全 文 ：文章编号:1005-0906(2007)02-0031-05
美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米
的研究和抗病性检测
刘 爽 1,杨爱国 2,赵 琦 1,赵玉锦 2,张世煌 2
(1.首都师范大学生命科学学院,北京 100037;2.中国农业科学院作物所,北京 100081)
摘 要:研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲
商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因 cDNA序列,构建植物表达载体 pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根
癌农杆菌 LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及
Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。
关键词:玉米;PaAFP前体蛋白基因;抗真菌;立枯丝核菌
中图分类号:S513.035.3;Q78 文献标识码:A
MaizeTransformationofPaAFPGeneandDiseaseResistanceAssay
LIUShuang1,YANGAi-guo2,ZHAOQi1,ZHAOYu-jin2,ZHANGShi-huang2
(1.InstituteofLifeSciences,CapitalNormalUniversity,Beijing100037;
2.InstituteofCorps,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)
Abstract:Inthepaper,plantexpressionvectorpCAMBIA1300-PaAFPwasconstructedbycloningthePaAFP
genefrompokeweedtopCAMBIA-1300.Then,theengineeredstrainLBA4404wasconstructedbyconductingthe
pCAMBIA-1300-PaAFPtoA.tumefaciensLBA4404andwasusedtotransformmaize.ThePCR,PCR-Southern
bloting,RT-PCR,SDS-PAGEanalysisindicatedthatthePaAFPgenehadbeenintegratedintothegenomeofmaize
andproducedtheprotein.
Keywords:Maize;PaAFP;Antifungal;Rhizoctoniasolani
玉米纹枯病是一种严重危害玉米生长的真菌病
害。对其发病原因的研究结果表明,玉米纹枯病病原
主要是立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniAG-1-IA)。
PaAFP(P.americanaAntifungalProtein)是从美洲
商陆(PhytolaccaamericanaL.)的种子中分离出的一种
广谱抗菌蛋白,该蛋白只在种子中特异存在。PaAFP
从萌发的种子中释放出来,创造出一个抵抗病原菌
的抑制区域,以抵挡微生物的危害,保证种子的正常
萌发和生长。该蛋白对多种真菌(R.solani,T.viride,
M.conica,F.orysporum,P.oryzae,A.melea,M.conica,
F.graminearum,A.tenuis)和革兰氏阳性菌(B.megateri
um,Staphyanococcussp.)的生长具有明显抑制作用。
PaAFP具有热稳定性和高碱性。且其特有的knotin
收稿日期:2006-04-21;修回日期:2007-01-27
作者简介:刘 爽(1980-),女,北京人,在读硕士,研究方向为植物
分子生物学及基因工程。Tel:13520545720
E-mail:lslsdodo@163.com
结构支架,使其在恶劣的环境中仍能保持稳定的结
构。该抗菌蛋白首先以一个含有65个氨基酸残基的
前体蛋白表达,其后加工成具有38个氨基酸残基的
成熟蛋白。
从美洲商陆的叶片中,通过PCR扩增得到其前
体蛋白的基因序列,经过拼接,得到编码其前体蛋白
的 cDNA序列。将其与 Ubi启动子构建到 pCAM-
BIA1300载体上,利用根瘤农杆菌 LBA4404转化玉
米,获得了转基因植株。通过对PaAFP基因在植物
中的整合和抗病状况的探索,为这种基因在广谱抗
真菌病害的植物基因工程中的实际应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
美洲商陆(PhytolaccaamericanaL.)为中国科学
院植物研究所种植。玉米齐319自交系由本实验室
提供。
1.2 PaAFP前体蛋白cDNA序列的获得
玉 米 科 学2007,15(2):31～35,38 JournalofMaizeSciences
DOI:10.13597/j.cnki.maize.science.2007.02.008
2,4-D(mg) 1.5 2.0 1.5 1.5 KT1mL GGR1mL
L-Proline(g) 0.69 0.69 0.69 0.69
Myo-Inositol(mg) 120 50
CasinAcidHydrolysates(mg) 250 30
Sucrose(g) 30 30 30 30 20
glucose(g) 36
AgNO3(mg) 0.85 0.85 0.85
Agar(g) 8.0 8.0 6~7 6~7
基本培养基 N6 N6 N6 N6 N6 1/2MS
试 剂
Reagents
侵染液
Liquidinfection
共培养培养基
Co-culturemedium
静置培养基
Stewingmedium
筛选培养基
Screeningmedium
分化培养基
Diferentiationmedium
壮苗培养基
Seedlingmedium
表1 玉米培养基配方(1L)
Table1 Componentsofmaizemediumformula
1.2.1 编码PaAFP前体蛋白DNA序列的获得
由于季节等多种原因,本试验未获得足够量的
美洲商陆种子作为试验材料。首先从美洲商陆的叶
片中利用 CTAB法提取总 DNA。按照 Genbank
(AF105062)中公布的PaAFP前体蛋白DNA序列设
计基因全长引物。引物序列为:
BamHⅠ
引物1:5′GCGGATCCATGGCTAAGGTTTCA3′
引物2:3′ACGTTTTTGGCGATTCTCGAGGC5′
SacⅠ
PCR扩增(94℃30s,57℃30s,72℃1min,30个
循环)获得编码PaAFP前体蛋白DNA序列。
1.2.2 编码PaAFP前体蛋白cDNA序列的获得
在PaAFP前体蛋白基因序列中,存在一个内含
子序列。为获得 cDNA序列,以 PaAFP前体蛋白编
码DNA序列为模板,利用PCR扩增分别得到第一
外显子序列和第二外显子序列。引物序列为:
第一外显子引物:
BamHI
引物3:5′AAGGATCCATGGCTAAGG3′
引物4:3′CGCATTATAGTCGACGC5′
AluI
第二外显子引物:
PvuⅡ
引物5:5′ACGCCAGCTGTTATGTCA3′
引物6:3′TTTGGCGATTCTCGAGCA5′
SacI
PCR扩增得到第一外显子(94℃30s,49℃30s,
72℃15s,30个循环)和第二外显子(94℃30s,50℃
30s,72℃20s,30个循环)。
利用内切酶 AluⅡ和 PvuⅡ分别单酶切两个外
显子片段,形成两个平末端,之后利用T4DNA连接
酶将两段外显子序列连接在一起。再利用基因全长
引物(引物 1和引物 2)扩增得到 PaAFP前体蛋白的
cDNA序列。
1.2.3 测序检测
将扩增得到的 PaAFP前体蛋白 cDNA片段连
接在 T-easy载体上,进行测序检测,证明所得片段
与 Genbank(AB018476)中所公布的 cDNA片段完全
相同。
1.3 植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP的构建
用内切酶 BamHI和 SacI双酶切植物表达载体
pCAMBIA1300,用T4DNA连接酶将PaAFP前体蛋
白 cDNA和植物表达载体 pCAMBIA1300大片段连
接,目的片段上游连有Ubi启动子,下游为Nos终止
子。将载体电击法转化入大肠杆菌DH5α,利用卡那
霉素筛选阳性克隆,用 PCR、酶切及测序方法鉴定
阳性克隆,称重组质粒为pCAMBIA1300-PaAFP。
1.4 重组质粒转化根瘤农杆菌(A.tumefaciens)LB
A4404
利用三亲杂交法将重组质粒 pCAMBIA1300-
PaAFP转化入根瘤农杆菌LBA4404中。
1.5转化玉米及转基因植株的筛选培养
玉米幼胚的转化步骤参考 Ishida和 Zhao的方
法,略有改进。培养基见表1。取幼胚用浸染液充分
浸没幼胚,然后静置5min。浸染过程中培养皿不晃
动。浸染结束后用滤纸吸干幼胚表面的菌液,把幼胚
放入共培养培养基,盾片朝上,25℃黑暗中培养3d。
之后静置培养,28℃黑暗4～7d。转移到选择培养基
上,每两个星期继代1次。在 28℃黑暗中培养两个
月左右,开始生长出抗性愈伤。选择生长状态较好的
抗性愈伤转移到分化培养基上分化出无根幼苗。移
到生根培养基上。幼苗长到10～15cm左右移栽到
营养土中。
15卷玉 米 科 学32
Gelrite(g) 3.0
MES(g) 0.5 0.5 0.5
pH值 5.2 5.8 5.8 5.8 6.0 6.0
乙酰丁香酮(μM) 100 100
羧苄青霉素(50mg/mL) 2mL 2mL
潮霉素(50mg/mL) 100~300μL
试 剂
Reagents
侵染液
Liquidinfection
共培养培养基
Co-culturemedium
静置培养基
Stewingmedium
筛选培养基
Screeningmedium
分化培养基
Diferentiationmedium
壮苗培养基
Seedlingmedium
续表1 Continuede1
1.6 转基因植株的分子检测
提取玉米阳性植株基因组DNA。利用PaAFP前
体蛋白基因引物(引物1和引物2)进行扩增。PCR扩
增及电泳结束后,进行 PCR-Southern检测。利用
TRIzol提取总mRNA,进行TR-PCR检测外源基因
的转录情况。提取阳性植株总蛋白,利用 Tris-
Tricine-SDS-PAGE检测 PaAFP前体蛋白基因的翻
译情况。
2 结果和分析
2.1 PaAFP前体蛋白cDNA序列的获得
电泳检测表明(图 1),以美洲商陆总 DNA为模
板,PCR扩增得到编码 PaAFP前体蛋白的 DNA序
列。经过测序证明获得的编码序列与Genbank公布
的序列一致。
电泳检测表明(图2),经酶切、连接以及 PCR扩
增,得到 PaAFP前体蛋白基因 cDNA片段,经过测
序证明其与公布的序列一致。
2.2 植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP的构建
用 BamHI和 SacI双酶切植物载体 pCAMBI-
A1300和 T-easy载体,将植物表达载体大片段和目
的片段连接,得到重组质粒 pCAMBIA1300-PaAFP,
构建图谱(图3)反应了整个过程。电泳检测表明(图
4),目的片段插入到该植物表达载体中。
1.泳道M:2000bpDNA标记物
2.泳道C:对照(CK) 3.泳道1:PCR产物
1.LaneM:DL2000Marker
2.LaneC:control 3.Lane1:PCRproduct
图1 扩增编码序列的电泳图谱
Fig.1 ElectrophoresisidentificationofPCRanalysisof
totalDNAofpokeweed
1.泳道M:2000DNA标记物 2.泳道1:PCR产物
1.LaneM:2000bpDNA 2.Lane1:PCRproduct
图2 PaAFP前体蛋白cDNA序列的电泳图谱
Fig.2 ElectrophoresisidentificationofPCRanalysisof
PaAFPscDNAsequence
图3 植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP构建流程
Fig.3 Flowchartofconstructingplantexpressingvector
33刘 爽等:美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测2期
2.3 转基因玉米植株的获得
利用上述方法得到转基因植株,出苗率约为
7%。
2.4 转基因玉米植株的分子鉴定
2.4.1 转基因玉米的PCR检测
提取幼叶的基因组 DNA,对其进行了 PCR检
测,结果见图5。扩增出大约200bp的目的条带,与
阳性对照扩增得到的条带一致,由此确定,此条带为
PaAFP前体蛋白基因cDNA扩增结果,初步表明目
的片段整合入玉米基因组中。没有出现条带的玉米
植株为假阳性植株。
2.4.2 转基因玉米的PCR-Southern检测
为了进一步鉴定 PCR产物是否为 200bp的
PaAFP前体蛋白基因 cDNA片段,将所得样品的
PCR扩增产物进行Southern杂交,以PaAFP前体蛋
白基因 cDNA片段的 PCR产物回收片段为探针进
行杂交,杂交结果与 PCR扩增结果完全一致,证明
所得到的 200bp的片段确为 PaAFP前体蛋白基因
cDNA片段,结果见图6。
2.4.3 转基因玉米RT-PCR检测结果
设置不加反转录酶的对照,没有产生目的条带,
说明 RNA提取物中的基因组 DNA未影响实验结
果,结果见图7。加入反转录酶的RT-PCR的结果见
图8,扩增出了约200bp的目的条带。这初步证明了
转基因玉米中存在PaAFP前体蛋白基因的 mRNA,
表明了 PaAFP前体蛋白基因在转录水平上已经得
到了表达。
1.泳道M:100bpDNA标记物 2.泳道1:酶切产物
1.LaneM:100bpladderMarker 2.Lane1:digestingproduct
图4 对重组质粒pCAMBIA1300-PaAFP鉴定
Fig.4 Identificationofrecombinantplasmid
pCAMBIA1300-PaAFP
1.泳道M:100bpDNA标记物
2.泳道(-):非转基因玉米植株
3.泳道(+):pCAMBIA1300-PaAFP质粒
4.泳道CK1~2:非转基因玉米植株
5.泳道:1~5转基因玉米植株
1.LaneM:100bpladderMarker
2.Lane(-):control
3.Land(+):pCAMBIA1300-PaAFP
4.LaneCK1-2:theplantsofnon-transgenicmaize
5.Lane1-5:theplantsoftransgenicmaize
图5 玉米基因组DNA的PCR检测
Fig.5 PCRanalysisoftransgenicmaizegenomeDNA
1.泳道(+):pCAMBIA1300-PaAFP质粒
2.泳道CK:非转基因玉米植株
3.泳道1~3:转基因玉米植株
1.Lane(+):plasmidpCAMBIA1300-PaAFP
2.LaneCK:theplantofnon-transgenicmaize
3.Lane1-3:theplantsoftransgenicmaize
图6 玉米基因组DNA的PCR-Southern检测
Fig.6 PCR-Southernidentificationoftransgenic
maizegenomeDNA
1.泳道CK:非转基因玉米植株
2.泳道M:200bpDNA标记物
3.泳道1~2:转基因玉米植株
1.LaneCK:theplantofnon-transgenicmaize
2.LaneM:200bpladderMarker
3.Lane1~2:theplantsoftransgenicmaize
图7 未加AMVReverseTranscriptase的RT-PCR分析
Fig.7 RT-PCRanalysiswithoutAMVReverseTranscriptase
15卷玉 米 科 学34
2.4.4 转基因玉米的 Tris-TricineSDS-PAGE分析
结果
采用 Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果
显示转基因玉米比非转基因玉米多一条 7kD的条
带,这与 PaAFP前体蛋白的分子量相符,初步证明
PaAFP前体蛋白基因在转基因玉米中已经翻译成了
PaAFP前体蛋白(图9)。
3 结论与讨论
本试验结果表明,PaAFP基因已经被转移并整
合到玉米自交系齐319基因组中,并且翻译出前体
蛋白,为培育抗真菌玉米新品系提供了育种资源。
农杆菌介导的玉米遗传转化的研究发现,对受
体基因型、受体状态、受体高渗预处理、农杆菌菌液
状态、金属离子、共培养天数的依赖性很大。因此,选
择了国内骨干自交系齐 319,生长到 1～1.2mm的
幼胚为受体材料,侵染时利用葡萄糖制造高渗环境,
浸染农杆菌菌液OD为 0.3,培养时添加 Ag+离子,
共培养3d等操作,以提高转化效率。结果表明,这
些处理都是有效的。但就转化效率而言,还需要进一
步改进方法。
PaAFP前体蛋白前 27个氨基酸就是一段转运
型信号肽(transitsignalpeptide),它对于蛋白的正确
运输到液泡和细胞外、加工成成熟蛋白具有重要作
用。通过SDS-PAGE发现了一条7kD的新增条带,
认为是PaAFP前体蛋白。但没有发现3kD的蛋白条
带,即PaAFP成熟蛋白。所以无法确定前体蛋白上
的转运信号肽是否正确切割。需要进一步进行蛋白
纯化、分析等方面的研究。
在PaAFP前体蛋白基因转化烟草的试验中,发
现在植株上出现了白斑,但是在玉米植株上没有发
现明显的白斑,但转基因苗生长相对缓慢,移栽后不
易成活,怀疑PaAFP蛋白对植株生长有一定危害作
用。另外,PaAFP只在美洲商陆的种子中存在,萌发
时释放到周围的土壤中,其他组织中没有,所以
PaAFP可能会对帮助植株正常生长的一些根系微生
物产生影响,因此,应在以后的转化试验中考虑使用
特异启动子,以减少此蛋白的一些副作用。或对
PaAFP基因片段进行改造,使其既保持抗真菌活力,
又对植株没有危害。
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2445-2450. (下转第38页)
1.泳道CK:非转基因玉米基因
2.泳道M:200bpDNA标记物
3.泳道1~2:转基因玉米植株
1.LaneCK:theplantofnon-transgenicmaize;
2.LaneM:200bpLadderMarker;
3.Lane1-2:theplantsoftransgenicmaize
图8 加AMVReverseTranscriptase的RT-PCR分析
Fig.8 RT-PCRwithAMVReverseTranscriptase
1.泳道M:蛋白质标准分子量标记
2.泳道1:非转基因玉米植株总蛋白
3.泳道2~3:转基因玉米植株总蛋白
1.LaneM:broadrangeproteinmarker
2.Lane1:totalproteinofnon-transgenicmaizeplant
3.Lane2-3:totalproteinoftransgenicmaizeplant
图9 玉米叶片总蛋白SDS-PAGE
Fig.9 SDS-PAGEanalysisofmaizetotalprotein
35刘 爽等:美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测2期
(上接第35页)
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(责任编辑:朴红梅)
高与旅大红骨种质和四平头种质之间杂种优势,为
利用热带、亚热带种质资源对我国生产上应用的骨
干自交系进行改良和创新提供了新思路。
3 讨 论
瑞德种质与旅大红骨种质之间具有很强的杂种
优势,多年以来一直是国内主要杂种优势利用模式
之一。少数育种者将这两类种质组配在一起进行种
质创新,但一直未见选育成功优良自交系应用于生
产的报道。1994年丹东农科院将瑞德种质丹 9046
与含有旅大红骨种质的 L2杂交作为选系基础材
料,采用二环系选育方法,成功育成自交系丹T138。
经过测配,丹T138与PN种质之间具有很强的杂种
优势,组配的玉米杂交种丹玉 86、丹玉 90,丹玉 68
在生产上表现突出。丹 T138的成功选育证明瑞德
种质与旅大红骨种质之间进行种质改良和创新的思
路是可行的。C8605-2与丹9046来源相同,有理由
认为C8605-2与旅大红骨种质之间相互融合,创造
出新的种质的思路是可行的,而且随着我国种质资
源的不断丰富和创新,这一种质创新思路必将得到
更多实践和应用。
瑞德种质与四平头种质之间的相互溶合也是国
内育种者一直探索的一条种质创新途径。辽宁东亚
种 业 有 限 公 司 将 含 有 四 平 头 种 质 的 K12与
C8605-2组配在一起进行种质创新,成功选育出
K125自交系,培育出优良杂交种东单70应用于生
产。这一思路在今后针对C8605-2的种质创新中也
应该去更多实践和应用。
C8605-2是近些年来国内表现最为优异的骨干
自交系之一,加强对它的研究和利用对丰富和发展
我国种质资源必将会起到极大促进作用。
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(责任编辑:尹 航)
15卷玉 米 科 学38
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