全 文 ：热带亚热带植物学报 19 95 , 3 ` ( 2) : “ 一 69
J认而` oj 子阳砂汉 公 j s 理心 , 神过 及凌 . ,
旋扭山绿豆根瘤菌 M X D I 6 菌株氢酶诱导表达
姚小文 陈兆平 程双奇 莫熙穆
(华南师范大学生物学系生物固氮研究中心 , 广州 5 1 0 6 3 1 )
摘要 在自生异养条件下 , 旋扭山绿豆根瘤菌 M x DI . 菌株的氢酶诱导表达受气相 、 pH 值 、 镍等因子
影响 : 氢酶表达的最适氧浓度为 4写 , 最适氢浓度为 15 % , 二氧化碳没有明显影响 ; 氢酶表达的 p宜值
以 5 . 0一 6 . 0 为宜 ; 0 . 5 “ m of / L 冲 lC : 明显促进吸氢活性 , 但镍浓度大于 1 o m ol / L 则抑制吸氢活性 .
关键词 旋扭山绿豆 ; 根瘤菌 , 自生异养条件 , 氢酶表达 ; 吸氢活性
E X P R E S S I O N O F H Y D R O G E N A S E S Y S T E M IN S T R A IN M X D I
6
O F R H I Z O B I UM ( D E S M O D I U M I N T O R T U M )
Y a o X ia o w e n C h e n Z h a o Pi n g C h e n g S h u an gq i M
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一 u P tak e a e t i v i t y
根瘤菌体内的固氮酶在固氮过程中伴随着放氢 , 这是一种能量的浪费 l[, ’ 〕 。 有些根瘤菌体
内存在着 吸氢酶 , 能氧化 由固氮酶催化所放出的氢 , 从而提高了共生固氮效率和植物 的产
量 [ 3 ·` ] 。
在自生条件下 , 根瘤菌吸氢酶活性的表达受多种因子调控 5j[ . 氢诱导慢生型根瘤菌 〔阔氢
酶的形成 ; 低氧有利于大豆根瘤菌图氢酶诱导表达 ; 镍明显促进大豆 10[ 〕和花生根瘤菌 1[ ’ 〕的吸
氢活性 ; pH 值对紫云英根瘤菌〔” 〕的氢酶表达有调节作用 。
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2 2 收稿 ; 2 9 9 5一 0 3一 0 1 修回
“ 热带亚热带植物学报 第 3 卷
旋扭山绿豆是本中心从澳大利亚引种的优 良热带豆科牧草 , 在广东的推广种植已收到 良
好的社会和经济效益 。 本文旨在探讨在自生异养条件下旋扭山绿豆根瘤菌 M x DI 。 菌株表达氢
酶活性的最佳条件 , 为进一步研究其吸氢酶与固氮酶之间的关系 , 提高固氮效率提供参考 .
l 材料和方法
菌株与培养基 旋扭山绿豆 (肠二“ 椒。 in柳ut 。 ) 根瘤菌R hi z ob iu m M x DI 。 菌株由本研究
中心提供 。 菌株保存用常用的酵母一甘露醇培养基 (Y MA )
。 菌株扩大培养以 Y M 培养基 ( YM A
减去琼脂 ) [ ” ] 。 吸氢培养基 ( H u M ) 采用 M a se : 等 t “ 〕的方法 , 但以 2 5 m s L一 ’柠檬酸铁代替 F e -
ED T A
。
菌体培养 菌体以 YM A 斜面保存 . 进行液相培养时 , 挑取一接种环的菌体 . 接种于
ZOm 】Y M 培养基中 , 于 28 ℃往复振荡培养 4一 5 d .
液相诱导 取 l ml Y M 培养的菌液 , 接入 20 ml H u M 培养基中 , 于 28 ℃往复振荡培养 刁
一 s d 后 , 把三角瓶换上翻 口 橡皮塞 , 根据实验需要注入不同浓度的 H Z 、 0 , 、 C O , 气体 , 诱导
培养 4一 s d , 然后离心收集菌体 , 并用 0 . 05 m ol / L p H 6 . 8 内含 1 m m ol / L M S O : 的磷酸缓冲液
悬浮 。
氢酶活性测定 取 4 ml 细胞悬浮液装入 2组ml 的血清瓶中 , 加塞注入氢 、 氧等气体 , 用
气相层析仪检测一段时间内的吸氢量 , 计算氢酶活性 . (不同条件下菌体的诱导培养均经 3 次
试验 , 每次试验设 4 个重复 , 结果取平均值 。 )
菌体蛋 白测定用 oL w yr 等〔’ 5〕方法 。
2 结果与分析
2
.
1 自生异养条件下 M x D I。 的氢酶诱导表达
在 H U M 培养基中 , 配以 1 0% H : , 1 0% 0 2 , 5 0% N Z 的气相条件 , 诱导 M x D I . 的氢酶表达 ,
可观察到其氢酶表达进程如图 ] 。
2
.
2 气相对 M x DI 。 氢酶表达的影响
2
.
2
.
1 氧对氢酶诱导表达 的影响
在 H u M 培养基中 , 恒定 10 %的氢浓度 , 观察不同氧浓度对氢酶诱导的影响 , 图 2 结果表
明 : 氧浓度低于 2%时 , 氢酶活性较低 ; 增大氧浓度氢酶活性迅速增加 , 至 4写时达最大值 ,
若继续增大氧浓度则明显抑制氢酶表达 , 7%时 , 氢酶活性比最大值约下降 85 % .
2
.
2
.
2 氢对氢酶诱导表达的影响
在 H U M 培养基中 , 控制 3 %的氧浓度 , 可观察到分子氢对 M X DI . 氢酶诱导的影响 (图
3 ) ; 无氢时 , 氢酶不表达 ; 氢酶活性随外加分子氢增加而明显提高 , 氢浓度达 15 %时 , 氢酶
活性达到最高值 , 继续提高氢浓度至 25 % , 氢酶活性基本保持恒定 。
2
.
2
.
3 二氧化碳对氢酶诱导表达的影响
在含有 3% 0 2 , 10 % H : 的诱导气相中配以不同浓度的 c o : 诱导氢酶 , 结果 (表 l) 表明 C 。 :
对 M X DI 。 氢酶表达没有明显影响 . 这与花生 l[] 、 大豆 .1[ 根瘤菌的情况相似 。
第 2期 姚小文等 : 旋扭山绿豆根瘤菌 Mx D I ` 菌株氢酶诱导表达
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图 1 M x DI 。 菌株的氮酶诱导表达
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图 2
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氧对 . M X DI 。 氮酶诱导表达的影响
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表 l 二氧化碳对 M x DI 。 吸拟活性的形响
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气相成份
C o m PO s i t io n o f t h e 助 5 hP a胎
3 % o
: + 1 0% H
:
+ 5 7 % N
:
3 % 0
: + 1 0% H
:
+ 8 5% N
: + 2% C O
:
3 %仇 + 1 0纬H : + 8 2 % N : + 5% C O :
3% O
: + 1 0% H
: + 7 7% N
: + 1 0写C O :
吸氢活性
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( n m ol H : m in 一 ’ m g 一 ’ P r o t e i n )
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.
1 0
1 2
.
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.
5 0
1 1
.
2 7
2
.
3 不同 PH 值对 M x DI 。 氢酶表达的影响
图 4 表明 M x DI . 的氢酶诱导表达对 p H 敏感 , H u M 培养基 p H 5 . 0一 6 . 0 有利于氢酶诱导 .
PH .5 5 时 , 吸氢活性出现最大值 , p H 值大于 6 . 0 , 吸氢活性降低 . ,
2
.
4 裸对 M x D I . 氮酶表达的影响
在 H UM 培养基中加入不同浓度的 N se 一: , 结果 (图 5 ) 表明 : 小于 1 林m o l / L N ic l: 明显促
进 M x DI . 的吸氧活性 , 0 . 5 , m ol L/ 镍可使吸氢活性提高至 3 . 月倍 , 而大于 1 p m ol L/ 镍则抑制
吸氢活性 , 镍浓度为 10 p m of / L 时 , 吸氢活性比不加镍约下降 75 % 。
3 讨论
从实验中发现 , 旋扭山绿豆根瘤菌 M X DI . 氢酶表达的时间进程缓慢 . 一般情况下 , 诱导
12 h 可观察到氢酶活性 , 1 Z d 达到最大值 , 然后逐渐减少直至消失 , 全过程需 16 d . 而紫云
英 、 冬箭菩豌豆根瘤菌则分别需 刁d 、 s d 左右〔’幻 . 说明不同根瘤菌在氢酶表达的时间进程上
存在着较大差异 。
第 2 期 姚小文等 : 旋扭山绿豆根瘤菌 Mx D I ` 菌株氢酶诱导表达
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吸氢活性
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3 不同 PH 值对 M x DI 。 氢酶表达的影响
图 4 表明 M x DI . 的氢酶诱导表达对 p H 敏感 , H u M 培养基 p H 5 . 0一 6 . 0 有利于氢酶诱导 .
PH .5 5 时 , 吸氢活性出现最大值 , p H 值大于 6 . 0 , 吸氢活性降低 . ,
2
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4 裸对 M x D I . 氮酶表达的影响
在 H UM 培养基中加入不同浓度的 N se 一: , 结果 (图 5 ) 表明 : 小于 1 林m o l / L N ic l: 明显促
进 M x DI . 的吸氧活性 , 0 . 5 , m ol L/ 镍可使吸氢活性提高至 3 . 月倍 , 而大于 1 p m ol L/ 镍则抑制
吸氢活性 , 镍浓度为 10 p m of / L 时 , 吸氢活性比不加镍约下降 75 % 。
3 讨论
从实验中发现 , 旋扭山绿豆根瘤菌 M X DI . 氢酶表达的时间进程缓慢 . 一般情况下 , 诱导
12 h 可观察到氢酶活性 , 1 Z d 达到最大值 , 然后逐渐减少直至消失 , 全过程需 16 d . 而紫云
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存在着较大差异 。
第 2 期 姚小文等 : 旋扭山绿豆根瘤菌 M x D I 。 菌株氢酶诱导表达 6 9
因素所致 。
加入一定浓度 的微量元素镍明显促进 M x DI 。 的吸氢活性 , 是因为镍可能 参与了氢酶蛋
白的合成 。 S tult s 等证明大豆根瘤菌的氢酶是一种含镍金属酶 〔’ 6〕 , 他们认为 , 镍除了是大豆根
瘤菌吸氢酶的组分外 , 还扮演着一个调节氢酶表达的角色〔’ ” ] .
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