全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOG ICA SIN ICA　35(3):270-273(2005)
收稿日期: 2004-04-12;修回日期: 2004-10-15
基金项目:北京市自然科学基金资助项目(5042018)
通讯作者:王锡锋 ,研究员 ,主要研究方向为植物病毒学;电话:62815928, E-mail:x fwang@ ipp caas. cn。
研究简报
2个不同缺失型美洲商陆抗病毒蛋白基因
在大肠杆菌中的表达
赵 玉1, 2 , 王锡锋 1* , 周广和 1 , 李怀方 2
(1中国农业科学院植物保护研究所 , 植物病虫害生物学国家重点实验室 , 北京 100094;
2中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100094)
Expression of two deleted mutan t of pokeweed antiv ira l pro tein genes in Escheri-
ch ia co li and their an tiv ira l activ ity　 ZHAO Yu1, 2 , WANG X i-feng1 , ZHOU Guang-he1 , L I
Huai-fang2(1S ta teK ey Laboratory of the B iology of P lan tD iseases and Pests, Institute of P lan t Protection, Chinese Academy of
A gr icultural Sc iences, Be ijing 100094, China;2College of Agronom y and B iotechno logy, China Agr icultural Un ivers ity, Beijing
100094, China)
文章编号:0412-0914(2005)03-0270-04
　　美洲商陆抗病毒蛋白 (pokeweed an tiv iral pro-
teins, PAPs)是在美洲商陆不同组织或不同生长阶
段合成的一类具酶功能的单链核糖体失活蛋白 ,它
有抑制多种病毒侵染的能力 。 PAP是从美洲商陆
春季叶片中分离出来的一种单链碱性蛋白 ,成熟蛋
白分子量约为 29 kD[ 1] 。该蛋白具有 RNA N-糖苷
酶的活性 ,能专一地从真核生物核糖体 60S大亚基
的 28S rRNA特异位点 A-4324上切下一腺嘌呤 ,
使其难与蛋白质合成的延伸因子 EF-2结合 ,从而
阻碍了细胞中蛋白质的合成 。从目前的报道来看 ,
PAP属于广谱性抗病毒蛋白 ,它不但对动植物病毒
有一定的抗性 ,对真菌 、细菌也有一定的抑制效
果 [ 2, 3] 。
L in等 [ 4]分离和测定了编码 PAP的 cDNA全
序列 ,它由 1 164个核苷酸组成 ,成熟的 PAP由其
前体加工而来 , PAP前体由 313个氨基酸组成 , N-
末端有一个由 22个氨基酸组成的信号肽 , C-末端
有一个由 29个氨基酸组成的稳定区 。最近研究发
现 , PAP还有不同的功能区[ 5] ,一个在成熟 PAP的
N-端 170 ～ 183个氨基酸处为一活性区域 ,其主要
功能是对病毒产生抗性;另一个在 C-末端 1 ～ 25
个氨基酸处的区域 ,主要功能与脱去 rRNA特异位
点的腺嘌呤有直接关系 , 并能对寄主产生毒性。
Tumer等[ 5]将第 176位的氨基酸 E变成 V ,可使其
失去毒性 ,但也丧失了对病毒的抗性 。目前还不清
楚将 PAP基因缺失到什么程度使其有更好的抗病
性而对寄主没有毒性 。本文通过缺失突变的方法 ,
克隆了 2个缺失型 PAP基因 ,并在大肠杆菌中得
到了相应表达 ,这将为 PAP基因原核表达蛋白直
接应用于体外防治病毒病害 ,以及利用对寄主植物
无毒的 ,缺失型 PAP基因进行抗病毒基因工程提
供目的基因奠定基础 。
1　材料和方法
1. 1　材料
1.1.1　菌株及质粒　宿主大肠杆菌菌株 JM110、
BL21(DE3)-pLysS,重组质粒 pT1(含有 PAP全长
DOI牶牨牥牣牨牫牴牪牰牤j牣cnki牣apps牣牪牥牥牭牣牥牫牣牥牨牬
的基因 )均由本实验室保存 ,载体 pGEM©-T Easy
及 pET-5a购于 Prom ega公司。
1.1.2　酶及试剂　限制性内切酶为 Promega公司
产品 , Taq酶购于 TaKaR a公司 , PCR产物回收试
剂盒购于赛百盛公司 ,其它试剂均为国产分析纯
产品。
1.1.3　PAP抗血清　由法国 UFR分子生物学实
验室 Philippe Dulieu博士惠赠 ,本实验室保存 。
1.2　方法
1.2.1　引物的合成　根据 L in等 [ 4] 发表的 PAP
cDNA序列 ,设计出 N-端缺失 22个氨基酸 (信号
肽 )的引物 P4(CCTCTAGACATATGGTGAATA-
CAATCATCTACAAT)、C-端缺失 29个氨基酸
(稳定区 )的引物 P6 (AAGGTACCGGATCCT-
CAAGTTGTCTGACAGCTCCC)和 C-端未缺失的
引物 P2 (CGGGTACCGGATCCTCAGAATCCT-
TCAAATAGAT)。为便于将外源基因连接到表
达载体上 ,在所设计的引物两端引入相应的限制
性酶切位点 ,引物设计及预计获得的相应缺失体
见图 1。
1.2.2　PCR扩增 　以 pT1为模板 , P4、P2为引
物扩增 N-端缺失的 PAP基因;以 P4、P6为引物
扩增 C-、N-两端皆缺失的 PAP基因 。 PCR反应
条件为:94℃预变性 3m in;随后 94℃ 1 m in, 55℃
1.5 m in , 72℃ 1.5 m in , 30个循环;再 72℃延伸
10m in。
1.2.3　PCR产物的回收 、克隆及序列分析　将
PCR产物进行 1%的琼脂糖凝胶电泳 ,回收目的
片段 。按照 pGEM©-T Easy载体试剂盒的要求 ,
将 PCR产物与该载体连接成重组质粒 pT42和
pT46,然后转化大肠杆菌 JM110,在含有 X-gal及
IPTG氨苄青霉素 LB培养基上 ,挑选白色菌落 ,
提取其重组质粒 ,经 PCR和酶切鉴定确认后 ,由
上海博亚生物公司进行序列测定 。
1.2.4　原核表达载体的构建及其表达　将 pT42
和 pT46两个质粒用 Nde I和 BamH I酶切 ,分别
回收 876 bp和 789 bp 2个外源基因片段 ,重组到
原核表达载体 pET-5a的 Nde I和 BamH I酶切位
点处 ,获得大肠杆菌表达载体 pET42和 pET46,
然后转化大肠杆菌 BL21(DE3)-pLysS,以空载体
为阴性对照 ,经 IPTG诱导表达后 ,取 1mL菌液 ,
回收菌体进行 SDS-PAGE分析 。用 KODAK 公
司的 Kodak EDAS 290照相分析系统对 SDS-
PAGE进行表达蛋白的粗定量分析 。
1.2.5W estern blotting分析　将 SDS-PAGE分析
有特异带或有明显加粗带产生的菌体 ,参照《分
子克隆实验指南》[ 6] 的方法进行 Western b lotting
分析 ,以 PAP特异抗血清作一抗 ,碱性磷酸酶标
记的羊抗兔 IgG作二抗 ,然后加底物 NBT /BCIP
进行显色反应 。
2　结果与分析
2. 1　2个缺失型 PAP基因的 PCR扩增
以 pT1为模板 , P4、P2为引物扩增 N-端缺失
的 PAP基因 (N-端缺失信号肽 );以 P4、P6为引
物扩增 N-、C-两端皆缺失的 PAP基因 (N-端缺失
信号肽 , C-端缺失 29个氨基酸的稳定区 ),电泳
结果显示 PCR产物条带大小分别为 876 bp和
789 bp,与预期值大小一致 (图 2)。将 PCR产物
回收后与 pGEM©-T Easy载体连接 ,得到重组质
粒 pT42和 pT46 ,经 PCR及Nde I和 BamH I双酶
切鉴定证明重组质粒 pT42和 pT46分别含有相
应的缺失型 PAP基因片段 。
Fig. 1　Design p rmi ers for d ifferent deleted PAP genes amp lification
2713期 赵 玉 ,等:2个不同缺失型美洲商陆抗病毒蛋白基因在大肠杆菌中的表达
Fig.2　Two deleted PAP genes amp lified by
PCR from pT1
1:M arke r (bp);2:W ithou t N-te rm ina l PA P gene am pli-
fied;3:W ithou tN-and C-term ina l PAP gene amplified.
2. 2　2个缺失型 PAP基因序列测定
以重组质粒 pT42和 pT46上的 T7启动子和
SP6启动子为测序引物 ,对克隆的外源片段进行
序列分析 ,结果发现重组质粒 pT42和 pT46中插
入的外源缺失型 PAP基因与 pT1上的 PAP基因
相应的序列完全相同 。
2. 3　2个缺失型 PAP基因表达载体的构建及其
在大肠杆菌中的表达
将重组质粒 pT42和 pT46分别用 Nde I和
BamH I双酶切回收 876 bp和 789 bp的片段 ,然
后将回收的片段与经 Nde I和 BamH I双酶切后
的 pET-5a相连接 。构建了大肠杆菌的表达载体
pET42和 pET46,经 PCR扩增及 Nde I和 BamH I
双酶切鉴定 ,证明重组质粒 pET42和 pET46上分
别连有相应的缺失型 PAP基因片段 。分别将
pET42和 pET46转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3)-
pLysS,经 0.4 mmol /L IPTG诱导后 ,取菌体进行
SDS-PAGE分析 ,发现在 32 kD和 29 kD处分别
有一明显加粗的蛋白带 ,其分子量大小与预期值
一致 ,而未经诱导的 pET42、 pET46和 pET-5a空
载体则无此条带 (图 3、图 4)。经Western blotting
分析 ,明显加粗的蛋白带与 PAP抗血清发生了特
异反应 (图 5),说明克隆的 2个缺失型 PAP基因在
大肠杆菌中都得到了正确的表达。
用 KODAK公司的 Kodak EDAS 290照相分
析系统对 SDS-PAGE进行了表达蛋白的粗定量分
析 ,其中 pET42的表达量约 0.5 m g /mL菌液 ,
pET46的表达量约 2 mg /mL菌液 。
Fig.3　SDS-PAGE of pET42 expressed in
E. co li
1:P ro te in m arker;2 - 7:pET42 inducing w ith IPTG;8:
pET42 w ithout induc ing;9:N ega tive con tro.l
Fig.4　SDS-PAGE of pET46 expressed in E.
co li
1:P ro te in marke r;2:Negative control;3:pET46 w ithout
induc ing;4:pET46 induc ing w ith IPTG.
Fig.5　W estern b lo tting of two pro teins of
pET42、pET46 exp ressed inE. co li
1:pET42 induc ing w ith IPTG;2: pET46 induc ing w ith
IPTG;3:N ega tive con tro.l
272 植物病理学报 35卷
3　讨论
1925年 Duggar和 Arm string就发现美洲商陆
汁液中存在一种可抑制 TMV侵染植物的组分 ,直
到 1975年 Irvin[ 1]成功分离提纯美洲商陆抗病毒
蛋白以后 ,对美洲商陆抗病毒蛋白的研究才日益引
起人们的重视 。 1993年 Lodge等[ 7]的试验表明 ,
转全长 PAP基因的马铃薯和烟草植株一般会表现
出花叶 、果实变小 、植株变矮等不良症状 。 1997年
Tumer等[ 5]提出 PAP基因有 2个功能区的理论 ,
即全长的 PAP基因存在对寄主植物产生毒性的区
域和对病毒有活性的区域。随后对 PAP基因进行
定点突变的研究也开始出现 ,但目前有关对全长
PAP基因缺失的研究还不多 ,也不清楚将该基因缺
失到什么程度使其有更好的抗病性而对寄主没有
毒性。为了研究 PAP基因的结构和功能 ,本试验
设计了不同的引物来扩增全长的和 5个不同缺失
型的 PAP基因 ,其中只有 N-端缺失以及 N-、C-两
端皆缺失的 PAP基因在大肠杆菌中得到了表达。
Tumer等[ 5]报道 C-端缺失 29个氨基酸的稳定区后
再缺失 25个氨基酸的毒性区 (即 C-端共缺失 54
个氨基酸),这种缺失突变表达的蛋白稳定性下降 ,
表达量低 ,亚细胞的定位也发生了变化 ,而我们表
达的 2个蛋白则不存在这种现象。它们在植物体
外的抗病毒活性及把它们作为目的基因转入植物
体内的试验还有待进一步研究 。
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责任编辑:于金枝
2733期 赵 玉 ,等:2个不同缺失型美洲商陆抗病毒蛋白基因在大肠杆菌中的表达