全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 965−971 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(301705760); 国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项(2002AA207004); 陕西省 13115科技创新工程重大科技
专项(2007ZDKG-02); 国家杨凌农业生物技术育种中心专项基金项目(99-1A): 西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目
作者简介: 李红霞(1980−), 女, 新疆伊犁人, 在读博士, 主要从事小麦雄性不育机制研究。
*
通讯作者(Corresponding author): 张改生(1951–), 男, 教授, 博士生导师。E-mail: zhanggsh@public.xa.sn.cn
Received(收稿日期): 2007-12-04; Accepted(接受日期): 2008-01-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00965
黏类小麦育性相关基因 SSH文库的构建
李红霞 张龙雨 张改生* 牛 娜 朱展望
(西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 / 小麦育种教育部工程研究中心, 陕西杨凌 712100)
摘 要: 为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的
cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育 cDNA文库中随机挑选 120个阳性克
隆进行测序, 获得 100 余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行 BLAST 比对及功能注释, 比较了不育和可育
cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育 cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育 cDNA文库中检测到
了与花发育调控相关的 MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸
化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。
关键词: 小麦; 育性基因; 抑制差减杂交(SSH); 表达序列标签(EST)
Construction on cDNA Library from Fertility-Related Genes of Male
Sterile Wheat with Aegilops kotschyi Cytoplasm by SSH
LI Hong-Xia, ZHANG Long-Yu, ZHANG Gai-Sheng*, NIU Na, and ZHU Zhan-Wang
(Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Northwest A & F University / Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of
Education, Yangling 712100, Shaanxi, China)
Abstract: Male sterility with Aegilops kotschyi cytoplasm has a great application potential in hybrid wheat (Triticum aestivum L.)
breeding for its stable sterility and broad-spectrum of restoring gene resources. To further reveal the genetic mechanism of male
sterility with Aegilops kotschyi cytoplasm, a male sterile line ms (Kots)-90-110(A) and its near isogenic line BC4F1 (fertility re-
stored by rk5451) were employed to construct sterility and fertility cDNA libraries by suppression subtractive hybridization (SSH).
Wheat anthers with pollen mother cells at dikaryophase were sampled for RNA extraction via microscopic examination. The two
cDNA libraries were evaluated to be of good quality with high efficiency of SSH. Total 120 positive clones were randomly se-
lected and sequenced from the 2 libraries, and 100 high quality sequences were obtained. According to BLAST screening and
functional annotation, energy-related genes were identified with high frequencies in fertility cDNA library, while MADS-box
transcriptional factor TaAGL7, ubiquitin-conjugating enzyme, and adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase were detected
in sterility cDNA library. The MADS-box transcription factor TaAGL7 plays important roles in regulating flower development.
Immature spike ubiquitin-conjugating enzyme is likely to relate to apoptosis. The expression of adenosine diphosphate glucose
pyrophosphatase directely affectes starch synthase and normal supply of energy. The genes detected in our study are probably
important in fertility of wheat with Aegilops kotschyi cytoplasm.
Keywords: Wheat; Sterility gene; Suppression subtractive hybridization (SSH); Expressed sequence tag (EST)
黏类小麦雄性不育系指小麦黏型(K型)和偏型(Ven
型)等一类既易保持又易恢复, 且种子饱满、保持系
与恢复系来源都分布在普通小麦推广品种(系)内的
小麦雄性不育系的总称。大量研究表明, 黏类小麦
细胞质雄性不育(CMS)系是应用潜力理想的不育类
型[1]。对黏类小麦雄性不育系细胞质效应、育性恢
复性及雌雄配子传递方式等的研究证实, 黏类小麦
细胞质雄性不育系育性基因单一, 不育性彻底, 易
966 作 物 学 报 第 34卷

恢复性高, 为小麦雄性不育研究和杂种优势利用提
供了极有利的材料基础[2-3]。
抑制差减杂交(suppression subtractive hybridi-
zation, SSH)技术[4]是一种简单、有效的产生高度富
集的差异表达基因 ,并从中获得低丰度稀有基因的
方法, 与 DDRT-PCR和 RDA相比, 具有速度快、效
率高、敏感度高、假阳性率低等优点。利用这一技
术, 常青山等 [5]鉴定了太谷核不育小麦败育过程的
特异表达基因, 发现 87.5%的克隆在不育花药和可
育花药之间存在表达差异; 张政值等 [6]研究了小麦
显性雄性不育基因 Ms2近等基因系小穗和花药中的
基因表达差异, 结果显示接近 90%的克隆在不育小
穗中呈上调表达, 同源性比较发现, 所获得的 EST
参与碳代谢活动、胞内分子运输、染色体的构成及
染色体的结构变化等多种过程。
黏类小麦细胞质雄性不育系 ms(Kots)-90-110(A)
及近等基因系BC4F1, 由本实验室选育, 其细胞质背
景为黏果山羊草(Aegilops kotschyi)细胞质, 细胞学
和表型综合考察表明二者除育性上分可育和不育外,
在其他遗传背景和农艺性状上没有差别 , 是研究
ms(Kots)-90-110(A)不育机制的良好材料。本研究利
用上述材料, 以 SSH 技术分别构建了不育和可育条
件下基因特异表达的抑制差减杂交 cDNA 文库, 通
过对两个 cDNA文库的克隆测序、EST序列 BLASTx
分析, 探讨了黏类小麦细胞质雄性不育系在不育和
可育条件下表达基因的种类、功能和参与相关生化
代谢途径的异同, 以探索黏类小麦细胞质雄性不育
的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理
黏类小麦细胞质雄性不育系 ms(Kots)-90-110(A)
及其恢复系 rk5451(R)均由本实验室保存。以
ms(Kots)-90-110 为母本, 与 rk5451 杂交, 首先将恢
复系的核内恢复基因导入不育系, 使育性得以恢复;
然后在后代中筛选其他农艺性状与不育系
ms(Kots)-90-110 相同, 但为可育的植株作父本, 与
不育系连续回交 4代, 获得 BC4F1。对该 BC4F1群体
进行花药观察 , 发现花药饱满 , 药室增大; 对其花
粉细胞发育阶段的观察表明, 花粉发育、减数分裂均
表现正常, 能够形成正常花粉粒。因此, 用于本研究的
不育系ms(Kots)-90-110与其近等基因系BC4F1除了在
育性上有差别以外, 其他遗传背景基本一致。
所有试验材料按正常秋播种植在西北农林科技
大学农场试验田, 第 2 年 4 月初借助镜检取花粉母
细胞处于双核期的幼穗, 剥取花药后迅速投入液氮
中, 置−80℃冰箱中保存备用。
1.2 小麦花药总 RNA提取与 mRNA的分离、纯
化
取 50~100 mg花药于液氮中研磨, 加入 BIOZOI
缓冲液 1.0 mL, 然后采用 BIOZOI试剂盒(杭州博日
科技有限公司 ), 按其说明书的方法提取花药总
RNA。将总 RNA 溶于 DEPC-H2O, 用 DNaseⅠ
(TaKaRa 公司, 大连) 37℃处理 30 min, 抽提纯化
RNA。用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA完整
性, 核酸蛋白检测仪检测总 RNA的浓度及纯度。利
用 Oligotex mRNA Spin-Column Kit (QIAGEN公司,
荷兰), 从总 RNA中分离 mRNA。用 3 mol L−1 NaAc
和无水乙醇浓缩纯化的 mRNA, 以此作为构建 SSH
文库的起始材料。
1.3 SSH与 SSH cDNA文库的构建
依照 PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech
公司, 美国)的说明书进行 SSH操作。以不育系的花
药为检测子(tester)、BC4F1花药为驱动子(driver), 构
建不育条件下特异表达基因的 cDNA 文库 ; 以
BC4F1花药为检测子(tester)、不育系的花药为驱动子
(driver)构建可育条件下特异表达基因的 cDNA 文
库。SSH 产物经过纯化和浓缩与 PMD18-Vector
(TaKaRa公司, 大连)载体连接,形成质粒文库。连接
产物转化感受态细胞 DH5α, 涂于含有 Amp/X2gal/
IPTG 的 LB 培养基上, 挑取白色克隆, 利用 M13
引物检测目的片段的插入情况 , 构成相应的 SSH
文库。
1.4 序列测定和 BLAST分析
挑选阳性克隆送上海生物工程公司进行测序。
所获序列去除载体和接头序列 , 获得 EST。采用
NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) 的 BIASTx 在线序
列比对工具, 对非冗余蛋白质数据库进行同源性检
索分析 ; 对功能未知的 EST, 再利用 NCBI 的
BLASTn 在线序列比对工具, 对 GenBank 的非冗余
核酸数据库和 EST数据库进行同源性检索分析和功
能注释分析[7-9]。
2 结果与分析
2.1 小麦花药总 RNA质量检测
琼脂糖凝胶电泳显示, 花药总RNA中的28S rRNA
第 6期 李红霞等: 黏类小麦育性相关基因 SSH文库的构建 967


与 18S rRNA的亮度比例约为 2 1, ∶ 经核酸蛋白检测
仪检测, A260/280值为 1.8~2.0, A260/230值大于 2.0。表明所
制备的总 RNA质量较好, 达到建库要求(图 1)。

图 1 小麦花药 RNA的电泳检测
Fig. 1 Detection of total wheat anther RNA
S: ms (Kots)-90-110(A); F: BC4F1.

2.2 SSH cDNA文库的评价
差减效率是 SSH 技术的关键, 以与接头 1 和接
头 2 的外侧相同序列为引物进行第 1 次 PCR 扩增,
结果显示电泳带很弱, 表明 2 次杂交效率很高。将
第 1次 PCR产物稀释 10倍后, 取 1 μL作为模板, 利
用接头 1 和接头 2 内侧不同序列为巢式引物进行第
2 次 PCR 扩增。经检测可以看到电泳条带明显, 差
减后电泳条带亮度比未差减弱 , 而且特异性增强 ,
片段大小集中在 200~1 000 bp, 证明酶切、连接效率
较好, 抑制差减杂交效率较高(图 2) 。

图 2 巢式 PCR扩增产物
Fig. 2 Analysis of subtracted products after second round PCR
1: 差减后的扩增产物; 2: 未差减的扩增产物; 3: 对照; M: DL2000。
1: 2nd round PCR products of subtracted tester cDNA; 2: 2nd round
PCR products of unsubtracted tester cDNA; 3: control; M: DL2000.
2.3 差异表达 cDNA的 PCR产物检测
对随机挑取的克隆进行 PCR检测, 结果 90%以
上的克隆皆能扩增出有效产物, 其大小为 250~750
bp, 多数在 500 bp 左右, 除去引物与所加接头的长
度 , 实际插入的育性相关表达 cDNA 片段大小在
400 bp左右(图 3)。

图 3 插入片段的 PCR检测
Fig. 3 Electrophoresis pattern of PCR products amplified
from inserted fragments
M: DL2000; 1~12: 单克隆菌落 PCR产物。
M: DL2000; 1–12: PCR product of single clone.

2.4 EST测序分析
2.4.1 不育条件下的 ESTs 序列的功能分析 从
不育的 SSH-cDNA 文库中随机挑取 60 个阳性克隆
进行测序, 所获 EST 中最短的 169 bp, 最长的 732
bp, 去除低质量序列及重复序列后, 共获得 51 条
EST。利用 BIASTx 同 GenBank 的非冗余蛋白质数
据库进行同源性检索分析发现, 51条 EST中 30条功
能已知 , 占全部 EST 的 58.82%; 在 EST 序列
BIASTx比对结果基础上, 利用 AmiGO和 QuickGO
浏览器, 根据 GO (gene ontology) 数据库对 30 条
EST 进行功能注释, 发现参与蛋白质修饰/加工/储
藏的最多, 占 17.65%, 其次为参与蛋白质合成和信
号转导的, 占 12.65%, 部分同源比较结果见表 1。在
功能已知的 EST序列中得到可能与小麦雄性不育紧
密相关的基因, 如与花粉粒发育和萌发有关的肌动
蛋白的调控蛋白(probable protein BRICK1)和细胞骨
架组成的微管蛋白(tubulin alpha chain), 与细胞凋亡
相关的泛素结合酶(immature spike ubiquitin-conj-
ugating enzyme)、参与花发育调控的 MADS-box 转
录因子(MADS-box transcription factor TaAGL7)及阻
遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶
(adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase)。大
多数 EST同源于麦属、水稻等。
2.4.2 可育条件下的 EST序列的功能分析 从可
育的 SSH-cDNA 文库中随机挑取 60 个阳性克隆进
行测序, 所获 EST中最短的 197 bp, 最长的 969 bp,
去除低质量序列及重复序列后, 共获得 49条 EST。
968 作 物 学 报 第 34卷

表 1 不育库中的 EST与 GenBank功能已知基因同源性比较(BLASTx)
Table 1 Similarity analysis (BLASTx) of male sterility library EST with the function identified genes in GenBank
克隆编号
Sample No.
长度
Length (bp)
可能基因
Putative identification
种属
Organism
一致性
Identity (%)
E值
E-value
S050 653 ribosomal protein L7 Triticum aestivum 99 2.00E-47
S027 362 60S ribosomal protein L2, putative, expressed Oryza sativa 96 6.00E-56
S101 384 large subunit ribosomal protein 2 Pristionchus uniformis 68 5.00E-38
S146 383 flavonoid O-methyltransferase Triticum aestivum 95 3.00E-51
S043 517 putative protein kinase Oryza sativa 81 4.00E-36
S060 448 probable protein BRICK1 Oryza sativa 98 4.00E-30
S074 490 translocon-associated protein beta family protein-like Solanum tuberosum 71 2.00E-18
S090 407 syntaxin-like protein 2 Hordeum vulgare 82 2.00E-12
S128 631 ubiquitin-like protein SMT3 Oryza sativa Japonica group 95 3.00E-45
S147 368 dirigent-like protein, expressed Oryza sativa 77 6.00E-40
S051 651 cytosolic heat shock 70 protein Spinacia oleracea 95 6.00E-109
S055 462 oxidoreductase Arabidopsis thaliana 62 6.00E-32
S082 274 ribulose bisphosphate carboxylase small chain clone 512 RuBisCO small subunit 100 5.00E-10
S108 497 Glycosyl hydrolases family 17 protein Solanum demissum 62 1.00E-29
S112 380 putative fructose 1,6-biphosphate aldolase Triticum aestivum 98 7.00E-57
S149 380 fructose-bisphosphate aldolase cytoplasmic isozyme Oryza sativa 98 7.00E-57
S152 377 peroxisomal membrane protein PEX11-1 Oryza sativa 82 2.00E-22
S154 462 3’-N-debenzoyltaxol N-benzoyltransferase –like Oryza sativa 81 4.00E-32
S155 413 immature spike ubiquitin-conjugating enzyme Triticum aestivum 90 4.00E-65
S170 464 ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase Triticum aestivum 96 8.00E-76
S173 369 adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase Hordeum vulgare 89 1.00E-09
S174 397 lyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase Triticum monococcum 98 7.00E-51
S135 464 tubulin alpha chain Triticum aestivum 98 2.00E-74
S132 290 MADS-box protein (PepMADS) mRNA Capsicum annuum pepper 82 2.00E-06
S007 687 elongation factor 1-beta (eEF-1B alpha) Triticum aestivum 95 6.00E-70
S020 426 MADS-box transcription factor TaAGL7 Triticum aestivum 90 5.00E-23
S178 602 putative reverse transcriptase Zingiber officinale 57 9.00E-05
S113 419 chlorophyll a-b binding protein 3C-like Solanum tuberosum 97 2.00E-44
S118 533 lipid transfer protein Triticum aestivum 93 2.00E-33
S154 462 putative PF02458-family acyl transferase 1 Triticum aestivum 74 3.00E-32
S052 335 conserved hypothetical protein Paracoccus denitrificans 72 5.00E-23
S023 732 hypothetical protein Oryza sativa 72 3.00E-71

利用 BIASTx 同 GenBank 的非冗余蛋白质数据库进
行同源性检索分析, 发现 49 条 EST 中 26 条功能已
知, 占全部 EST的 53.06%; 利用 GO(gene ontology)
数据库, 对 26条 EST进行功能注释, 发现与线粒体
有关的 EST 占 38.20%, 与叶绿体有关的占 5.90%,
而与细胞质有关的共占 55.40%。参与能量代谢和蛋
白质合成的 EST最多, 占 23.08%; 其次为参与蛋白
质修饰/加工/储藏的, 占 19.23%。部分同源比较结果
见表 2。在功能已知的 EST 序列中也得到可能与小
麦雄性不育紧密相关的标签序列, 如胞质苹果酸脱
氢酶(cytosolic malate dehydrogenase)、光系统 I天线
蛋白(H. vulgare mRNA for photosysteme I antenna
protein)、可溶性淀粉合成酶 (soluble starch synthase)
和 ATP酶调节蛋白(26S proteasome regulatory parti-
cle triple-A ATPase subunit2b)等。
3 讨论
在本研究获得的 EST 中, 发现了参与基因表达
调控的一些相关成分, 如与花粉粒发育和萌发有关
的肌动蛋白(probable protein BRICK1)和细胞骨架组
第 6期 李红霞等: 黏类小麦育性相关基因 SSH文库的构建 969


表 2 可育库中的 EST与 GenBank功能已知基因同源性比较(BLASTx)
Table 2 Similarity analysis (BLASTx) of fertile library EST with the function identified genes in GenBank
克隆编号
Sample No.
长度
Length (bp)
可能基因
Putative identification
种属
Organism
一致性
Identity (%)
E值
E-value
F025 336 putative senescence-associated protein Pisum sativum 94 1.00E-43
F045 485 vacuolar protein sorting-associated protein Oryza sativa 85 1.00E-26
F003 360 putative alpha-tubulin Oikopleura dioica 82 6.00E-13
F027 667 putative Cytocrome P450 like protein precursor Phillyrea latifolia 100 6.00E-33
F060 379 putative phosphopyruvate decarboxylase Iris tectorum 59 8.00E-16
F082 193 H. vulgare mRNA for photosysteme I antenna protein. Triticum aestivum 86 1.00E-34
F119 332 sugar transporter type 2a Oryza sativa 92 7.00E-06
F076 361 putative dihydroflavonol reductase Oryza sativa 56 3.00E-06
F043 410 cytosolic malate dehydrogenase Triticum aestivum 96 5.00E-23
F011 532 elongation factor 1 gamma-like protein Oryza sativa 86 1.00E-50
F029 493 S-adenosylmethionine synthetase 1 Triticum monococcum 100 1.00E-33
F036 445 putative ribosomal protein S18 Triticum aestivum 95 3.00E-25
F040 412 VTC2, putative, expressed Oryza sativa 76 5.00E-23
F051 471 soluble starch synthase Triticum aestivum 93 3.00E-37
F050 522 protein putative, expressed Oryza sativa 75 2.00E-19
F008 337 putative senescence-associated protein Pisum sativum 77 3.00E-43
F006 969 protein phosphatase 2C Zea mays 87 6.00E-99
F010 393 root hair defective 3 GTP-binding protein Triticum aestivum 100 4.00E-28
F035 328 non-specific lipid transfer protein precursor Triticum aestivum 81 5.00E-10
F041 394 protein transport protein SEC61 subunit gamma Arabidopsis thaliana 98 3.00E-21
F057 428 26S proteasome regulatory particle triple-A ATPase subunit2b Oryza sativa 95 2.00E-67
F080 337 putative senescence-associated protein Pisum sativum 93 1.00E-43
F018 847 unknown protein Oryza sativa 67 4.00E-28
F020 525 hypothetical protein Oryza sativa 72 5.00E-17
F024 485 expressed protein Oryza sativa 75 6.00E-27
F002 647 chloroplast hypothetical protein Zea mays 91 4.00E-16

成微管蛋白(tubulin alpha chain)等。前者构成细胞骨
架中的微丝系统, 参与有丝分裂、减数分裂、染色
体运动、细胞器流动等生命活动, 在生长发育过程
中起着重要作用,与植物雄性不育有紧密联系。在本
研究中,推测可能是由于细胞骨架构建不完善,使细
胞无法正常行使其基本功能,从而影响小麦育性[10-12]。
在不育库中发现了参与花发育调控的 MADS-box
转录因子(MADS-box transcription factor TaAGL7)。
MADS-box 转录因子是一类非常重要的调节基因家
族,具有特定的保守结构域, 通过其保守结构域与特
定的 DNA 序列结合来调控基因的表达。研究表明,
被子植物的大部分 MADS-box 基因参与花发育的调
控, 而且在植物花发育分子机制的 ABC 模型中, 大
多数与花发育相关功能基因属于 MADS-box 基因家
族。近年来, 对于小麦 MADS-box 转录因子的结构
与功能, 已经开展了不少研究。Danyluk等[13]在研究
小麦的春化作用机制时分离出与春化过程有关的基
因 TaVRT-1。其序列分析表明, TaVRT-1编码的蛋白
质与拟南芥控制花发育的MADS-box转录因子同源,
功能分析表明, 该基因与春化作用有关。Kane等[14]
研究表明 , TaVRT-2 编码的蛋白质与抑制开花的
MADS-box 转录因子同源, 是小麦花发育的抑制因
子。MADS-box 转录因子可能是小麦从营养生长向
生殖生长转变的一个关键基因。此外, Murai等[15]在
比较含有粗厚山羊草细胞质的异质小麦农林 26 和
中国春的雄蕊发育情况时, 发现农林 26具有雄蕊心
皮化现象 , 而中国春小麦的雄蕊发育正常 , 推测
MADS-box基因与诱导心皮化有关。Hama等[16]在研
究有粗厚山羊草细胞质的异质小麦雄蕊心皮化现象
时 , 分离出两个与心皮化有关的蛋白质 WPI1 和
970 作 物 学 报 第 34卷

WPI2, 系统进化分析表明, 它们都属于 B组MADS-
box 基因, 推测粗厚山羊草细胞质的异质小麦雄蕊
心皮化现象与 B组 MADS-box基因表达模式的改变
有关。孙清萍等[17]研究了红莲型水稻不育系花粉发
育不同时期 MADS-box 基因家族的表达差异, 发现
MADS-box 基因的表达明显受到细胞质的影响, 因
此认为 MADS-box 基因家族参与了水稻 CMS 和育
性恢复的核质互作。根据上述 MADS-box 转录因子
家族在小麦和水稻中的功能推测, 以及在不育库的
频频出现 ,认为黏类小麦雄性不育系的育性可能与
MADS-box 转录因子的过量表达有关,其功能尚需进
一步研究。
泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质选择性降
解的重要途径, 泛素分子主要通过泛素活化酶、泛
素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一
条多泛素链, 将底物蛋白泛素化, 使靶蛋白被 26S
蛋白酶体所识别和降解。UPP 可高效并高选择性地
降解细胞内蛋白质, 尤其是一些短寿命的细胞周期
调节蛋白、变构蛋白等。泛素化过程是真核细胞内
重要的蛋白质调控系统, 参与细胞的多种生理活动
过程, 比如细胞凋亡、细胞周期以及细胞内信号传
导等, 对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的
意义[18]。Samach等[19]和 Durfee等[20]发现泛素-蛋白
酶体途径对花发育有调控作用。本研究在不育材料
中检测到泛素结合酶的高表达, 由此推测可能是由
于不育系中泛素-蛋白酶体途径紊乱, 引起正常的功
能蛋白异常降解, 使细胞正常代谢受阻、细胞增值
与凋亡异常, 导致不育发生。
朱昀等[21]对小麦 T型细胞质雄性不育系、保持
系 mRNA 差异显示及育性相关基因的研究发现,淀
粉磷酸化酶基因只在三核期保持系中表达, 而在不
育系的相应时期不表达。陈举林[22]研究表明淀粉磷
酸化酶可以催化可溶性糖合成淀粉 ,玉米正常籽粒
淀粉积累达到高峰时 ,雄性败育株籽粒停止积累淀
粉,基本丧失淀粉合成能力。在败育的籽粒中,由于可
溶性糖转化为淀粉的机制受阻 ,与淀粉合成有关的
淀粉磷酸化酶活性始终低于正常籽粒。同时,胡美华
等[23]发现榨菜不育系的叶片、小花蕾、大花蕾的淀
粉磷酸化酶的活力均较保持系低。本研究中在可育
材料中检测到了高表达的可溶性淀粉合成酶
(soluble starch synthase), 在不育系中不但未发现该
酶的高表达, 而且发现了高表达的阻遏淀粉合成的
腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶(adenosine diphosphate
glucose pyrophosphatase)[24], 推测可能由于不育材
料中淀粉合成受阻使其能量代谢异常, 从而导致小
麦雄性不育。从两个文库分别筛选到的两个基因同
时被定位于淀粉的代谢过程 , 而且可以相互解释 ,
进一步说明小麦雄性不育与淀粉代谢过程的高度相
关性。
通过可育库和不育库的比较发现, 可育库中与能
量代谢有关的 EST明显较多, 尤其是在光合作用和碳
固定过程中起关键作用的光系统 I 天线蛋白 (H. vul-
gare mRNA for photosysteme I antenna protein)、ATP
酶调节蛋白(26S proteasome regulatory particle triple-A
ATPase subunit 2b)和苹果酸脱氢酶(cytosolic malate
dehydrogenase), 其中细胞质苹果酸脱氢酶在植物的中
枢代谢途径(糖酵解及三羧酸循环)、线粒体能量代谢
底物供应以及 C4 植物光合碳还原反应中均占有重要
地位.表明幼穗的能量代谢旺盛, 保证了小孢子发育过
程中正常的能量需求。
小麦雄性不育是一个非常复杂的遗传性状。在
后续的研究中我们将对这些基因的功能做更加深入
的研究, 以阐明其作用机制。本研究的结果在实践
上, 将加快 CMS 在小麦及其他作物育种上的利用;
在理论上将加深对 CMS 的认识, 丰富有关 CMS 的
生物学理论。
4 结论
成功构建了黏类小麦育性相关基因抑制差减杂
交文库, 通过对文库中部分 EST 进行序列测定和功
能分析, 比较不育和可育 cDNA 文库的基因表达谱,
获得了多个可能与小麦雄性不育紧密相关的基因。
在可育 cDNA 文库中发现了参与能量代谢的胞质苹
果酸脱氢酶和可溶性淀粉合成酶, 在不育 cDNA 文
库中检测到了与花发育调控相关的 MADS-box转录
因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成
的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶。
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