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菌物学报   
jwxt@im.ac.cn 15 May 2015, 34(3): 456‐464 
Http://journals.im.ac.cn  Mycosystema ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q © 2015 IMCAS, all rights reserved. 
 
研究论文 Research paper      DOI: 10.13346/j.mycosystema.140057 
 
                                                                 
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS 24）；中国农业科学院科技创新工程 
*Corresponding author. E‐mail: huqingxiu@caas.cn 
收稿日期：2014‐02‐25，接受日期：2014‐04‐29 
 
白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究 
杨娟      邹亚杰      张瑞颖      胡清秀* 
中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京  100081 
 
 
摘    要：为了探索白灵侧耳 Pleurotus eryngii var. tuoliensis 漆酶性质，以白灵侧耳菌株 00485 为试验材料，从发酵液中分
离纯化得到胞外漆酶并对其酶学性质进行测定。纯化流程依次为 DEAE‐Cellulose 阴离子交换层析，CM‐Cellulose 阳离子交
换层析，SP‐Sepharose 强阳离子交换层析以及 Superdex 75 凝胶过滤层析，获得胞外白灵侧耳漆酶（PnLac）。SDS‐PAGE 检
测结果表明 PnLac 为 65kDa 的单一蛋白。PnLac 经过胰蛋白酶水解得到 3 种肽段，经过 NBCI‐BLAST 后发现它们与糙皮侧耳、
环柄韧伞、刺芹侧耳等的漆酶具有同源性。底物为 2,2ʹ‐联氮‐二(3‐乙基‐苯并噻唑‐6‐磺酸)二铵盐（ABTS）时该种漆酶的最
适反应温度和 pH 分别为 50℃和 3.0，Ca2+和 Hg2+能够抑制它的活性，相反地 Cu2+和 Mn2+能够提高它的活性，米氏常数 Km
和 Vmax分别是 0.17mmol/L 和 1.76OD/min/U。 
关键词：白灵侧耳，漆酶，分离纯化，酶活 
 
 
Purification and property of laccase from Pleurotus eryngii var. tuoliensis 
YANG Juan      ZOU Ya‐Jie      ZHANG Rui‐Ying      HU Qing‐Xiu* 
Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China 
 
Abstract: An extracellular  laccase from the culture broth of Pleurotus eryngii var. tuoliensis 00485 mycelia was  isolated and  its 
characterization  was  determined.  The  purification  procedure  was  involved  in  exchange  chromatography  on  DEAE‐cellulose, 
CM‐cellulose,  and  SP‐Sepharose,  and  gel  filtration  on  Superdex  75.  The  laccase was  designed  as  PnLac.  SDS‐PAGE  detection 
showed PnLac was a monmeric protein of 65kDa. Three amino acid sequences were obtained after  tryptic digestion of PnLac, 
and  they  exhibited  some  similarity  to  those  of  laccases  from  the mushrooms  Pleurotus  ostreatus,  Lentinus  sajur‐caju  and 
Pleurotus  eryngii  by  NBCI‐BLAST.  Its  optimum  pH  and  temperature  were  3.0  and  50°C  for  ABTS 
[2,2´‐azinzo‐bis(3‐ethylbenzothiazoline‐6‐sulfonic acid) diammonium salt], respectively. The laccase activity was inhibited by Ca2+ 
and Hg2+ while increased by Cu2+ and Mn2+. The Km and Vmax values of PnLac was 0.17mmol/L and 1.76OD/min/U, respectively. 
Key words: Pleurotus eryngii var. tuoliensis, laccase, isolation and purification, enzyme activity 
 
 
 
 
 
 
 
 
漆酶（benzenediol: oxygen oxidoreductase，EC  1.10.3.2）代表着蓝色多铜氧化酶（MCO）中的最
 
杨娟 等 /白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究                 
 
 
菌物学报 
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大的一个亚群（Solomon  et al. 1996），能直接利
用铜离子的氧化还原能力催化多种芳香类化合物
的氧化并伴随着氧分子还原成为水。在其活性中心
有一个由 4 个铜离子组成的特殊结构，根据磁学和
光谱学性质不同这 4 个铜离子分别为Ⅰ型 Cu2+和
Ⅱ型 Cu2+各一个，Ⅲ型 Cu2+两个（Farver  et  al. 
2011）。漆酶广泛地分布在植物和真菌以及部分
细菌中，已经表明在多种真菌中具有漆酶活性并且
有几十种漆酶已经被分离纯化了出来，其中真菌中
的白腐真菌几乎全部都能够不同程度的产生漆酶
（Hatakka 2001；司静等 2011a，2011c）。植物漆
酶参与合成木质素多聚体，而真菌漆酶却在自然界
中木质素的降解中起着关键性的作用（Baldrian 
2006；司静等 2011b）。Ander & Eriksson（1976）
的实验表明漆酶缺失会削弱嗜温型粉状侧孢霉
Sporotrichum pulverulentum Novobranova 降解木质
素的能力，而漆酶回复突变菌株的降解木质素的能
力又恢复了；白腐真菌朱红秘孔菌 Pycnoporus 
cinnabarinus 中漆酶是它产生的唯一一种能够降解
木质素的降解酶类（Eggert et al. 1996），都证明
漆酶分解木质素的生理作用。研究表明侧耳属的多
种菌株如糙皮侧耳 Pleurotus ostreatus (Jacq.) Quél.
（Palmieri et al. 1997；Palmieri et al. 2003）、美味
侧 耳 Pleurotus  sapidus  (Schulz.)  Sacc
（Puthirasigamany et al. 2013）、肺形侧耳 Pleurotus 
pulmonarius (Fr.) Singer（Souza & Peralta 2003）、刺
芹侧耳 Pleurotus  eryngii  (DC.) Quél.（Muñoz  et al. 
1997）等在菌丝生长时都能够分泌漆酶到胞外，漆
酶活性的增加与菌丝的快速生长以及原基、子实体
的形成密切相关（Leatham 1985；Nagai et al. 2003）。 
白 灵 侧 耳 Pleurotus  eryngii  var.  tuoliensis 
(Inzenga) Quél.是自上世纪 90年代以来我国规模化
商业栽培的珍稀食用菌，其肉质肥厚、味道鲜美且
营养丰富，受到消费者亲睐（Guo et al. 2007）。据
中国食用菌协会统计，2011 年全国白灵侧耳鲜品
产量已达到 31 万吨，市场潜力巨大，发展前景广
阔。漆酶的活性与白灵侧耳生长发育密切相关，周
长青等（2008）报道白灵侧耳漆酶活性变化随生长
周期具有明显的阶段性，本实验室对基质中胞外酶
活性测定结果显示，白灵侧耳的漆酶活性在菌丝快
速生长期至长满菌袋期间，表现较高的酶活力，特
别是菌袋内菌丝长满后（28d）达到最高值 33.48U；
子实体生长期间漆酶活性逐渐下降，从 12.49U降至
0.74U。本文采用液体培养方式，从发酵液中分离纯
化白灵侧耳胞外漆酶 PnLac，并对其性质进行了研
究，为以后白灵侧耳产业的发展提供科学依据。 
1  材料与方法 
1.1  材料 
1.1.1  供试菌株：白灵侧耳——中农翅鲍，编号
00485，由国家食用菌标准菌株库（China Center for 
Mushroom Spawn Standards and Control，CCMSSC）
提供。 
1.1.2  培养基（g/L）：酵母浸粉 8，葡萄糖 20，MgSO4 
0.4，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CuSO4 0.05。 
1.2  方法 
1.2.1  白灵侧耳漆酶粗酶液的制备：将生长于 PDA
固体斜面上的白灵侧耳 00485 菌株接种到上述液
体培养基中，置于摇床（25℃，110r/min）中摇瓶
培养。每天吸取少量发酵液测定漆酶酶活，等到发
酵液中漆酶活性开始下降时停止培养。发酵液用 4
层纱布过滤，取滤液导入 7kDa 的透析袋中，以 4
倍于发酵液体积的去离子水在 4℃下透析，每隔 4h
换一次水，透析 4 次后所得菌液即为漆酶粗样品，
用于后续的分离纯化。 
1.2.2  DEAE‐Cellulose 阴 离 子 交 换 层 析 ：
DEAE‐Cellulose 层析柱（5cm×20cm）用 10mmol/L 
Tris‐HCl（pH6.9）平衡。粗样品经 10  000r/min 离
心 20min 后取上清液，然后用 1mol/L  Tris‐HCl
（pH6.9）将它调至 10mmol/L，pH6.9 后上样。上
完样后分别用 10mmol/L  Tris‐HCl（ pH6.9），
10mmol/L  Tris‐HCl（ pH6.9） +50mmol/L  NaCl，
 
    ISSN1672‐6472    CN11‐5180/Q    Mycosystema    May 15, 2015    Vol. 34    No. 3 
     
 
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10mmol/L  Tris‐HCl（pH6.9）+150mmol/L  NaCl，
10mmol/L  Tris‐HCl（pH6.9）+300mmol/L  NaCl，
10mmol/L Tris‐HCl（pH6.9）+1mol/L NaCl 进行分段
洗脱，流速为 4mL/min，用部分收集器收集洗脱液，
每管 10mL，然后测定每只管洗脱液在 280nm 处的
吸光值，根据吸光值测定各分段洗脱液的漆酶活
性，合并有活性组分充分透析，得到 PnLac1。 
1.2.3  CM‐Cellulose 阳离子交换层析：CM‐Cellulose
层析柱（ 2.5cm×20cm）用 10mmol/L  HAc‐NaAc
（ pH4.2）缓冲液平衡，将 PnLac1 用 1mol/L 
HAc‐NaAc（pH4.2）调至 10mmol/L，pH4.2 后上样。
上完样后分别用 10mmol/L  HAc‐NaAc（pH4.2），
10mmol/L  HAc‐NaAc（pH4.2）+50mmol/L  NaCl，
10mmol/L  HAc‐NaAc（pH4.2）+150mmol/L  NaCl，
10mmol/L  HAc‐NaAc（pH4.2）+300mmol/L  NaCl，
10mmol/L HAc‐NaAc（pH4.2）+1mol/L NaCl 进行分
段洗脱，流速为 4mL/min，用部分收集器收集洗脱
液，每管 10mL，然后测定每只管洗脱液在 280nm
处的吸光值，根据吸光值测定各分段洗脱液的漆酶
活性，合并有活性组分充分透析，获得 PnLac2。 
1.2.4  SP‐Sepharose 强 阳 离 子 交 换 层 析 ：
SP‐Sepharose 层析柱（1.0cm×15cm）用 10mmol/L 
HAc‐NaAc（pH4.0）缓冲液平衡，将 PnLac2 用 1mol/L 
HAc‐NaAc（pH4.0）调成 10mmol/L，pH4.0 后上样。
上完样后先用 10mmol/L  HAc‐NaAc（pH4.2）洗脱
未吸附蛋白质，然后用 10mmol/L HAc‐NaAc（pH4.0）
+1mol/L（0–1mol/L NaCl）进行线性梯度洗脱，流
速为 3mL/min，用部分收集器收集洗脱液，每管
6mL，然后测定每只管洗脱液在 280nm 处的吸光
值，根据吸光值测定部分洗脱液的漆酶活性，合并
有活性组分，充分透析并冻干，得到 PnLac3。 
1.2.5  Superdex‐75 凝胶过滤层析：先用 0.15mol/L 
NH4HCO3（pH8.5）平衡 Superdex‐75 凝胶过滤层析
柱，将 PnLac3 用 0.15mol/L NH4HCO3（pH 8.5）溶
解，12  000r/min 离心 10min 后取上清液上样，然
后以 0.15mol/L NH4HCO3（pH8.5）缓冲液进行洗脱，
流速为 0.5mL/min，每管 0.8mL。测定每只管洗脱液
在 280nm 处的吸光值，测定各洗脱峰的漆酶活性，
合并有活性组分后冻干，得到 PnLac。 
1.2.6  白灵侧耳漆酶的 SDS‐PAGE 纯度检测：分离
胶的浓度为 12%，浓缩胶的浓度为 5.0%，电泳完
毕后加入考马斯亮蓝 R‐250 染色液没过胶面，置于
摇床上室温 40r/min 染色 2h，倾去染色液，用脱
色液脱色至本底无色，然后用凝胶成像仪拍摄电泳
结果图片。 
1.2.7  漆酶蛋白质质谱鉴定：SDS‐PAGE 分析所得
PnLac 条带切割后进行蛋白质质谱鉴定，该鉴定由
广州晖俊生物科技公司完成。 
1.2.8  漆酶活性的测定：将 10μL 漆酶样品和 190μL
底物 ABTS 溶液混合均匀，对照组用 10μL 去离子
水代替漆酶样品，置于 30℃水浴反应 5min，测量
405nm 处的吸光值，酶活定义为：在 405nm 处，
每min每mL反应体系产生一个吸光值所需要的酶
量为一个酶活力单位。 
1.2.9  漆酶最适反应温度的测定：将纯化所得的
PnLac 在最适 pH 条件下，分别与不同温度下（4℃、
20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）
水浴中预热的 ABTS 底物在对应的温度下反应
5min，测定漆酶酶活，每组做 3 个重复，以活力
最高值为 100%，以相对活力对相应的温度作图。 
1.2.10  最适反应 pH 的测定：以不同的 pH 值缓冲
液配制 ABTS溶液，分别在 30℃测定 PnLac的酶活，
以活力最高值为 100%，以各 pH 下相对活力对 pH
作图，每组做 3 个重复。缓冲体系为磷酸盐‐柠檬
酸缓冲液，pH 在 2.2–8.0 之间。 
1.2.11  温度稳定性：将 PnLac 放在不同温度（50℃、
60℃、70℃、80℃）水浴处理 90min，每 10min
取酶液于最适 pH 条件下测定漆酶酶活，每组 3 个
重复，以起始酶活力为 100%，计算各温度处理后
的相对酶活力。 
1.2.12  金属离子对漆酶的抑制作用：将不同离子
（K+、Ca2+、Cd+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+、Al3+、
 
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Hg2+、Pb2+、Mg2+）的氯化物以蒸馏水配制成
20mmol/L 母液，按比例加入到漆酶样品中，使各
种金属离子的终浓度分别达到 1.25mmol/L、
2.5mmol/L、5mmol/L 和 10mmol/L，每组做 3 个重
复，混合均匀后在 4℃孵育 1h，测定漆酶酶活，
将未添加金属离子处理的漆酶酶活定为 100%，计
算样品经各种金属离子处理后的相对酶活力。 
1.2.13  反应动力学实验：以 50mmol/L、最适 pH
的缓冲液分别配制 0.01mmol/L、 0.02mmol/L、
0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、
0.07mmol/L、0.08mmol/L 及 0.09mmol/L 的 ABTS
溶液，取 10μL 酶液与 190μL 不同浓度的 ABTS 溶液
在最适反应温度下水浴反应 5min 后测定酶活，每
组做 3 个重复。利用双倒数作图法，绘制
Lineweaver‐Burk 曲线，并计算 Km和 Vmax。 
1.2.14  数据统计分析：实验数据采用计算机统计
软件 Microsoft Excel 与 SPSS17.0 进行分析。 
2  结果与分析 
2.1  白灵侧耳漆酶的分离与纯化 
本研究通过 DEAE‐Cellulose、CM‐Cellulose、
SP‐Sepharose 离子交换层析以及 Superdex‐75 凝胶
过滤层析的有效利用，从白灵侧耳发酵液中分离纯
化得到一种新的漆酶 PnLac。漆酶粗样品经过
DEAE‐Cellulose 阴离子交换层析分段洗脱得到 5 个
洗脱峰，测定漆酶酶活后发现活性组分集中在 D4
峰，收集样品获得 PnLac1。PnLac1经过CM‐Cellulose
阳离子层析分段洗脱得到不能被吸附的 D4C1和能
被吸附的两个峰 D4C2 和 D4C3，其中 D4C2 组分具
有漆酶活性，收集样品获得 PnLac2。PnLac2 经过
SP‐Sepharose 强阳离子交换层析线性洗脱得到两
个洗脱峰（图 1），在 D4C2S2 峰处有活性，收集冻
干后获得 PnLac3进行 Superdex‐75凝胶过滤层析得
到两个洗脱峰（图 2），在 SU1 处检测到漆酶酶 
 
 
图 1 PnLac2 的 SP‐Sepharose 强阳离子层析柱洗脱曲线 
Fig.  1  Ion  exchange  chromatography  of  Pleurotus  eryngii  var. 
tuoliensis laccase PnLac2 on a SP‐Sepharose column. 
 
 
 
图 2 PnLac3的 Superdex 75 HR 10/30 FPLC凝胶过滤洗脱曲线 
Fig. 2 Gel filtration of Pleurotus eryngii var. tuoliensis laccase 
PnLac3 on Superdex 75 HR 10/30 by FPLC. 
 
 
  
活。这样，我们初步确定 SU1 组分为纯化的漆酶，
冻干后获得 PnLac。白灵侧耳漆酶活性主要是集中
在经 DEAE‐Cellulose 阴离子交换层析得到的 D4 组
分、CM‐Cellulose 阳离子层析得到的 D4C2 组分、
SP‐Sepharose 强阳离子交换层析得到的 D4C2S2 组
分、Superdex‐75 凝胶过滤层析得到的 SU1 组分，
SU1 冻干后获得纯化的白灵侧耳漆酶 PnLac，活性
回收率为 16.6%，纯化倍数为 99.3（表 1）。 
2.2 SDS‐PAGE 检测蛋白纯度   
白灵侧耳漆酶（PnLac）经 SDS‐PAGE 检测只显
示一条蛋白带，其分子量约为 65kDa（图 3）；
Superdex‐75 凝胶过滤层析得到的结果也表明同样
的分子量，这些结果都说明白灵侧耳漆酶是分子量
为 65kDa 的单体蛋白。 
 
 
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表 1  白灵侧耳漆酶 PnLac 的纯化结果（10L 发酵液） 
Table 1 Purification result of Pleurotus eryngii var. tuoliensis laccase PnLac (from 10L fermentation broth) 
色谱馏分 
Chromatographic fractions
总蛋白 
Yield (mg)
比活力 
Specific activity (U/mg protein)
总酶活 
Total activity (U)
回收率 
Recovery of activity (%) 
纯化倍数 
Purification fold 
粗酶液 
Crude solution 
7 253.0  0.8  5 681.8  100.0  1.0 
D4  1 007.3  1.6  1 590.9  28.0  2.0 
D4C2  206.6  6.6  1 363.4  24.0  8.5 
D4C2S2  45.9  23.7  1 090.7  19.2  30.4 
SU1  12.2  77.5  945.3  16.6  99.3 
 
 
 
图 3  白灵侧耳漆酶 PnLac 的 SDS‐PAGE 图谱      M：标准分
子量蛋白 Marker；1：纯化漆酶 PnLac. 
Fig.  3  SDS‐PAGE  analysis  of  laccase  (PnLac)  produced  by 
Pleurotus  eryngii  var.  tuoliensis.  M:  Protein  markers  with 
different molecular weights. 1: The purified laccase PnLac. 
 
2.3  质谱鉴定 
由 SDS‐PAGE 得到的纯化蛋白条带切割后用来
分析经胰蛋白酶水解得到的部分氨基酸片段。胰蛋
白酶水解后得到的 3 条肽段序列：肽段 1，
SAGSTTYNFDTPAR；肽段 2，YAGGPTSPLAIINVESNK；
肽段 3，ANPNLGSTGFDGGINSAILR。它们分别含有
14，18 和 20 个氨基酸。在 NCBI 数据库中与其他
已报道的漆酶相似性比对结果见表 2。 
2.4  最适反应 pH 和最适反应温度 
白灵侧耳漆酶 PnLac 的最适反应 pH 为 3.0（图
4），pH 在 2.2–3.0 之间时，PnLac 相对活力从 16%
快速上升到 100%，pH 升高到 3.0 以上时 PnLac 酶
活快速下降，当升高到 5.0 时 PnLac 活力下降为最
高活力的 25%。所以，PnLac 能在更多酸性条件下
被应用。 
PnLac 的最适反应温度为 50℃（图 5），在
4–30℃之间其活性变化不大，从 30℃到 50℃PnLac
活性逐渐升高到最高值。在 50–80℃之间，PnLac
活性快速下降。 
2.5  不同金属离子对漆酶酶活的影响   
不同金属离子（1.25–10mmol/L）对 PnLac 活
性的影响我们也做了研究。对 PnLac 活性在不同的
浓度都产生抑制作用的是 Hg+，Pb2+，Ca2+，Mg2+，
而相反在不同浓度都产生促进作用的是 K+，Fe3+，
Cu2+，其中 Cu2+的作用最为明显。Al3+和 Mn2+在浓
度为 1.25mmol/L 时有些许的抑制作用，但是在
2.5–10mmol/L 时有促进作用（表 3）。 
2.6  白灵侧耳漆酶的酶促反应动力学常数测定   
底物 ABTS 浓度在 0.01–0.09mmol/L 之间，利
用双倒数作图法得到了 PnLac 主要的反应动力学
常数 Km和 Vmax（图 6），其 Km值为 0.177mmol/L，
Vmax为 1.76OD/min/U。 
 
 
 
 
 
 
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表 2  白灵侧耳漆酶蛋白 PnLac 条带经过质谱鉴定后得到的 3 条肽段序列在 NCBI 库中的比对结果 
Table  2 Database  search using BLAST  among  three  internal  sequences  obtained by  tryptic digestion  of  Pleurotus  eryngii  var. 
tuoliensis laccase PnLac 
来源 
Source 
第一个氨基酸序列的位置 
Position of first amino acide sequence 
序列 
Sequencea 
一致性 
Identity (%)
相似性 
Positives (%) 
登录号 
Accession No.
Peptide 1    SAGSTTYNFDTPAR       
环柄韧伞 
Lentinus 
sajor‐caju 
441  SAGSTTYNFDTPAR  100  100  AAG27436.1 
糙皮侧耳 
Pleurotus 
ostreatus 
433 
439 
SAGSTTYNFDTPAR 
SAGSTTYNFDTPAR 
100 
100 
100 
100 
BAH90721.1 
AAR82932.1 
美味侧耳 
Pleurotus 
sapidus 
441  SAGSTTYNFDTPAR  100  100  CAH05069.1 
peptide 2    YAGGPTSPLAIINVESNK       
环柄韧伞 
Lentinus 
sajor‐caju   
210  YAGGPTSPLAIINVESNK  100  100  AAG27436.1 
糙皮侧耳 
Pleurotus 
ostreatus 
210 
210 
YAGGPTSPLSIINVESNK 
FAGGPTSPLAIINVESNK 
94 
94 
94 
100 
BAA85185.1 
AGO64760.1 
刺芹侧耳 
Pleurotus 
eryngii   
210  FAGGPTSPLAIINVESNK  94  100  AGO64759.1 
peptide 3    ANPNLGSTGFDGGINSAILR       
肺形侧耳 
Pleurotus 
pulmonarius 
77  ANPNLGSTGFDGGINSAILR  100  100  AAY41065.1 
糙皮侧耳 
Pleurotus 
ostreatus 
293 
294 
ANPNLGSTGFDGGINSAILR 
ANPNLGSTGFDGGINSAILR 
100 
100 
100 
100 
AEO22162.1 
AAR21094.1 
环柄韧伞 
Lentinus 
sajor‐caju 
294  ANPNLGSTGFDGGINSAILR  100  100  CAD45377.1 
注：a一致的氨基酸下面有下划线. 
Note: aIdentical amino acides are underlined. 
 
 
 
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图 4 pH 值对 PnLac 活性的影响 
Fig. 4 Effect of pH on activity of Pleurotus eryngii var. tuoliensis 
laccase PnLac. 
 
 
图 5  反应温度对 PnLac 活性的影响 
Fig. 5 Effect of temperature on activity of Pleurotus eryngii var. 
tuoliensis laccase PnLac.   
 
表 3  不同的金属离子对 PnLac 活性的影响 
Table 3 Effects of cations on activities of Pleurotus eryngii var. tuoliensis laccase PnLac 
金属离子 
Metal ions 
存留的漆酶活力 
Laccase activity remaining (%) 
10mmol/L  5mmol/L  2.5mmol/L  1.25mmol/L 
K+  163.45±14.90  172.46±2.4  185.85±15.11  219.54±4.57 
Ca2+  45.21±2.82  55.52±1.73  58.61±3.21  56.73±2.47 
Cd2+  106.61±5.15  83.02±4.83  76.98±3.04  87.31±2.55 
Cu2+  427.94±10.61  380.21±11.68  365.93±2.76  312.82±5.13 
Mn2+  217.87±22.69  142.71±1.62  111.03±1.42  91.01±0.51 
Fe3+  168.21±1.58  112.04±2.28  132.03±5.63  167.87±6.95 
Mg2+  76.18±2.43  84.16±1.49  84.54±3.15  89.46±0.82 
Zn2+  130.61±6.49  102.91±4.14  88.16±4.29  93.37±1.41 
Al3+  111.39±8.05  121.21±4.34  113.06±2.58  92.85±3.26 
Hg+  7.68±0.32  10.85±0.55  14.64±0.27  20.74±0.67 
Pb2+  65.22±7.21  68.81±3.69  66.35±3.03  64.13±0.44 
注：结果代表均值± SD（n=3）. PnLac 不添加金属离子时的活力为 100%. 
Note: Results represent mean ± SD (n=3). PnLac in the absence of metal ions was regarded as 100%. 
 
 
 
图 6 PnLac 的 Km及 Vmax的测定 
Fig. 6 Determination of Km and Vmax of Pleurotus eryngii var. 
tuoliensis laccase PnLac for ABTS. 
3  讨论 
PnLac的阴离子和阳离子交换柱层析行为与大
杯伞 Clitocybe  maxima  (Gartn.  Et  Mey.)  Quél.的
（ Zhang  et  al.  2010）类似，都能够吸附到
SP‐Sepharose 和 Q‐Sepharose 上。而与从白灵侧耳
子实体（Tian et al. 2012）中分离得到的漆酶柱层
析行为不同，它不能吸附到 CM‐Cellulose 上。另外，
它们的最适反应温度和最适反应 pH都不同，所以，
我们认为 PnLac 应该是一种新的漆酶。其他学者报
道的来自同一个种的漆酶却有着不同的性质
 
杨娟 等 /白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究                 
 
 
菌物学报 
463
（Baldrian 2006），这可能是因为同一种真菌的不
同菌株有不同的漆酶同工酶和不同的特性。在白腐
菌中大多数都能够产生多种同工酶，如糙皮侧耳
P. ostreatus 能够产生至少 8 种漆酶同工酶。 
到目前为止，约有 100 多种真菌漆酶都已经
被纯化出来且其生化特性也都被广泛地研究，由已
发表的数据得知典型的漆酶其分子量大小在
60–70kDa 之间。PnLac 的分子量为 65kDa，在这个
范围之内。NCBI‐BLAST 比对结果（表 2）表明 PnLac
与多种已报道的漆酶有很高的一致性，序列 1 与糙
皮侧耳、环柄韧伞的不同漆酶的部分肽段相似性达
100%，序列 2 与糙皮侧耳的部分肽段相似性达到
100%，与刺芹侧耳漆酶的达到 94%，与肺形侧耳、
糙皮侧耳和环柄韧伞的不同漆酶的部分肽段序列
相似性达到 100%，这 3 种肽段序列应该是漆酶中
的保守序列，或许可以为以后白灵侧耳的漆酶基因
克隆提供帮助。 
PnLac 的最适反应 pH 与糙皮侧耳 P.  ostreatus
（Palmieri et al. 1997）中的 POXA1w、POXA2、POXC
及草菇 Volvariella volvacea (Bull.) Singer（Chen et al. 
2004）中的漆酶非常类似。PnLac 的最适 pH 值在
之前报道的漆酶最适 pH 范围（2.0–5.0）内。PnLac
的最适反应温度为 50℃，与之类似的还有糙皮侧
耳漆酶（Hublik & Schinner 2004）以及肺形侧耳漆
酶（Souza & Peralta 2003）。根据已有数据，漆酶
的最适反应温度在 25–80℃但是大部分蘑菇的最
适反应温度在 40–60℃之间（Baldrian 2006）。PnLac
的温度稳定性试验表明，它在 30–60℃保温 90min
活性基本不变，在 70℃保温 30min 相对活力为
50%，而在 80℃保温 10min 活性即已丧失。 
PnLac与蒙古口蘑 Tricholoma mongolicum Imai
漆酶（Li  et  al.  2010）及子囊菌 Paraconiothyrium 
variabile  Riccioni,  Damm,  Verkley  &  Crous
（Forootanfar  et  al.  2011）漆酶类似，Cu2+对它们
都有促进活性作用。Al3+和 Mn2+在 1.25mmol/L 时
有抑制作用，而在 2.5–10mmol/L 时却有促进作用，
这可能是因为真菌在生长代谢时需要痕量的金属
离子，但是同一种金属离子浓度超过其所需量时对
它来说可能是有毒害作用的。PnLac 的 Km 值高于
环柄韧伞 P. sajor‐caju（Murugesan et al. 2006）漆
酶但是低于肺形侧耳 P. pulmonarius  漆酶的 Km值，
这表明白灵侧耳漆酶对 ABTS 的亲和力要比环柄侧
耳的低但是比肺形侧耳的高。 
综上所述，本研究从白灵侧耳发酵液中经过离
子交换层析、凝胶过滤层析以及 SDS‐PAGE 分离纯
化出一种新的漆酶（PnLac），与 Tian（2012）报道
的白灵侧耳漆酶相比，其色谱行为以及其生理生化
特性都有所不同。特性研究表明这种漆酶的分子量
大小约为 65kDa，3 种内部氨基酸片段分别为
SAGSTTYNFDTPAR ， YAGGPTSPLAIINVESNK 和
ANPNLGSTGFDGGINSAILR，最适反应温度为 50℃，
最适反应 pH 为 3.0。
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