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菌物学报   
jwxt@im.ac.cn  22 May 2016, 35(5): 597‐604 
Http://journals.im.ac.cn  Mycosystema    ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q   
Tel: +86‐10‐64807521  Copyright © 2016 Institute of Microbiology, CAS. All rights reserved.
研究论文 Research paper      DOI: 10.13346/j.mycosystema.140301 
 
                                                                 
基金项目：河南省重点科技攻关项目（082102150048）；河南省高校科技创新团队支持计划（15IRTSTHN014） 
Supported  by  the  Key  Science  and  Technology  Research  Project  of  Henan  Province  (082102150048)  and  the  Program  for 
Innovative Research Team (in Science and Technology) (in University 15IRTSTHN014) from Henan Province. 
*Corresponding author. E‐mail: qliyou@henau.edu.cn 
Received: 2014‐12‐31, accepted: 2015‐04‐03 
 
启动子替代构建糙皮侧耳漆酶高产菌株 
刘冬忍     田芳     王小飞     王景冒     戚元成     宋安东     申进文     邱立友* 
河南农业大学生命科学学院  农业部农业微生物酶工程重点实验室  河南  郑州  450002 
 
 
 
摘    要：POXC是糙皮侧耳合成最多的一种漆酶。应用启动子替代技术，用构巢曲霉的甘油醛‐3‐磷酸脱氢酶基因（gpd）
启动子替代 POXC 基因的启动子，构建了超量表达 POXC 糙皮侧耳转化子。转化子中 POXC 基因表达量比出发菌株提高了
0.72–3 倍。在 PDA 平板培养、PD 摇瓶培养和棉籽壳试管培养条件下，转化子漆酶活力显著提高，比出发菌株提高了 1.5
倍以上。用棉籽壳栽培，转化子菇产量比出发菌株提高了 16.2%，培养料中木质素含量比出发菌株减少 21%。结果表明，
应用高效启动子替代能够显著提高糙皮侧耳漆酶基因的表达量、漆酶活力及其木质纤维素降解能力。 
关键词：糙皮侧耳，漆酶，启动子替代 
 
Construction  of  high  laccase  producing  strain  of  Pleurotus  ostreatus  by 
promoter swapping 
LIU Dong‐Ren      TIAN Fang      WANG Xiao‐Fei      WANG Jing‐Mao      QI Yuan‐Cheng      SONG An‐Dong     
SHEN Jin‐Wen      QIU Li‐You* 
College  of  Life  Sciences,  Henan  Agricultural  University;  Key  Laboratory  of  Enzyme  Engineering  of  Agricultural Microbiology, 
Ministry of Agriculture, Zhengzhou, Henan 450002, China 
 
Abstract: The oyster mushroom Pleurotus ostreatus  is one of  the most  important white  rot  fungi. POXC  is  the most abundant 
laccase  isoenzyme produced by the Basidiomycota fungi.  In this study, by employment of a promoter swapping technique, the 
promoter  for  POXC was  replaced  by  the  promoter  of  glyceraldehyde‐3‐phosphate  dehydrogenase  gene  (gpd)  of  Aspergillus 
nidulans. The POXC gene expression  level of  the  transformants was  increased up  to 0.72‐  to 3‐fold  the  level of wild  type. The 
transformants  showed  significant  level  of  laccase  activities  in mycelia  cultured  in  PDA  plate  culture,  PD  liquid  culture,  and 
cottonseed hull tube culture, being increased more than 1.5‐fold the level of wild type. Mushroom yield increased by 16.2% and 
lignin  content  decreased  by  21%  in  a  cultivated  transformant  as  compared with  the wild  type  cultured  on  cottonseed  hull 
   
  ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    May 22, 2016    Vol. 35    No. 5 
   
 
 
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medium.  The  results  showed  that  using  gpd  promoter  to  drive  the  expression  of  POXC  could  be  an  effective  approach  for 
improving the lignin‐degrading properties of P. ostreatus. 
Key words: Pleurotus ostreatus, laccase, promoter swapping 
 
木质纤维素是地球上最为丰富的植物来源的
可再生资源，每年产生量约为 1 000亿吨，但其利
用率还不到 3%（王岚等  2014）。利用食用菌转化
木质纤维素获得食药用品，是人类利用木质纤维素
的最早方式，也是目前人类对木质纤维素最大规
模、最有效的利用方式（邱立友  2008）。不论是
草腐类食用菌，还是木腐类食用菌，均具有较强的
木质纤维素降解酶活性和木质纤维素降解能力。典
型的草腐类食用菌双孢蘑菇 Agaricus bisporus，其
菌丝生物量与其漆酶活力呈显著正相关（Matcham 
et  al.  1985）。糙皮侧耳 Pleurotus  ostreatus是典
型的木腐类食用菌，也是典型的白腐菌，能够产
生高活性的漆酶（laccase，Lac）、多功能过氧化
物酶（versatile  peroxidase，VP）和锰过氧化物酶
（mangnase peroxidase，MnP），不产木质素过氧
化物酶（lignin  peroxidase，LiP），但 VP 兼具 LiP
和 MnP的功能（Cohen et al. 2002）。因此，糙皮
侧耳除大规模用于生产食药用菌产品外（Wang et 
al. 2011；Chai et al. 2013a），还广泛用于生物制
浆（Martínez et al. 1994）、生物修复（Baldrian et 
al.  2000）和生物燃料生产中木质纤维素原料预处
理，已成为担子菌遗传和基因组研究的模式生物
（Castanera et al. 2013）。糙皮侧耳对秸秆的利用
率和菇产量与其漆酶的活力呈显著正相关（刘朝贵
等  2006）。 
糙皮侧耳木质素降解酶中研究比较多的是
Lac，已知糙皮侧耳可产生 9 种胞外 Lac 同工酶
（Pezzella et al. 2013），其中 POXC在所有培养条
件下都是产生最多的一种漆酶同工酶（Giardina et 
al.  1996）。漆酶的表达受基因表达水平的调节
（Palmieri et al. 2000）。因此，增加糙皮侧耳细胞
中漆酶编码基因的表达量将有可能提高漆酶的合
成量，从而提高糙皮侧耳对秸秆原料的利用率和子
实体的产量。另外，糙皮侧耳的漆酶也是其抵抗杂
菌木霉的主要的诱导抗性蛋白（Velázquez‐Cedeño 
et al. 2007）。所以，提高糙皮侧耳的漆酶活力还
可进一步提高其抗杂能力。 
提高糙皮侧耳木质纤维素降解酶活力的方法，
已报道的有紫外线、X‐射线或离子注入诱变双核菌
丝或单核菌丝（Chalamcherla  et  al. 2008；王力生
等  2009），原生质体再生（Homolka et al. 1995）
和转木质纤维素降解酶基因的同源表达（Tsukihara 
et  al.  2006）等。本文报道的是用构巢曲霉
Aspergillus nidulans的高效组成型启动子甘油醛‐3‐
磷酸脱氢酶基因（gpd）的启动子替代其 POXC 基
因的启动子，构建 POXC基因高表达突变株（图 1），
提高糙皮侧耳的木质纤维素降解能力。 
1 材料与方法 
1.1  菌株、DNA 和试剂 
糙皮侧耳天达 300（P. ostreatus Tianda 300），来
自河南省农业科学院食用菌工程中心。GLS基因启动
子替代同源重组片段（Chai et al. 2013a），本实验室
保存。Lipofectamine TM 2000，来自 Invitorgen公司。 
1.2  培养基 
PDA 培养基：马铃薯 200g（去皮切块加水煮
沸 20min用 4层纱布过滤取滤液），琼脂 20g，葡
萄糖 20g，蒸馏水 1  000mL。不加琼脂的为 PD 液
体培养基。RCM 再生培养基：蛋白胨 2.0g、酵母
粉 2.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO4 0.46g，KH2PO4 
1g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，甘露醇 109.3g，蒸馏
水 1 000mL，pH 7.0。LB培养基：蛋白胨 1g，酵母
抽提物 0.5g，NaCl  1g，去离子水 100mL；添加 2g
的琼脂即为 LB固体培养基。棉籽壳培养基：棉籽
壳 78%，麸皮 20%，石灰 1%，石膏 1%，含水量
65%，pH自然。 
刘冬忍 等 /启动子替代构建糙皮侧耳漆酶高产菌株
 
 
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1.3  同源重组片段的构建 
糙皮侧耳 POXC基因启动子替代同源重组片段
由 3个 DNA片段组成，POXC基因启动子部分序列
（PPOXC）、潮霉素抗性基因表达框（hph）+构巢曲
霉 gpd基因启动子（Pgpd）和 POXC基因上游部分
序列（POXC1245）（图 1）。PPOXC 克隆采用的引物是
PPOXC ‐F（5’‐AAGCCCTAGCGGGGCAGACCGA‐3’）和 PPOXC 
‐R（5’‐TAGTCGTTGGCAGAGAACGAAGCCGAATG‐3’），
根 据 糙 皮 侧 耳 PC15  v2.0 基 因 组 序 列
（http://genome.jgi‐psf.org/）设计，模板是天达 300
总 DNA，PCR扩增条件是 94℃预变性 5min，94℃ 
40s、55℃ 40s、72℃ 1min，共 30个循环，72℃延
伸 10min。PCR产物大小为 846bp。hph+Pgpd片段
克隆采用的引物是 HG‐F（5’‐CATTCGGCTTCGTTCT 
CTGCCAACGACTA‐3’）和 HG‐R（5’‐CCTGGAAACATCTG 
GTAGGTGTAGATGGAGTATGGATG‐3’），模板是葡聚糖
合酶基因（GLS）启动子替代同源重组片段，PCR
扩增条件是 94℃预变性 5min，94℃  1min、56℃ 
1min、72℃ 3min，共 30个循环，72℃延伸 10min。
PCR 产物大小为 5  028bp。POXC1245片段克隆采用
的引物是 PC‐F（5’‐CATCCATACTCCATCTACACCTACCA 
GATGTTTCCAGG‐3’）和 PC‐R（5’‐ATGACGAGCAAAGAG 
TGACCGTCGATCG‐3’），根据糙皮侧耳 PC15  v2.0 基
因组序列设计，模板是天达 300总 DNA，PCR扩增
条件是 94℃预变性 5min，94℃ 1min、60℃ 40s、
72℃ 1min，共 30个循环，72℃延伸 10min。PCR
产物大小为 1  245bp。该 3片段的融合采用降落‐
重叠 PCR 方法（柴冉等  2012），PCR 产物大小     
为 7.12kb。 
1.4  转化 
POXC 基因启动子替代同源重组片段转化糙皮
侧耳天达 300采用脂质体直接转化菌丝法（Chai et 
al.  2013b）。将在含 80µg/mL潮霉素的 PDA平板
上长出的菌落（拟转化子）转接到不含潮霉素的
PDA 平板上，27℃培养 7d，如此传 3 代。然后再
转接到含有 80µg/mL潮霉素的 PDA平板上，于 27℃
恒温培养 10d，能够生长的菌落即是转化子。 
1.5 PCR 鉴定 
将转化子的菌丝块转接于 PD液体培养基中，
27℃、150r/min摇床培养 7d，收集菌丝，采取 CTAB 
 
 
 
图 1  同源重组启动子替代突变株构建过程示意图      PPOXC，POXC基因启动子部分序列（846bp）；hph，潮霉素抗性基因表
达框；Pgpd，构巢曲霉 gpd基因启动子；POXC1245，POXC基因上游部分序列；POXC，糙皮侧耳 POXC基因. 
Fig. 1 The outline of  the construction of high  laccase producing  strain by homologous  recombination  for promoter swapping. 
PPOXC, the partiar sequence of POXC promoter (846bp); hph, hygromycin B resistance gene (hph) expression cassette; Pgpd, the 
gpd promoter of Aspergillus nidulans; POXC1245, the 5’ end partial sequence of POXC of Pleurotus ostreatus; POXC, POXC gene of 
Pleurotus ostreatus. 
   
  ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    May 22, 2016    Vol. 35    No. 5 
   
 
 
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法提取基因组 DNA，用 hph基因的特异性引物扩
增 hph 基因验证转化子。hph 基因扩增引物是
hph‐F （ 5’‐CTATTCCTTTGCCCTCGG‐3’ ） 和 hph‐R
（5’‐ATGAAAAAGCCTGAACTCACC‐3’），扩增条件是：
94℃预变性 5min，94℃ 40s、50℃ 1min、72℃ 1min，
共 30个循环，72℃延伸 10min。产物大小为 750bp。 
1.6  半定量 RT‐PCR 
采用 TRIzol法提取糙皮侧耳菌丝的总 RNA，利
用宝生物工程（大连）有限公司提供的 AMV 
Reverse  Transcriptase 试剂盒进行反转录，合成
cDNA 第一链。POXC 基因扩增用引物是 PCSQ‐F
（5’‐CCACCCCAGATAGTACCCTC‐3’）和 PCSQ‐R（5’‐AT 
TGATACCACCAACGAAGC‐3’），内参基因 β‐actin扩增
引物是 AC‐F（5’‐GATAGAACCACCAATCCAAAC‐3’）和
AC‐R（5’‐AAGTCATCACCATCGGTAACG‐3’），扩增产
物大小分别为 334bp 和 300bp。扩增条件均是：
94℃预变性 5min，95℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 45s，
共 26个循环，72℃延伸 10min。取 5µL  PCR产物
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统照相
并用 Gel Base/Gel Blot  Support软件分析各电泳条
带的灰度值。 
1.7  漆酶酶活力测定   
糙皮侧耳平板菌落漆酶活力测定采用愈创木
酚变色圈法（高玉千等  2009）。漆酶活力定量测
定采用 ABTS法（张银波等  2004）。收集 PDA平板
中糙皮侧耳的气生菌丝、PD 液体培养基摇瓶培养
（27℃、150r/min）10d的上清液和试管棉籽壳培
养基菌丝培养料，定义 1min氧化 1μmol ABTS所需
的酶量为一个酶活力单位（U）。 
1.8  出菇实验 
采用 15cm×32cm规格高密度低压聚乙烯薄膜
塑料袋栽培，每袋装棉籽壳培养料 0.5kg。高压灭
菌、待冷却后于两端接种，每个处理接种 20袋。
菌种为棉籽壳栽培种，接种量 10%。制种和栽培管
理均按常规方法进行。 
1.9  木质素含量测定 
糙皮侧耳棉籽壳培养料中木质素含量的测定
采用范氏（Van  Soest）的洗涤纤维分析法（Van 
Soest 1963）。 
2 结果与分析 
2.1 POXC 启动子替代同源重组片段的构建   
以平菇天达 300的基因组 DNA和 GLS启动子
替代同源重组片段为模板，PCR 扩增得到构建
POXC 启动子替代同源重组片段的 3 个 DNA 片段
PPOXC、POXC1245和 hph+Pgpd（图 2A）。通过降落‐
重叠 PCR将该 3片段融合得到 POXC启动子替代同
源重组片段（图 2B）。 
 
 
 
图 2  3 个 DNA 片段的 PCR 扩增结果及其降落‐重叠 PCR 扩
增结果      A：DNA片段 PPOXC、POXC1245和 hph+Pgpd的 PCR
扩增结果. 1：POXC1245；2：hph+Pgpd；3：PPOXC. B：3个 DNA
片段的降落‐重叠 PCR扩增结果. 1：3个片段的融合产物. 
M：1kb plus DNA Marker. 
Fig.  2  PCR  amplification  result  of  the  three  DNA  segments 
and  the  touchdown‐overlap  extension  PCR  amplification 
result of three DNA segments. A: The PCR amplification result; 
1: POXC1245; 2: hph+Pgpd; 3: PPOXC. B: The touchdown‐overlap 
extension PCR amplification result. 1: The fusion fragment of 
the three DNA segments. M: 1kb plus DNA Marker. 
刘冬忍 等 /启动子替代构建糙皮侧耳漆酶高产菌株
 
 
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2.2  POXC 启动子替代同源重组转化子鉴定及其
POXC 基因表达水平的半定量 RT‐PCR 分析 
随机挑选 4 个经在 PDA 培养基中传代 3 次后
能够在含潮霉素的 PDA 平板中生长的转化子，以
其总 DNA为模板，以 hph 特异性引物进行扩增，
均能得到预期的 PCR产物（图 3A），表明 hph基
因已经整合到转化子的基因组中。为检测启动子替
代对转化子 POXC 基因表达水平的影响，提取该 4
个转化子的总 RNA，进行半定量 RT‐PCR 分析，与
出发菌株相比，4 个转化子的 POXC 基因表达水平
均显著提高，提高幅度在 0.72–3倍（图 3B）。 
 
 
 
图 3  转化子中 hph 基因 PCR 鉴定及其 POXC 基因表达的半
定量 RT‐PCR 分析      A：hph基因 PCR结果；B：POXC基因
表达量的半定量 RT‐PCR分析. M：1kb plus DNA Marker；WT：
出发菌株；1–4：转化子. **P<0.01.   
Fig.  3  PCR  identification  of  hph  gene  and  the  analysis  of 
semi‐quantitative  RT‐PCR  for  the  POXC  expression  in  the 
transfomants.  A:  PCR  identification  of  hph  gene;  B: 
Semi‐quantitative RT‐PCR analysis of the POXC expression. M: 
1kb  plus  DNA Marker; WT: Wild  type;  1–4:  Transformants; 
**P<0.01 comparing to WT. 
2.3  转化子漆酶活力 
在添加愈创木酚的 PDA培养基中培养 7d，糙
皮侧耳出发菌株和选取的 4 个转化子都能观察到
清晰的愈创木酚被氧化产生的红褐色变色圈，转化
子的变色圈直径和色深明显高于出发菌株（图 4A）。 
 
 
 
图 4  转化子漆酶活力测定      A：愈创木酚变色圈法测定的
PDA平板菌落漆酶活力；B：PDA平板中气生菌丝漆酶活力
定量测定结果；C：PD培养基摇瓶培养上清液中漆酶活力定
量测定结果；D：试管棉籽壳培养料固体培养漆酶活力测定
结果. *P<0.05. 
Fig.  4  The  determination  of  the  transformant  laccase 
activities.  A:  Laccase  activities  of  PDA  plate  colony 
determinated by guaiacol color‐changing method; B: Laccase 
activities  of  mycelia  cultured  on  PDA  plate;  C:  Laccase 
activities of the PD culture supernatant; D: Laccase activities 
of  the  transformant  culturvated  in  cottonseed hull medium. 
*P<0.05. 
   
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取平板中的气生菌丝测定漆酶活力，3个转化子的漆
酶活力比出发菌株提高了 1.7–2倍（P<0.05）（图 4B）。
PD 培养液上清中的漆酶活力，4 个转化子比出发
菌株提高了 2.4–3.5倍（P<0.05）（图 4C）。试管棉
籽壳培养基固体培养，3个转化子的漆酶活力比出
发菌株提高了 1.5–2.2倍（P<0.05）（图 4D）。 
2.4  转化子菇产量及对木质素的利用 
选取 4号转化子和出发菌株进行出菇实验，转
化子菌丝满袋时间比出发菌株早 2d，原基形成时
间早 3d，第 1 和第 2 茬菇产量比出发菌株提高
16.2%（P<0.05），培养料中木质素含量显著降低
21%（P<0.05）（图 5）。 
 
 
 
图 5  棉籽壳栽培转化子第 1和第 2茬菇产量及培养料中的
木质素含量      WT：出发菌株；No. 4：转化子；*P<0.05. 
Fig.  5  The  yield  of  the  1st  and  2nd  flesh mushroom  of  the 
transformant  and  the  lignin  content  in  cottonseed  hull 
medium.  WT:  Wild  type;  No.  4:  Transformant  No.  4;           
*P<0.05. 
3 讨论 
与其他担子菌一样，糙皮侧耳的木质纤维素降
解酶系是由多种酶组分构成的。在选育木质纤维素
降解酶高活力菌株时，诱变育种往往以对木质纤维
素总的降解能力（Chalamcherla  et  al. 2008）或总
的漆酶活力（Homolka et al. 1995；王力生等  2009）
为指标，分子育种时则以某一种酶基因的高表达为
指标（Tsukihara et al. 2006）。本研究是以提高一
种木质纤维素酶 POXC的高表达为指标进行的分子
育种。研究表明，将糙皮侧耳 ATCC 66376的 mnp2
基因的表达框（启动子和终止子来自糙皮侧耳的
sdi基因）转入到该菌株中，构建的转化子 MnP活
力提高 4 倍多，且降解苯并（α）芘的能力提高 2
倍多（Tsukihara et al. 2006）。类似地，用白腐菌
Phanerochaete  sordida 的高表达基因 bee2 的启动
子调控其锰过氧化物酶基因 mnp4进行同源表达，
转化子的 MnP 活力和木质素降解能力均大幅度提
高（Sugiura et al. 2012）。本研究也表明，用构巢
曲霉的组成型强启动子 gpd 启动子替代糙皮侧耳
的 POXC基因的启动子，构建的转化子漆酶活力提
高 1.5倍以上，对木质素的降解能力也显著提高。
表明提高担子菌的一种主要的木质纤维素降解酶
组分的表达，能够提高其对多环芳烃或木质纤维素
的降解能力，相关机理还有待进一步研究。 
随着分子生物学技术的不断发展而建立起来
的微生物代谢工程技术为构建高产微生物菌种提
供了新的策略。代谢工程是用重组 DNA 技术来操
纵细胞的酶运输和调节功能，从而改进细胞的活性
（Bailey 1991）。即通过基因工程手段，对某些生
化反应关键酶的表达进行调控，使代谢流分配发生
较大改变，达到某种代谢物超量生产，提高产率的
目的。代谢工程的重要策略之一是启动子工程，采
用内源启动子突变或外源启动子替代来调节代谢
途径关键酶的表达，使产物产量最大化，已在细菌
和酵母菌中应用取得了成功（McCleary 2009；Yadav 
et al. 2012），但在丝状真菌中的报道还较少。我
们曾用构巢曲霉的 gpd 启动子替代糙皮侧耳的葡
聚糖合酶基因（GLS）的启动子，转化子 GLS基因
表达量比出发菌株高 1–3倍，多糖产量比出发菌株
提高 32%–131%，基因表达量与多糖产量之间存在
显著的正相关。多糖的红外光谱与出发菌株相同，
均具有典型的 β‐葡聚糖特征吸收峰（Chai  et  al. 
2013）。启动子替代构建高产工程菌与基因同源
表达或异源表达构建工程菌相比，可能具有以下优
刘冬忍 等 /启动子替代构建糙皮侧耳漆酶高产菌株
 
 
菌物学报 
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点：1）能够有效提高目标基因的表达量和相关产
量性状；2）不改变菌株原有的代谢途径和产物分
泌途径；3）不易发生转基因沉默。但需要面对的
问题是，过量转录的 mRNA 可能不稳定，影响目
标基因的过量表达和相关产量性状的进一步提高。 
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（本文责编：王敏）