全 文 ：裂叶牵牛突变体的研究
刘晓红，李叶峰，彭丽媛，陆小平* (苏州大学金螳螂建筑与城市环境学院，江苏苏州 215123)
摘要 ［目的］研究裂叶牵牛花色、叶色等变化机理。［方法］通过田间调查，利用 PCR技术从裂叶牵牛蓝白相间突变株幼叶组织中扩增
出目的片段，构建重组质粒 pMD18-T/Tpn。［结果］田间调查结果发现，变异株的 F3 代发生分离，叶色突变并不影响花色的变化;PCR扩
增结果表明，以蓝白、纯蓝、大花基因组 DNA在 330 bp处各有 1条特异带，而春光、白雪、平安红、垂蔓都没有特异带出现。［结论］变异
株重组质粒序列为裂叶牵牛的转座子序列片段。
关键词 裂叶牵牛;转座子;克隆
中图分类号 S681． 6 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)28 －17214 －03
Study on the Mutants of Pharbitis nil
LIU Xiao-hong et al (Gold Mantis school of Architecture and Urban Environment，Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215123)
Abstract ［Objective］The research aimed at investigating mechanisms of the changes of Pharbitis． nil flower colors and leaf colors． ［Method］
The recombinant plasmid pMD18-T /Tpn was constructed by amplifying the target fragments from young leaf tissues of the blue and white mu-
tants of pharbitis nil with PCR technology and investigating in the fields． ［Result］The results of investigations in the fields suggested that the
mutants were segregated in F3 generation，and the mutations of leaf colors did not affect the changes of flower colors． The results of PCR
showed that there was a band about 330 bp in genomic DNA of Lanbai，Chunlan，Dahua，respectively，however，no bands were found in
Chunguang，Baixue，Ping’anhong and Chuiman． ［Conclusion］The sequence of recombinant plasmid of the mutant was indeed a fragment of
the transposon of pharbitis． nil．
Keywords Pharbitis nil;Transposon;Clone
作者简介 刘晓红(1986 － ) ，女，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向:
农业昆虫，* 通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事植物
生理方面的研究，E-mail:SZLXP@ yahoo． com． cn。
收稿日期 2011-06-10
牵牛花，又名“朝颜”，为旋花科一年生攀缘草本植物，单
叶互生，卵状心形，具 3 浅裂。花 1 ～ 2 朵集于叶腋，花冠喇
叭状，质薄如纱，艳丽娇嫩，花白色、蓝色或紫色． 繁殖能力
强，生长势好，对生长环境要求不高，具有易成活、易栽培等
特点。目前，我国以牵牛花为材料的研究较少，但日本对牵
牛花品种的收集保存、栽培管理、遗传分析和生物技术都有
深入研究［1 －2］。2002年 6月，陆小平教授在苏州大学西校区
桑园里发现了 1 株花色畸异的裂叶牵牛。该变异株除花色
特殊外，其育性极低。笔者以该变异株为材料，从叶色、花
色、花性等方面对裂叶牵牛变异株(M1)进行遗传特性分析，
探讨花色变化的生理机制，为研究观赏植物的分子改良提供
理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 4月下旬，在苏州大学独墅湖校区的实习基地选
择 10 m2 播种，品种及其花色见图 1，每个品种播 10粒。
1． 2 方法
1． 2． 1 花色、叶色调查。播种发芽后，选取 6株长势基本一致
的牵牛变异株，盛花期间每天调查各株的花冠纹理，以鉴别 F3
代的花色性状是否产生分离;同时，调查叶色突变现象。
1． 2． 2 转座子克隆。取变异牵牛植株的幼叶 0． 1 g，采用
CTAB法提取基因组 DNA［3 －4］。同时提取白雪、大花等品种
基因组 DNA，在相同条件下进行牵牛转座子的 PCR扩增［5］。
根据有关牵牛转座子的报道，设计 2 条牵牛转座子的特异引
物。上游引物:CACTACAAGAAAAATGCACATA;下游引物:
TGTCTTTCTAGTGTTGTGTATTC。
2 结果与分析
2． 1 花色、叶色 结果表明，4个植株的花冠既有纯蓝色，又
有蓝白相间色，1个植株只有蓝白相间花，1 个植株只有纯蓝
注:a、b、c、d、e、f、g分别为春光、平安红、大花、垂蔓、纯蓝(正常型
M1)、蓝白(M1 的变异型)、白雪。
Note:a:Chunguang;b:Ping’anhong;c:Dahua;d:Chuiman;e:
Chunlan(normal M1) ;f:Lanbai (variant of M1) ;g:Baixue．
图 1 供试牵牛品种
Fig． 1 Tested varieties of morning glory
花。这说明变异株的 F3 代产生了分离。同时，对于叶色的突
变调查也发现，叶色突变并不影响花色的变化(图 2)。
2． 2 转座子克隆及鉴定 PCR 扩增结果表明，以蓝白、纯
蓝、大花基因组 DNA 为模板的 PCR 反应后，在 330 bp 处各
责任编辑 李占东 责任校对 傅真治安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(28):17214 － 17216
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.28.211
注:a、c为正常叶和花;b、d为突变叶和花。
Note:a，c:normal leaves and flowers;c，d:variant leaves and flow-
ers．
图 2 正常叶和突变叶的花色
Fig． 1 Colors of normal and variant leaves and flowers
有 1条特异带，而春光、白雪、平安红、垂蔓都没有特异带出
现(图 3)。
注:1． Marker(2 000 bp) ;2．蓝白花;3．纯蓝;4．白雪;5． H2O(阴性
对照)。
Note:1． Marker (2 000 bp) ;2． Lanbai;3． Chunlan;4． Baixue;5． H2O
(negative control)．
图 3 牵牛花内源转座子 PCR扩增
Fig． 3 PCR amplification of indigenous transposons in morning
glories
将变异株(M1)的片段纯化后克隆到 pMD18-T载体上，
经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定发现，重组质粒
中含有 300 bp 的片段(图 4)。
对重组质粒 pMD18-T /Tpn序列测定，结果表明，克隆
片段为 326 bp的基因片段，上游没有起始密码，C 末端没有
终止密码子，是一个不完整的阅读框架。
2． 3 转座子基因的序列片段比对 将所获序列用 http:/ /
www． ncbi． nlm． nih． gov /BLAST进行比对得到裂叶牵牛与其
他学者研究的裂叶牵牛转座子的序列比对图(图 5、6)。由
图 6可知，变异株(M1)与其他品种的转座子同源性很高，所
测得序列是裂叶牵牛的转座子序列片段。
3 讨论
3． 1 花形突变机理 被子植物中典型花的花器官由外向
内依次是花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊 4 轮结构，它们都是由花
注:1． Marker;2． EcoRⅠ酶切;3． EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切。
Note:1:Marker;2:EcoRI digestion;3:EcoRI ＆ HindⅢ double － di-
gestion．
图 4 转座子酶切鉴定
Fig． 4 Transposons identified by restriction enzyme digestions
的分生组织分化而来，Coen 和 Meyerowitz 提出的控制花形
态建成的“ABC”模型认为，这 4 轮结构的形成是由 3 组基
因(A、B、C)共同作用完成的，每一轮花器官特征的决定分
别依赖于 3 组基因中的 1 或 2 组基因的正常表达，其中任
何一组或更多的基因发生突变而丧失功能，则花的形态发
生将出现异常［6］。
在拟南芥中，MADSbox基因 AGAMOUS(AG)在花的内 2
轮中表达，该基因发生突变导致在雄蕊着生位置长出花瓣，
在心皮着生位置长出花萼［7］。在外 2轮表达的基因中，至少
图 5 裂叶牵牛转座子片段序列
Fig． 5 Transposon fragment sequences of pharbitis． nil
图 6 蓝白裂叶牵牛转座子序列与裂叶牵牛其他品种转座子比对
Fig． 6 Comparison between transposons sequences of pharbitis．
nil of Lanbai and other varieties
包括一个 MADSbox 基因 APETALA1(AP1)和 2 个不含
MADSbox基因 LEAFY和 APETALA2(AP2)。在第 2(花瓣)和
5127139 卷 28 期 刘晓红等 裂叶牵牛突变体的研究
3轮(雄蕊)中特异表达的基因有 MADSbox 基因 APETALA3
(AP3)和 PISTILLATA(PI) ，这 2 个基因的任意一个发生突
变，将导致雄蕊转变为心皮而形成全雌花，花瓣也转变为花
萼，以至于花形成 2轮花萼包围着 1轮或 2轮心皮。推测牵
牛花突变体的雄蕊突变为花瓣，是因为控制牵牛花雄蕊和花
瓣发生的特异表达基因发生了突变。
3． 2 转座子 嵌合花色具有很高的观赏和商业价值，自然
界中部分嵌合花色是由于转座子引起的。利用转座子插入
法可一次获得较多种类的突变体，利用内源转座子(Tpn)插
入矮牵牛，获得 55 个新的花色突变体。转座子是基因中可
移位的遗传因子，是基因组中一定的 DNA序列，这个序列编
码蛋白质，从而能直接操作 DNA，使其复制并移动到基因组
中一个新的位置［8］。转座子通过插入或割离目的基因而关
闭或恢复基因的表达活性。由于不同细胞中转座子跳出的
时间不同，因而不同细胞中目的基因的表达时空不同，如果
被转座子影响的目的基因是与花色素合成有关的结构基因
或调节基因时，则不同细胞中结构基因表达的时空不同，因
而在不同细胞中生成的花色素苷不同，导致在同一花瓣上可
能显现不同的颜色，形成美丽的嵌合花色。Chuck等通过转
座子(Ac)标签法克隆到 Ph6 基因，由于转座子插入 Ph6 基
因，液泡 pH上升 0． 32，为嵌合花色，在深色的花冠檐上产生
淡白色的条纹。日本 Iida实验室研究发现，蓝色花的日本牵
牛(Pr ～ r)突变为紫色花(Pr ～ m)是由于转座子(Tpn4)插入
到 Pr基因，影响了该基因的正常表达，使之缺乏 Na + /H +反
向传递体，因而液泡内的 pH降低，突变株无法产生正常的亮
蓝色，因此，蓝色的花冠檐上产生紫色的斑痕，形成嵌合花
色［9］。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
51 －55．
(上接第 17213页)
对发展滞后的西盟县 3 个评价点只有 35． 6%的农户认为陆
稻间作玉米较净作陆稻产量高，42． 2%的农户认为间作与净
种产量没有差异。结合当地社会经济发展情况看，生产水平
相对高的孟连、澜沧评价点对有明显的提高土地产出意识，
认为间作后产量明显提高，而西盟县 3 个点的农户只看稻谷
的产量来作评价，所以多数农户认为间作后产量没有提高。
③对于间作的成本投入评价，由于间作主要只是增加玉米种
子投入，而现在国家对两杂种子有专项补助，有一些农户忽
视了对种子的投入，所以只有 55． 4%农户认为间种增加了成
本投入，39． 2%的农户认为间作不增加成本投入。④从种植
效益的调查看，30户农户中有 19． 9 户认为陆稻间玉米产量
较净作陆稻高，占 66． 3%的农户认可间作后提高了种植效
益，23． 7%的农户认为间种与净作陆稻效益一样高，这与间
作相对竞争价值总量(RVT)的计算结果相一致，说明通过间
作可有效提高种植效益。⑤在劳力投入方面，一般情况下种
植区农户自己不计算劳动力投入，且陆稻间作玉米农户不需
要增加专门的管理，所以 8个点参与的农户中有 21． 5 户，占
71． 7%的农户认为陆稻—玉米间作没有增加劳动力，只有
20． 8%的农户认为间作需要增加劳动力投入。⑥对于间作
模式选择，从参与评价的农户统计结果看，75． 3%的农户选
择了 14行陆稻间 2行玉米(模式 F)这种间作模式，16． 4%的
农户选择 12行陆稻间 2行玉米模式，只有 8． 3%的农户选择
10行陆稻间 2行玉米间作模式，表明 14 行间 2 行玉米的模
式，在现有的生产水平下符合农户需求，在较好的推广利用
前景。
3 结论
农民参与式评价方式是近年来从国外引入的项目管理
和执行方式，在农业领域，更多地应用于技术推广、农村扶贫
等方面，诸多国际援助发展项目计划的制定、实施、监测与评
估均渗透和体现了受益主体参与的思想［3］，试验结果表明，
有 71． 3%的农民认可陆稻间作玉米比净种陆稻好，63． 3%的
农户认为通过间作可以提高单产，在间作方式上 71%农户选
择 14行陆稻间作 2 行玉米模式，农户的评价结果与试验分
析结果相一至，说明试验所选间作模式，得到参与农户的
认可。
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61271 安徽农业科学 2011年