全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(6)：597— 601 2006年 11月
无核荔枝果实形成差异表达基因cDNA的克隆
榻维言1一，郑学勤1
(1．中国热带农业科学院 热带作物生物技术国家重点实验室 ，海南 海 口571107；2．广西大学 农学院，广西 南宁 530005)
摘 要 ：采用抑制差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)分离与海南无核荔枝果实形成
相关的差异表达基因的 eDNA片段，为克隆相关基因提供研究基础。分别以无核荔枝的有核幼果为 driver；
无核幼果为 tester，建立差减 eDNA文库。经 Reverse Northern Dot-Blot筛选该文库 ，共获得 61个阳性克隆，
随机选取 17个克隆进行测序，共获得 1o条非重复序列，对其中较长的 7个序列进行同源分析，结果表明：有 6
个序列在荔枝中为首次报道。
关键词 ：无核荔枝 ；无核果实 ；抑制差减杂交(SSH)；Reverse Northern Dot-Blot
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2006)06—0597—05
Cloning the eDNA fragments of differentially
expressed genes between seeded and
~edless fruit of seedless litchise
XUAN W ei—yan1，2．ZHENG Xue—qinI*
(1．The State Key Laboratory for Tropical Crop Biotechnology．Chinese Academy of Tropical Agricultural
Science，Haikou 571101，China；2．Agricultural College。Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：The Suppression Subtractive Hybridization(SSH)technique was used to clone the eDNA fragments
of differentially expressed genes between seeded and seedless fruit in Hainan seedless Litchi．One positive dif—
ferential expressing eDNA library was constructed using the cDNA of seeded fruit as driver and the cDNA of
seedless fruit as tester．Sixty—one positive clones were obtained by using the Reverse Northern Dot—Blot to
screen the eDNA library．Nucleotide sequences of seventeen randomly chosen positive clones were sequenced
and found ten are different sequences．Subsequently sequence analysis shows that the 6 clones corresponding
to their nucleotide sequences all are first reported in Litchi varieties．
Key words：seedless litchi；seedless fruit；Suppression Subtractive Hybridization(SSH)；Reverse Northern
Dot—Blot
海南无核荔枝是荔枝中的珍稀品种，其无核率
高达 95 ，深受广大消费者的喜爱。但其果实的无
核率不够稳定，易受开花期温度变化的影响。无核
率的不稳定性严重影响了该品种的推广种植及其生
产的经济效益。形态组织学研究表明，无核荔枝无
核果实的形成是由于授粉后受到低温的影响导致胚
胎败育而引起 (陈健辉等，2001；杨应华等，2002)。
在荔枝胚胎发育研究方面，刘成明等(2002)采用随
机扩增多态性 DNA(RAPD)标记方法，对荔枝的多
个品种及其焦核突变体进行了多态性分析，得到了
2个可能与荔枝焦核基因相关的特异 eDNA片段。
陈伟等(2001)采用双向电泳技术分离到多个与荔枝
收稿 日期：2006一Ol一16 修回日期：2006—05—25
基金项 目：国家“863”计划项 目资助(AA001380)[-Supported by National High Technology Research and Development Program of
China(AA001380)]
作者简介：榻维言(1963一)，女 ，副教授，博士 ，主要从事作物生理及植物基因工程研究。
’通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：zhengxxxqin@126．com)
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胚胎分化发育相关的特异蛋白。张以顺等(2004a，
b)利用抑制消减杂交技术(SSH)，从败育胚中分离
到与荔枝胚败育相关的多个 eDNA片段及 腺苷
甲硫氨酸合成酶基 因的 eDNA序列 。作者认为 ，
腺苷甲硫氨酸合成酶基因在荔枝败育胚中大量表达
可能在某种程度上参与了其体内乙烯合成的调控，最
终导致荔枝胚胎的败育。这些研究成果为探讨荔枝
胚胎发育的分子机理及基因调控提供了重要参考。
目前，从分子水平上探讨荔枝无核果实形成机
理的文献报道尚不多，而且荔枝胚胎败育与无核果
实的形成涉及到许 多基 因的表达和调控。因此 ，开
展并克隆与无核荔枝果实发育相关基因的研究，有
助于我们从分子水平上更多地了解无核荔枝果实形
成和胚胎败育的调控机制，丰富果树无核果实形成
的基础理论，以充分开发利用无核荔枝的特殊种质，
为创新荔枝种质和培育优良荔枝新品种提供理论基
础和技术指导 。
1 材料与方法
1．1材料
植物材料：用于提取总 RNA的无核荔枝幼果
取白海南陆桥无核荔枝农场，为 5--7年生正常挂果
果树，品种为海南无核荔枝。收集花后 2O d的幼
果，迅速剥开，将有核与无核的幼果分装，放人液氮
中带回实验室，置一75℃保存备用。
试剂 ：PolyATtraet@mRNA Isolation Systems
Ⅲ购 自 Promega公 司，Clontech PCR—SelectTM cD—
NA Subtraction Kit和 Adawantage eDNA poly—
merase购 自 CLONTECH 公 司，Dig High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II购 自
Roche公司，Reverse Transcriptase XL(AMV～XL)
购自大连宝生物公司。PCR扩增片段的回收、克隆
分别采用大连宝生物公司的 TaKaRa TaqTM、上海
生工公司的 UNIQ-10柱式 DNA胶 回收试剂盒、
pMD18一T Vector进行。PCR引物合成和克隆的测
序分别委托北京新经科生物技术有限公司、上海生
工生物工程服务有限公司进行。其它生化试剂为进
口或国产的分析纯级以上试剂。
菌种：E．coli DH5a由本室保存。
1．2方法
I．2．I无核幼果与有核 幼果总 RNA 的提取 采用
改良一步快速热酚抽提法(卢圣栋，1999)进行。
1。2。2 RNA电泳检测 分别取无核幼果与有核幼
果总 RNA 5 g进行凝胶电泳，并在紫外光下照相。
1．2．3 mRNA 的 纯 化 根 据 Promega公 司 的
PolyATtract~mRNA Isolation Systems ni说明 书
进行 。
1．2．4抑制差减杂交 具体操作根据 Clonteeh公司
的PCR-SeleetTM eDNA Subtraction Kit说明书进行。
1．2．5差减 cDNA 文库 的构 建(T／A克 隆法) 从
第二次 PCR扩增后的正向差减 eDNA群体(共 10
L)中取 4．5 L与 0．5 L的 pMD-18 T vector在
16℃下反应连接 3 h，将连接产物转化受体菌 E．
coli DH5a，于 X-gal／ITPG、Amp琼脂平板上 37℃
培养过夜，挑取 白色克隆，接种于盛有 800 L LB
(an Amp)的 1．5 mL离心管中，37℃培养过夜。加
15 的无菌甘油，液氮速冻，一7O℃保存。建立正向
差减 eDNA文库。
1．2．6正向差减 cDNA文库 的筛选 (1)菌落 PCR
鉴定重组子阳性克隆：吸取 2 L各菌落的 LB培养
液分别加到灭菌的 0．2 mL PCR管中，写好标记。
准备 Nested PCR Master Mix在一个 1．5 mL的离
心管中依次加入试剂(表 1)。涡旋混匀，稍离心。
在各个装有菌液的 PCR管 中分别加入 23．0 L
Nested PCR Master Mix，混匀，稍离心，立即进行下
面的热 循环 反 应 ：95℃ ，5 rain，35cycles：94℃ ，
10sec；68℃ ，30see；72℃，1．5 rain，最后 72℃延伸
10 rain。每个反应管中取 5 L PCR产物于 1．0
agrose凝胶中电泳检测并照相。
表 1 巢式 PCR反应混合物
Tab1e 1 Nested PCR master M ix
试剂 Regent
1次反应 5O次反应
的用量( I ) 的用量( I )
Amount per For a 50—-Rxn—-
reaction Experiment
(2)Reverse Northern Dot—Blot鉴定 阳性差异
片段：在各菌落 PCR样品 中加入 1M NaOH 及
200mM EDTA，使其终浓度为 0．4M NaOH／10mM
EDTA，在 100℃变性 10 rain，将各管稍离心。将菌
落 PCR产物一式两份等量点置尼龙膜上。分别取
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6期 棚维言等 ：无核荔枝果 实形成差 异表达基困 eDNA 的克 隆 599
无核幼果(Tester)和有核幼果(Driver)总 RNA 50
g用 Reverse Transeriplase XL(AMV—XL)进行反
转录，方法参照该酶使用说明进行。用 DNA胶 回
收试剂盒 回收纯化 Tester和 Driver eDNA 第一 链，
方法按 UNIQ—l0柱式 DNA 胶 回收试 剂盒说 明书
进行 以 Tester和 Driver cDNA第一链 为模板 ，标
记探针，探针的标记与预杂交、杂交及洗膜和放射
’胜自显影 均按 Dig High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit I的说 明书进 行。
1．2．7 DNA测序噩 同l源序 列 的比较分 析 随 机挑
选 I 7个经过 Reverse Northern Dot—Blot筛选 鉴定
为阳性差异片段送上海生物工程技术有限公司测
序，所有测出的序列去除载体序列与引物序列后，通
过网络提变 NCBA进行 BLASTN分析 。
2 结果与分
2．1无核幼果和有核 幼果总 RNA的提取结果
无核幼果和有棱幼果总 RNA凝 胶 电泳结 果显
示(图1)，288rRNA、18SrRNA条带明显清新，而且
28SrRNA比ISSrRNA的量大，说明所提取的幼果
总 RNA完整’睦较好，适宜用于进行抑制差喊杂交．，
厂——— — ———]
●28S rRNA 1
l
图 l 幼果 RNA 凝胶 电泳
Fig 1 Total RNA GL electrophoresls in TAE bufer
I无 恢幼 总 RNA；2 有僻劫 桀总 RNA。
1．TotHI RNA of seedle ss fruit；2．To【aI RNA of {cd frui【．
2．2差臧 eDNA文库的构建夏克隆的初步鉴定
运用 SSH 技术，以无核 幼果作 为 Tester，有 核
幼果作为 D rer，进行 正 向差硪 杂 交，羞碱 得到 的
cDNA片段用T／A克隆法构建质粒载体系统文库．
得到了一个含有 381个独立克隆的 eDNA文库
对该文库的克隆进行菌落PCR扩增，以检测其阳-陛
与插人片段的大小 结果 显示 ，绝大部 分克隆具 有
特异 eDNA插^片段而且插入片段的大小主要集
中在 l00～600 hp之问 (图 2)．与 SSH 设计预期 的
插入片段大小大致相似
2．3 Revere Northern Dot-Blot分析结果
将不 同的克隆 片段分别 与 Tester和 Driver的
反转录 cDNA探针 杂交 ，经 洗膜 、免 疫检 测、压 片、
显影与 定影 后 ．将 无 核 幼果 (Tester)与有 棱幼 果
(Driver)的 X_光片上的杂交信号进行对比分析，找
出在Tesler中有杂交信号而在 [)river中没有杂交
信号 的克 隆以及在 Tester中杂交信 号强于 Driver
的克隆共有 61个 。
圈 2 SSH差示库菌藩 PeR鉴定阳 克隆结果
Fig．2 Positix,e clones()f subtracted library PCR detected
Reverse Northern Dot—B1ot检测结 果表 明，有的
克隆与Tester的cDNA显示杂交信号，有的与 Driver
eDNA显示杂交信号，有些克隆则未显示任何信号．
说明这些 克隆可能来 自低丰度表达的基围(图 3)。
2．4无核果实差异表达基 因 eDNA 片段 序列分析 及
同源性 比较
从 Reverse Northern Dot-Blot鉴定的 51个阳性
克隆中随机选取 l7个克隆送上悔生物工程技术有限
公司测序 将序列测定结果与 (SerJ3ank进行同源性
比较，共获得 LO条末重复序列，各 rDNA的棱酸序列
如图4(其中较短的3个 cDNA序列未列出)
与 GenBank棱酸序列同源 比较结果见表 2。
3 讨论
在植物的生长发育过程巾，基因按时问和空间
顺序有序地进行表达。在植物生长发育的各个阶
段 ，基因的表达 是不和 同的 。通过 比较同一类细胞
或组织在不同生 长发育 阶段 的基因表 达差异 ，对 了
解植物生长发育过程的基因调控机制及发现发育相
关基因有很大帮助。利用 SSH技术成功地分离植
物发育过程中差异表达基因已有成功的报道(Kim
等1 999a．h；刘军等，2000；Hinderhofer等．2001；骆
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● ● ●
● ● ‘
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● ● ‘
● ’ ●
●
有核幼果 Seeded f ru i t(D r i ve r) 无核 幼果 Seed I ess f ru i t(Tester)
图 3 Reverse Northern Dot Blot郁丹结果
Fig．3 Partial results of Reverse Northern Do t Blot
76．5’一ACAAGCTTTTTTTTTTTTTT TTTTT1 TTTTTTT丌 TTAATTAT^ TGACTCAACATTGAAAGTTGAGAAAACATAATA
TTTAAGCTGTTGATATGGTCGGTCATTATTGTAGATTCCGCCATTCAAAGATTATCAGGCTTCCTCTTTAAAAAAATCTTCAT
GTGTAGTAAC1 GGATTA 丁TCATACA ATCTTATCAGAATGTCTCATACCTCCTTAGTCGTCTTCTTCTCTGCTACACTTAATA
ATAACTATTTGCTAAAGCCAGATGGATATTGGAAATTGCG丁TGTcATCC．s,TCTCTTTCCA丁丁丁GACGTCATCACTAATCTC：＼G
CTGACT1 TCTTCA ATTGCTTG TAAGCAAT TATCTTTCCTCAAGATA c^cTATACTAAGATAGTTGCGAGTAA ACCTGTCGTA
GTTAATGGTAGG GCTGATCTTGA AAGGAACCCTGACACCAC 一3
307j 5 一TGACCCATTATACAAAAGGTACGCCGTCACCGCGCTTGGCGGCTCCGACTGCTTGTAGGCTTCCGATTTCAGGATCTGT
TCGGGGTGCTTTTCACC丁rTCCCTCACGGTACTTGTTCACTATCGGTCGTAGAGGAC；TACTTAGGCTTGGAG
GGTGGTCCCCCCATGTTCAGACAGGATTTCACGTGTCCCGCCCTACTCGGGTCTCTTGCTGTTTGATGACT
CACTATGGCCGACCTT TCCAGATCGT1、cG丁CTTTATTTCACAAGAGC-3
306 5 AcrfGCCATTGCTCAATACCTCGAGTTGATCTCCAACATGGACAA ACAGTGCATTTGGCAAGTAATCCACGGCAACCCA
ATTCCCA丁CCTTCCACACTTGAAGGCCAGG A^ CATCATTGGGGACGAGTATGG丁6^GTGCAG C^ATGTCAGTGTGAGCTTCAAC
TCCAACGGCCAGTTGAGGCTGTGGGCGTCC TGGATACATGTTTATTTTCATTTCTAG丁1、c丁ATCGCTTC^CCTCcTAA[TGGGA
CTCCAAA
187：5’一ACAA AGTCTCCACTCCTCTAGCCTTCTCCATTTCATGTCC丁TCGAGCTTGATGGA ^GATGGAAAATGCGGGGC丁ACAAA
CAA丁GTTATGGGTTCATCAAAGACCGTTGAT( rGCCGATACCAAGGG G^TGGGGATTGGCACCATCCAGCTATT^CGTTCCTCT
CTTCCCCATCATTGCTATTCCrTA GTTCC-3。
179 S『_AGCGTGGTCGcGGCCGAGGTAGTCACGGAGCTCGTCTTGCGCGTAA C^GCCCAAGAGAACATCAGGGAAGTAGGCGCGG
CAGAAGTCGCGGCTCC,TGTTGTAGTAAAGCTGCAGATCGGGCTTGGT丁TTCCAG G^CGGCGA 1^ CTTCGGGG1G^TCTTCGAA
AAG0 3
】 7 5 AGGG丁CAATCCCAGAGA丁CGACTTAGC^ GCGTCG下GCAGGC C^丁TGC ~GGCCTGTTGGCGATCAGAAGTGGTAG丁GGCA
GCGCTGTTAAGA GACTTGACTCCATTGCAGCATGGTAC G^CCACAGACCCACCAGACCTCAAGTACA丁G^1℃ C一3
1 72．5。一AAACTTGACTCCAGGCAAACAAACATGTAGATGGM GAAGTGAATAC^ AAATGCTTGA TCGTGTAAAGATCAT^ ATAC
ACTTAGCACTCATGGGGACTTTGGAGTCAAGGACATGTAAA^AGCAGCTGA_^AGATAAGTTTGACCATTTACAGTAATGGCAG
GGCTCATCTT一3。
圈 4 阳性克隆序列
Fig．《 SeqLIelIces Of D0sit he clones
表 2 GenBank核酸序列同源比较结果
Table 2 Results of diffe rential expresslved sequences
homology analys s to sequences n GenBank
掣1．长en度gth 同H蕊om性o1分og折y 物种P百e丹re堂~ 值 ) _vsi Sp⋯eci e
中棱苷酸数据库进行同源性分析，结果表明，Lo个
不同的序列中，一个 eDNA与 B．diminuta的23S
rRNA基 因有较 高 的同源 性 ，6个 eDNA均 束发 现
有显著相关的同源序列，其余 3个 eDNA由于序列比
较短来做同源分析。从 GenBank中查不到任何对应
同源序列的克隆，其原因可能有两种情况：一是代表
了新基因：二是可能克隆的eDNA序列位于基因变异
丰富的 3 端而无法查到与其它物种基因的同源陛
通过本研究得到了6个有意义的与海南无孩荔
枝果实发育相关的差异表达 eDNA序列，这些序列
均为荔枝中首次报道。至于这些序列是不是新基因
以及其功能如何，还有待进一步研究。
蒙等，2002a，b；Gao等，2003；赵小兰等，2005)
本研究在对差减 cDNA文库筛选后，随机选择 参考文献 ：
17个阳性克隆测序，然后将 eDNA序列与GenBank 刘 军．裒自强．刘健束．等 2000应用抑制差碱杂交法丹离
● ◆ ． ． ．
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(上接第 630页 Continue from page 630)
植体叶片愈伤组织诱导、继代及再分化培养条件探
究，得到以下结论：愈伤组织诱导和继代最佳培养基
为 MIS_+NAA 0．5 mg／L+2，4一D 2．0 mg／L，在仅含
BA的 MS培养基上，愈伤组织分化大量健壮不定芽，
1／2MS+0．5 mg／L IBA培养基有利不定芽生根。
在诱导叶片愈伤组织实验中发现，较高浓度的
生长素有利于愈伤组织诱导。许多研究表明2，4一D
对外植体脱分化启动效果最好，我们也有相同的结
论，但许多文献报道，连续使用易使愈伤组织褐化。
本试验结果表明，将诱导分化的长柄双花木愈伤组
织接种在含 2，4一D培养基上继代培养，愈伤组织增
殖率最高，增殖的愈伤组织每 2O天继代一次可避免
褐化现象。
长柄双花木外植体在添加 NAA培养基中极易
诱导分化出愈伤组织，不利于愈伤组织分化，推测与
长柄双花木外植体本身内源 NAA含量高有关，因
此在不定芽增殖和诱导不定根时应避免使用NAA。
在离体再生培养过程中，不定芽和再生植株生长非
常缓慢，今后还需探索各种培养条件以促进长柄双
花木再生植株生长。
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