板上，37℃避
光恒温培养 12～16 h，从平板上挑取白色克隆（重组
子），用 96 孔细胞培养板 37℃摇菌过夜，建立正、
反向抑制差减 cDNA文库。
1.5 差异筛选差减文库
以巢式引物 1（5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCA
GGT-3′）和巢式引物 2R（5′-AGCGTGGTCGCGGCCG
AGGT-3′）为 PCR引物，扩增条件为 95℃变性 3 min
后，94℃，10 s；68℃，3 min，28个循环。PCR产物
用 2%琼脂糖凝胶电泳检测。取 PCR产物 2.5 µl点 2
套重复拷贝膜。
用生物素标记 2 个不同探针，即正向差减 cDNA
片段和反向差减 cDNA片段的第二次 PCR产物。用 2
个探针分别与抑制差减 cDNA文库的 2套重复拷贝膜
杂交，杂交和洗膜均按照 AMERSHAM PHARMACIA
BIOTECH 公司的 direct nucleic acid labeling and
detection systems RPN 3000的说明书进行。杂交结果
分析和差异筛选克隆分类，依照 Clontech 公司的
PCR-Select Differential Screening Kit说明书进行。
1.6 DNA 测序与序列分析
随机选取增强表达的 92个重组克隆，由上海联合
基因科技有限公司以 T7 和 M13R 为引物在自动测序
仪测序，测序得到的 cDNA片段与 NCBI的 GenBank
数据库进行核苷酸和蛋白质同源性比较和功能分析。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 和 mRNA 的检测
采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的总 RNA，其
28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA完整
性好；进一步采用 Beckman 公司的 DU800 型紫外分
光光度仪检测 OD260/OD280的比值为 1.9～2.0，说明总
RNA 纯度高。纯化后的 mRNA 经琼脂糖凝胶电泳呈
现弥散条带，无 18S和 28S rRNA带型特征，表明分
离得到的 mRNA质量满足 cDNA合成要求。
2.2 抑制差减杂交后二次 PCR 产物分析
抑制差减杂交后，用 2.0％琼脂糖电泳分析二次
PCR产物。从图 1可知，正、反向差减杂交后的 cDNA
7期 赵小兰等：根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇（Rosa multiflora‘Inermis 4’）的基因表达分析 1427


M. DL2000 DNA marker ; 1. 反向差减杂交后二次 PCR产物；2. 正向差
减杂交后二次 PCR产物
M. DL2000 DNA Marker; 1. Secondary PCR product for reverse-subtracted
cDNA fragments；2. Secondary PCR product for forward-subtracted cDNA
fragments

图 1 抑制差减杂交后 cDNA 片段二次 PCR 产物
Fig. 1 The patterns of second PCR products from the subtracted
cDNA fragments

弥散条带分布在 0.2～1.0 kb，无清晰条带出现，但在
0.3～0.5 kb处最亮，表明差减杂交后富集的 cDNA片
段大小集中分布于 0.3～0.5 kb处，符合差减杂交后的
规律。
2.3 差减 cDNA 文库的构建及阳性克隆的筛选
应用 T/A克隆法，共获得约 2 000个正、反向差
减片段的重组克隆，随机挑选重组子进行 PCR扩增，
结果表明连接、转化效果较好（图 2）。
采用随机引物法标记 2个探针，分别与 2套 cDNA
拷贝膜杂交（图 3），选取：（1）与正向差减的探针
有杂交信号，与反向差减的探针不能杂交；（2）与正
向、反向的差减探针均杂交，但与正向差减探针的杂
交信号强度高于 5倍的克隆，作为特异或增强表达基
因的候选克隆，对其中的 92个克隆进行了DNA测序。
2.4 多花蔷薇无刺 4 号受根癌农杆菌侵染诱导的
cDNA 片段功能推测
对 92 个克隆测序并去除冗余序列和病原菌的基
因片段之后，共获得多花蔷薇无刺 4号受病原菌胁迫
诱导的 cDNA 片段 53 个。测序得到的基因片段推导
的编码蛋白与GenBank中蛋白质数据库的同源性比对
结果见表。
根据同源比对结果，多花蔷薇无刺 4号受根癌农
杆菌胁迫诱导表达的 cDNA片段可能的功能可以分为
3 类：第一类，与细胞分裂、生长相关。编码核糖体
蛋白、组蛋白、锌指蛋白家族、起始、延伸及剪接因
子、伴侣蛋白等，这一类共包含 22个克隆；第二类，



M. DL2000 DNA marker; 1~13. 随机挑取的克隆
M. DL2000 DNA marker；1–13. Random picked clones of the subtracted
cDNA library

图 2 差减 cDNA 文库外源插入片段检测
Fig. 2 Identification of the inserted fragments of the subtracted
cDNA library

A.正向差减探针 Forward- subtracted cDNA probes B.反向差减探针 Reverse- subtracted cDNA probes

图 3 正向差减 cDNA 文库的差异筛选
Fig. 3 Differential screening for the forward-subtracted cDNA library
1428 中 国 农 业 科 学 38卷
表 多花蔷薇受根癌农杆菌胁迫诱导表达的 cDNA 片段在 GenBank 中同源比对结果
Table Homologies of positive cDNA fragments induced by the A. tumefaciens to sequences in the Genbank protein databases
SSH 片段
SSH
fragments
长度
Length(bp)
同源功能蛋白
Homologies of the cDNA fragments blasted with the protein database in the GenBank
同源性
Identities
(aa/aa)
Blastx E值
E- value
RMA12 279 Coatomer alpha subunit-like protein ( Lotus corniculatus var. japonicus) 81/92 (88%) 2e-41
RMA25 530 Cs DnaJ-1 (Cucumis sativus) 47/49 (95%) 1e-31
RMA26 329 Putative drought-induced protein RDI( Oryza sativa [japonica cultivar-group]) 63/107 (58%) 2e-25
RMA30 462 Hypothetical protein (Arabidopsis thaliana) 59/92(64%) 7e-31
RMA34 517 Hsp90-like protein 58/107(54%) 2e-29
RMA38 511 Putative iron inhibited ABC transporter 2 (Oryza sativa [ japonica cultivar-group]) 98/108(90%) 1e-53
RMA45 419 Hypothetical protein (Arabidopsis thaliana) 76/125(60%) 1e-33
RMA49 620 Unknown (Arabidopsis thaliana) 49/131(37%) 8e-11
RMA51 359 Elongation factor 1-alpha (Arabidopsis thaliana) 83/84(98%) 9e-42
RMA52 503 Methionine synthase (Arabidopsis thaliana) 131/156 (84%) 2e-70
RMA63 435 Putative splicing factor (Arabidopsis thaliana) 96/126(76%) 8e-60
RMA73 602 Glutathione S-transferase (Capsicum chinense) 64/80(80%) 2e-57
RMA79 322 Hypothetical protein (Arabidopsis thaliana) 19/24(79%) 1e-08
RMB1 420 40S ribosomal protein (Prunus armeniaca) 44/67(65%) 2e-13
RMB3 576 Putative cytochrome p450 (Arabidopsis thaliana) 61/158(38%) 9e-09
RMB10 443 Putative DNA binding protein ACBF (Arabidopsis thaliana) 113/138 (82%) 8e-54
RMB23 139 Mevalonate diphosphate decarboxylase (Hevea brasiliensis) 38/44(86%) 5e-14
RMB32 635 Dead box RNA helicase (Pisum sativum) 145/147(98%) 1e-61
RMB34 297 Zinc finger (C3HC4-type RING finger) family protein (Arabidopsis thaliana) 45/58(77%) 2e-23
RMB35 555 Ubiquitin extension protein (Pyrus communis) 70/70(100%) e-177
RMB39 406 Putative protein (Arabidopsis thaliana) 53/58(91%) 7e-23
RMB42 406 Putative DnaJ protein (Arabidopsis thaliana) 72/130(55%) 3e-52
RMB67 265 Nodulin-like protein (Arabidopsis thaliana) 55/87(63%) 2e-22
RMB73 232 Ubiquitin conjugating enzyme E2 (Arabidopsis thaliana) 74/75(99%) 7e-53
RMB75 756 Putative galactosyltransferase (Fortunella hindsii) 121/152(79%) 9e-19
RMB86 421 Hydroxycinnamoyl transferase (Nicotiana tabacum) 58/68(85%) 3e-16
RMB87 543 AP2 domain containing protein (Prunus armeniaca)
OR:ethylene responsive element binding protein (Fagus sylvatica)
92/143(64%)
76/112(68%)
3e-40
8e-28
RMB92 248 Putative T-- complex protein (Oryza sativa [japonica cultivar-group] ) 45/47(95%) 4e-17
RMC4 276 S-like RNase (Antirrhinum majus ×Antirrhinum hispanicum) 68/90(75%) 4e-31
RMC74 262 Nearly identical to rice water stress induced protein (Arabidopsis thaliana) 29/53(54%) 7e-11
RMC78 413 Spla/RYanodine receptor (SPRY) domain- containing protein (Arabidopsis thaliana) 101/132(73%) 1e-30
RMD30 468 Stress-inducible histone H1 variant (Lycopersicon chilense) 36/59(61%) 5e-12
RMD42 526 Unknown
RMD46 185 Unknown
RMD48 546 Alpha-expansin (Prunus cerasus) 39/78(50%) 2e-10
RMD49 636 Ubiquitin fusion protein (Pyrus pyrifolia) 37/49(75%) 2e-10
RMD51 154 40S ribosomal protein (Capsicum annuum) 32/51(59%) 9e-05
RMD53 227 Protein for chloroplast differentiation and palisade development (Arabidopsis thaliana) 39/55(70%) 5e-14
RMD54 507 Leucine zipper-containing protein (Euphorbia esula) 72/80(90%) 2e-37
RMD63 227 Ribonuclease-like PR-10b (Malus×domestica) 27/32(84%) 3e-06
RMD79 620 Putative CuZn-superoxide dismutase (Populus tremula ×Populuss tremuloides) 109/146(74%) 2e-59
RME14 397 Ferrous ion membrane transport protein DMT1 (DMT1) ( Glycine max) 109/131(83%) 2e-29
RME17 560 Major latex-like protein (Prunus persica) OR:Bet v I allergen family protein
(Arabidopsis thaliana)
105/153(68%)
80/146(54%)
2e-60
2e-44
RME39 181 Unknown
RME41 436 L3 Ribosomal protein (Medicago sativa) 135/145(92%) 1e-73
RME77 210 Putative cinnamoyl-CoA reductase (CCR) (Prunus avium) 33/39(84%) 2e-13
RME82 269 Chlorophyll a/b-binding protein type Ι (Malus×domestica) 73/78(93%) 5e-57
RME84 533 DnaJ protein (Hevea brasiliensis) 48/69(69%) 1e-50
RME92 510 Unknown
RMF13 328 Zinc finger family protein(Arabidopsis thaliana) 31/44(70%) 6e-08
RMF25 271 Unknown
RMF30 245 Rubisco activase (Zantedeschia aethiopica) 45/78(57%) 1e-08
RMF68 532 Cell wall invertase (Fragaria ×ananassa) 33/38(66%) 7e-10
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与胁迫诱导、信号传导及激素调节相关。编码与信号
传导相关的受体类似激酶、离子膜转运蛋白及结瘤类
似蛋白，与胁迫相关的有谷胱甘肽-S-转移酶、带亮氨
酸拉链的蛋白、CuZn-SOD、干旱诱导蛋白及 BetVI
过敏蛋白家族，与激素作用相关的乙烯响应元件结合
蛋白，共 11个克隆；第三类，初生与次生代谢相关。
编码 Rubisco活化酶、细胞色素蛋白 p450、甲羟戊酸
二磷酸脱羧酶、甲硫氨酸合酶、羟基肉桂酰 CoA转移
酶和肉桂酰 CoA还原酶（CCR）等，共 10个克隆。
另有 10 个克隆在 GenBank 中的高度同源序列编码功
能未知蛋白，或是没有查到对应的同源序列，为功能
未知序列。
3 讨论
3.1 SSH技术巧妙利用了抑制 PCR扩增技术，既使
差异表达基因达到了均一化目的，同时 2 次选择性
PCR扩增能够使高低丰度的差异表达片段都能得到有
效富集。结合Macroarray筛选极大地降低了假阳性，
通过一次差减杂交通常可以筛选到几十个到上百个真
正差异表达的基因片段，因而该方法广泛应用于基因
的差异表达分析[8~10]。
3.2 本研究中得到 22个差异表达 cDNA片段与细胞
分裂、生长相关，这与根癌病特殊的致病机理有关。
植物根癌病的发生是一个天然的植物基因工程——根
癌农杆菌将 Ti质粒上的 T-DNA转移到植物细胞中，
T-DNA上的 iaaM、iaaH和 ipt三个基因分别编码植物
激素合成酶，T-DNA与植物核基因组整合后引起植物
细胞分裂素和生长素的过量产生，导致细胞不正常增
生，从而引起肿瘤[11]。核糖体蛋白、组蛋白、起始因
子 eIF4A等可以显著改变转录和翻译的模式和数量来
适应各种胁迫。分子伴侣为细胞中蛋白质的正确折叠
所必需。植物中大多数短命蛋白和异常蛋白的降解是
由泛素途径来完成的，因而泛素既在植物适应胁迫过
程中起重要作用，也能调控细胞周期和激素作用[12]。
3.3 近年来的研究表明，除了细胞分裂素和生长素之
外，乙烯、脱落酸、茉莉酸等激素在植物肿瘤形成中
也起着重要作用[13,14]。生长素、乙烯的大量释放促进
肿瘤组织中分化出发达的维管组织，而且在功能上与
寄主组织的维管束相连，使得寄主大量的水分及营养
元素能优先供应肿瘤组织，以促进其快速增长[15~17]。
本试验分离的第二类 cDNA克隆即与胁迫应答、信号
传导、激素调节有关。如：干旱诱导蛋白是肿瘤组织
防止过度失水的积极应答；谷胱甘肽-S-转移酶是在逆
境条件下表达的生长素结合蛋白的一种，可能参与生
长素的解毒作用，并受各种胁迫所诱导；亮氨酸拉链
是目前分离到的LZ-NBS-LRR类型抗病基因中的一个
保守域；CuZn-SOD 产生是先天的细胞保护机制。分
离到的结瘤蛋白基因可能暗示着植物与近缘微生物的
互作有相似性。
3.4 第三类 cDNA 克隆与编码一些初生和次生代谢
中的关键酶基因高度同源。如甲硫氨酸合酶。甲硫氨
酸不仅在蛋白质合成中具有重要地位，还能通过与 S-
腺苷甲硫氨酸的相互转化为DNA和RNA的甲基化修
饰提供甲基，同时其甲硫氨酸骨架也是乙烯和多胺的
前体。羟基肉桂酰 CoA 转移酶、肉桂酰 CoA 还原酶
（CCR）都是次生代谢途径中的关键酶。这些结果表
明，多花蔷薇对根癌农杆菌胁迫应答过程中激活了次
生代谢途径。
3.5 Ditt等[18]利用 cDNA-AFLP技术比较了藿香蓟的
悬浮细胞对‘卸甲’根癌农杆菌和大肠杆菌的基因应
答后发现，两者在多数防卫基因的表达上有共同的模
式，只有 nodulin基因的表达受根癌农杆菌特异诱导。
Veena等[19]研究发现，‘卸甲’根癌农杆菌 T-DNA和
Vir 基因向植物细胞的转移和整合激活了与 DNA 复
制、重组、修复相关的大量基因，而抑制了寄主防卫
基因的表达。本研究以野生型根癌农杆菌毒性菌株侵
染多花蔷薇无刺 4号的离体嫩梢，试验结果表明，从
DNA的转录、翻译的调控、防御激活的次生代谢途径、
锌指蛋白、离子通道及受体类似激酶等信号分子的调
控作用、与其它逆境共享的防御网络等，可能与根癌
病抗性都有关联。下一步的工作将对可能在根癌病抗
性中起重要作用的基因片段进行 Northern 表达验证、
克隆全长以及转基因功能验证，多花蔷薇的再生体系
也正在建立中。
4 结论
本研究采用了目前分析基因差异表达的有效方法
——抑制差减杂交技术建立了多花蔷薇无刺４号受根
癌农杆菌毒性菌株侵染后的正、反向差减杂交文库。
通过Macroarray差异筛选分离到寄主受病原菌诱导差
异表达的 cDNA片段。
对随机测序结果分析表明，多花蔷薇无刺４号对
根癌病的抗性与多个途径有关。既涉及到 DNA转录、
翻译等过程，也与次生代谢途径的激活、信号分子的
调控作用、与其它逆境共享的防御体系、抗病基因的
参与等相关。
1430 中 国 农 业 科 学 38卷
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(责任编辑 曲来娥)