全 文 ：2013 年 3 月 第 15 卷 第 3 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Mar. 2013 Vol. 15 No. 3
△ ［基金项目］ 江苏省重大项目(BM2010610)江苏省农业种质资源保护与利用平台———道地药材标准物质与特征图谱库
* ［通讯作者］ 朱玲英，Tel: (025)85639640 E-mail:zhuly818@ 163. com
江苏细柱五加果实指纹图谱研究
△
朱玲英1* ，张正光1，2，钱士辉1，2
(1. 江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028;2. 南京中医药大学，江苏 南京 210046)
［摘要］ 目的:研究建立江苏细柱五加果实中三萜皂苷类成分 HPLC-ELSD 指纹图谱分析方法，为其质量控
制和药材鉴别提供依据。方法:采用 HPLC-ELSD色谱法，使用 AlltimaTM-C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，流
动相为乙腈 －甲醇-0.5%醋酸水，梯度洗脱，流速为 1. 0 mL·min －1，柱温为 35 ℃。ELSD检测器条件:漂移管温度
106 ℃，载气为氮气，流速为 2. 9 L·min －1，进样 20 μL。结果:在选定的色谱条件下确定 14 个共有峰，各批次药
材均具有上述特征，但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。确定了细柱五加果实中 2 个三萜皂
苷类成分，相对保留时间 31 min为 chikusetsusaponinⅣa峰(10 号) ，相对保留时间 50 min为 3β-(［O-β-D-glucopyranu-
ronosyl］ oxy)-olean-12-ene-28-olc acid峰(14号) ，不同批次的10批细柱五加果实中HPLC-ELSD指纹图谱特征峰分离
度好，谱峰匹配一致。结论:该方法准确、简单、稳定，其色谱指纹图谱可用于江苏细柱五加果实的鉴别和质量
控制。
［关键词］ 资源化学;细柱五加果;三萜皂苷;HPLC-ELSD;指纹图谱
细柱 五 加 果 实 为 五 加 科 植 物 细 柱 五 加
Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith 的干燥成熟果
实。秋季果实成熟时采收。味甘，微苦，性温。
《中华本草》记载具有补肝肾，强筋骨功效。主治
小儿亏虚，筋骨痿软、小儿迟行等症［1］。李春芳
等［2］测定了短梗五加果提取物中总黄酮、总酚及 3
种指标成分含量。何方奕等［3］测定了无梗五加果中
总香豆素和 6，7 二甲氧基香豆素含量。近几年来课
题组对细柱五加茎、叶以及果实进行了较为系统的
研究［4-9］。目前尚无关于细柱五加果实中三萜皂苷类
成分的指纹图谱文献报道，为了加强对江苏细柱五
加资源的综合开发利用，作者对细柱五加果三萜皂
苷类指纹特征进行了研究。本文首次采用 HPLC-
ELSD法测定了来自江苏省盱眙县的 10 个批次细柱
五加果实的指纹图谱，并对细柱五加果实中的三萜
皂苷类主要成分进行指认，以期为细柱五加果药材
真伪及其制剂质量控制提供有效检测方法。
1 材料
1. 1 仪器
Waters 2695 高效液相色谱仪;Alltech ELSD-
2000ES蒸发光散射检测器;Empower 色谱工作站;
Mettler万分之一、十万分之一电子天平;Buchi R-
200 旋转蒸发仪;Milli-Q纯水器。
1. 2 材料
对照品:化合物 chikusetsusaponinⅣ a 和 3β-
(［O- β-D-glucopyranu-ronosyl］ oxy)-olean-12-ene-
28-olc acid均由本研究院中药化学研究室提供，纯
度均大于 98%。乙腈(色谱纯，美国 TEDIA 试剂公
司) ，甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司) ，其
他试剂均为分析纯。
细柱五加果实药材 10 批均采购于江苏省盱眙
县，经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为五
加 科 植 物 细 柱 五 加 Acanthopanax gracilistylus
W. W. Smith的干燥成熟果实。
2 方法
2. 1 色谱条件
色谱柱:AlltimaTM-C18 色谱柱(250 mm × 4. 6
mm，5 μm) ;流动相:A 为乙腈，B 为甲醇，C 为
0. 5%醋酸，三相梯度洗脱，洗脱顺序见表 1。ELSD
漂移管温度:106 ℃;载气:氮气，流速:2. 9 L·
min －1;放大系数:1;撞击器:关闭。流速:1. 0
mL·min －1，进样量:20 μL;柱温:35 ℃。
·191·
DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2013.03.017
2013 年 3 月 第 15 卷 第 3 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Mar. 2013 Vol. 15 No. 3
表 1 流动相梯度表
/%
时间 /min 乙腈(A) 甲醇(B) 0. 5%醋酸(C)
1 3 65 32
2 3 55 42
8 8 47 45
18 13 35 52
48 15 20 65
50 15 18 67
55 3 65 32
70 3 65 32
2. 2 混合对照品溶液的制备
分别精密称取对照品 chikusetsusaponinⅣa(A)
和 β-( ［O-β-D-glucopyranu-ronosyl］ oxy)-olean-12-
ene-28-olc acid(B)适量，置 5 mL 容量瓶中，以甲
醇溶 解 稀 释 并 定 容 至 刻 度，浓 度 分 别 为
chikusetsusaponinⅣ a 0. 107 mg·mL －1，β-( ［O-β-D-
glucopyranu-ronosyl］ oxy)-olean-12-ene-28-olc acid
0. 103 mg·mL －1的混合对照品溶液。
2. 3 供试品溶液制备
称取干燥药材细粉(过 40 目筛)5. 0 g 于滤纸
筒内，置于索氏提取器中，加石油醚(60 ～ 90 ℃)
100 mL，加热回流提取至无色，弃去石油醚液。药
渣挥干溶剂，再加甲醇 100 mL，提取 4 h，回收甲
醇，浓缩提取液，残渣用甲醇转移并定容至 5 mL量
瓶内，摇匀，过 0. 45 μm微孔滤膜，即得。
3 指纹图谱的建立
3. 1 测定方法
精密吸取对照品溶液和供试品溶液 20 μL，分
别注入高效液相色谱仪，按 2. 1 项色谱条件分析得
到色谱图，考察 70 min 供试样品的色谱分离情况。
结果表明 60 min后无色谱峰出现，故确定图谱分析
时间为 60 min，见图 1。
3. 2 精密度试验
精密称取 1号药材样品细粉，按 2. 3 项下制得供
试品溶液，按 2. 1 项色谱条件进样 20 μL 进行分析，
连续进样 6次，记录色谱图。以 10 号峰为参照峰考
察各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性，结
果显示各特征峰相对保留时间的 RSD 为 0. 05% ～
1. 69%。，相对峰面积的 RSD 为 0. 42% ～ 2. 9%，说
明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定的要求［10］。
3. 3 稳定性试验
精密称取 1 号药材细粉，按 2. 3 项下制得供试
A. chikusetsusaponinⅣa
B. β-( ［O-β-D-glucopyranu-ronosyl］oxy)-olean-12-ene-28-olc acid
图 1 细柱五加果 HPLC-ELSD指纹色谱图
品溶液，按 2. 1 项色谱条件进样 20 μL，分别于 0，
2，4，8，12 h进样分析检测，记录色谱图。结果表
明各特征峰相对保留时间的 RSD为 0. 05% ～ 1. 8%，
相对峰面积的 RSD 为 1. 29% ～ 3. 5%。表明供试品
溶液在常温下 12 h 内稳定，符合指纹图谱分析
要求。
3. 4 重复性试验
精密称取同一批号药材细粉 6 份，按 2. 3 项下
制得供试品溶液，按 2. 1 项色谱条件进样 20 μL，
分析检测记录色谱图，考察各特征峰相对保留时间
及相对峰面积的一致性，结果各特征峰相对保留时
间 RSD为 0. 1% ～0. 9%，相对峰面积 RSD为 2. 1%
～2. 9%，结果表明方法重复性良好。
3. 5 样品指纹图谱测定
分别精密称取不同批号药材细粉，按 2. 3 项方
法制得供试品溶液，按 2. 1 项色谱条件进样 20 μL，
分析测定。确定共有峰 14 个，根据对照品对照指认
31 min为 chikusetsusaponinⅣa峰(10 号) ，保留时间
50 min 为 3β-( ［O-β-D-glucopyranu-ronosyl］ oxy)-
olean-12-ene-28-olc acid 峰(14 号)。因 10 号峰为有
效成分峰且分离度较好，因此选其为参比峰，以其
各色谱峰对参比峰的相对保留时间、相对峰面积进
行定性。通过 10 批样品的指纹图谱测定，相对保留
时间、相对峰面积见表 2 和表 3。10 批样品指纹色
谱图见图 2。由图 2 可知，通过指纹图谱可以比较
全面地反映细柱五加果药材化学成分以及各特征性
有效成分间峰面积的相对比例，进而反映细柱五加
果实的内在质量。
3. 6 相似度计算
相似度评价是指纹图谱用于中药质量评价和质
量控制的重要环节，本文运用国家药典委员会开发
的中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A 版对
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2013 年 3 月 第 15 卷 第 3 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Mar. 2013 Vol. 15 No. 3
表 2 10 批细柱五加果样品相对保留时间
/min
峰
号
批 次
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086 0. 086
2 0. 356 0. 356 0. 356 0. 356 0. 358 0. 358 0. 362 0. 362 0. 363 0. 363
3 0. 438 0. 438 0. 438 0. 438 0. 439 0. 439 0. 443 0. 443 0. 444 0. 444
4 0. 647 0. 647 0. 647 0. 647 0. 647 0. 647 0. 650 0. 650 0. 650 0. 650
5 0. 697 0. 697 0. 697 0. 697 0. 697 0. 697 0. 698 0. 698 0. 699 0. 699
6 0. 748 0. 748 0. 748 0. 748 0. 749 0. 749 0. 749 0. 749 0. 750 0. 750
7 0. 822 0. 822 0. 821 0. 821 0. 822 0. 822 0. 823 0. 823 0. 823 0. 823
8 0. 842 0. 842 0. 842 0. 842 0. 843 0. 843 0. 844 0. 844 0. 844 0. 845
9 0. 931 0. 931 0. 931 0. 931 0. 931 0. 931 0. 931 0. 962 0. 963 0. 963
10 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
11 1. 036 1. 036 1. 034 1. 034 1. 034 1. 034 1. 034 1. 034 1. 035 1. 035
12 1. 109 1. 109 1. 108 1. 108 1. 108 1. 108 1. 107 1. 107 1. 107 1. 107
13 1. 475 1. 475 1. 472 1. 472 1. 472 1. 472 1. 470 1. 470 1. 470 1. 469
14 1. 615 1. 615 1. 612 1. 612 1. 611 1. 611 1. 609 1. 609 1. 609 1. 608
表 3 10 批细柱五加果样品相对峰面积
峰
号
批 次
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 2. 417 2. 423 2. 526 2. 436 2. 310 2. 310 2. 428 2. 428 2. 400 2. 381
2 0. 041 0. 041 0. 050 0. 050 0. 048 0. 048 0. 047 0. 047 0. 039 0. 049
3 0. 027 0. 027 0. 030 0. 020 0. 027 0. 027 0. 026 0. 026 0. 026 0. 027
4 0. 020 0. 020 0. 018 0. 018 0. 018 0. 018 0. 020 0. 020 0. 018 0. 020
5 0. 047 0. 047 0. 077 0. 077 0. 080 0. 080 0. 056 0. 056 0. 058 0. 057
6 0. 085 0. 085 0. 088 0. 088 0. 085 0. 085 0. 082 0. 082 0. 082 0. 082
7 0. 083 0. 083 0. 088 0. 088 0. 085 0. 081 0. 082 0. 082 0. 081 0. 082
8 0. 652 0. 652 0. 699 0. 699 0. 686 0. 682 0. 694 0. 694 0. 693 0. 681
9 0. 079 0. 079 0. 086 0. 086 0. 083 0. 083 0. 083 0. 083 0. 084 0. 082
10 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
11 0. 044 0. 044 0. 029 0. 029 0. 027 0. 027 0. 026 0. 027 0. 027 0. 027
12 0. 016 0. 016 0. 018 0. 018 0. 019 0. 019 0. 018 0. 018 0. 018 0. 018
13 0. 123 0. 123 0. 145 0. 145 0. 134 0. 134 0. 135 0. 135 0. 134 0. 013
14 0. 874 0. 874 1. 040 1. 040 0. 984 0. 984 1. 223 1. 223 1. 196 1. 178
图 2 10 批细柱五加果 HPLC-ELSD指纹图谱
10 个江苏同产地不同批号五加果药材的指纹图谱进
行相似度分析，选定上述 14 个共有峰进行谱峰匹
配，得出指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为
标准，进行整体相似度评价。1 ～ 10 批药材相似度
分 别 为 0. 998， 0. 997， 0. 999， 0. 998， 0. 999，
0. 997， 0. 984， 0. 992， 0. 977， 0. 991， 均 大 于
0. 977，说明这 10 批样品的化学成分一致性较好。
4 讨论
4. 1 提取溶剂与提取方法的选择
在供试品溶液制备条件选择上，脱脂溶剂曾比
较乙醚、石油醚等溶剂;在提取溶剂选择上，比较
了不同比例甲醇、乙醇，结果表明样品用 60 ～ 90 ℃
石油醚脱脂，纯甲醇提取，所测的色谱图杂峰少、
有效成分浓度高;在提取方法的选择上，选择用
60 ～ 90 ℃石油醚脱脂，甲醇作溶剂，对比回流提
取、索氏提取与超声提取 3 种提取方法。三者
HPLC图谱基本一致，从主要色谱峰的积分面积和
杂峰干扰上可见索氏提取的效率明显高于超声提取
与回流提取，因此选择采用索氏提取法。在索氏提
取下比较 2，4，6 h不同提取时间，结果提取 4 h有
效峰面积不再增加，确定 4 h为提取时间。
4. 2 流动相的选择
在流动相的选择试验过程中，最初采用的甲
醇 －水、乙腈 －水、乙腈 －甲醇 －水，乙腈 －甲醇
-0. 5%醋酸水，发现在酸性条件下峰形分离好，在
酸性条件下比较了等度流动相未得到满意的分离效
果，然后又选择了不同梯度的流动相体系，最终确
定以本实验所采用的乙腈 －甲醇-0. 5%醋酸水梯度
洗脱，使各色谱峰基本能基线分离，峰形对称。
4. 3 特征峰的确定
对不同批号 10 批样品所得指纹图谱进行分析，
选择稳定性较好、吸收强、特征明显的色谱峰为共
有峰，共标定了 14 个共有峰。每批五加果样品均有
这 14 个共有峰。根据对照品指认，确认 31 min 为
chikusetsusaponinⅣa峰(10 号) ，50 min为 3β-( ［O-
β-D-glucopyranu-ronosyl］ oxy )-olean-12-ene-28-olc
acid峰(14 号)。表明在不同批次间样品主要特征较
一致，相对峰面积稍有不同。
4. 4 方法评价
五加果药材三萜皂苷类成分使用常规紫外检测
器检测，灵敏度偏低无法有效检测，采用一种通用
型质量检测器 ELSD 进行检测，响应不依赖于样品
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的光学特性，能分析任何挥发性低于流动相的化合
物，对激光散射能力相同，可以给出一致的响应。
这一特征较经典的紫外检测有较大优势，更能真实
地反映样品的组成情况［11］。本实验采用 HPLC-
ELSD技术对五加果药材三萜皂苷类成分进行指纹
图谱的研究，并且能在多溶剂梯度的情况下获得稳
定的基线，使得分辨率更好、分离速度更快。检测
中漂移管温度和载气流速的选择是其检测的关键，
本实验经比较最终确定漂移管温为 106 ℃、载气流
速 2. 9 L·min －1作为检测条件，在该条件下各组分峰
形好，灵敏度高。本实验用供试液原液过滤后直接
进样，建立了五加果药材中三萜皂苷类成分的
HPLC-ELSD指纹图谱的研究。通过指纹图谱可以比
较全面地反映五加果药材的化学成分以及各特征性
有效成分间峰面积的相对比例，进而反映五加果药
材的内在质量，为五加果药材真伪判断、优劣评价、
稳定性和质量一致性考察提供了有效手段。
参考文献
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Study on the HPLC-ELSD Fingerprints of Triterpenoid Saponins in Acanthopanax gracilistylus Fruits
ZHU Ling-ying1*，ZHANG Zheng-guang1，2，QIAN Shi-hui1，2
(1. Jiangsu Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China;
2. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210046，China)
［Abstract］ Objective:To establish HPLC-ELSD fingerprints of triterpenoid saponins for quality control and
authentication of the crude drug of Acanthopanax gracilistylus fruits. Methods:HPLC-ELSD method was developed.
For HPLC，the Alltima C18column (250 mm ×4. 6 mm，5 μm)was used. The mobile phase consisted of acetonitrile，
methanol and 0. 5 % acetic acid aqueous solution with gradient elution，and the flow rate was 1. 0 mL·min －1 . The
column temperature was maintained at 35 ℃;For ELSD，the temperature of drift tube was 106 ℃，and flow rate of
the carrier gas (nitrogen)was set at 2. 9 L·min －1 . The injection volume was 20 μL. Results:Under the present
chromatographic conditions，14 common peaks were selected as the characteristic peaks for fingerprints. All tested
samples possessed the above characteristic peaks，but the relative peak areas of these peaks were different in various
samples，leading to the diversities of their general chromatographic fingerprints. The specific peaks at relative
retention time of 31 min (chikusetsusaponinⅣa)and 50 min {3β-(［O-β-D-glucopyranuronosyl］oxy)-olean-12-ene-
28-olc acid}were confirmed to be oleanane type triterpenoid saponins. The HPLC-ELSD fingerprints for 10 different
batches of samples showed high similarities with respect to the characteristic peaks. Conclusion:The method is
accurate，simple and consistent，and can be used for the authentication and quality control of Acanthopanax
gracilistylus fruits.
［Key words］ Acanthopanax gracilistylus fruits;Triterpenoid saponins;HPLC-ELSD;Fingerprint
( 收稿日期 2012-09-12)
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