全 文 ：1 9 93 年第3 期 国外农学一蚕业
根癌农杆菌介导的小构树的性状转化
植本末男等
以根癌农杆菌感染小构树 (Br s u os o nt ea i
a k
之扭 o k iS id e) 的子 叶及 叶片导入外源基 因
(3 5 5
一
U S G)
, 用含有卡那霉素的培养基选择
转化细胞 ,在获得 的个体 中发现 了导入的基
因 。 以带有 件葡萄糖昔 酸酶 ( G U )S 基因的
3 5
一
G U S 嵌合基因作 为导入基因 ,而 以卡那
霉素抗性基因作为选择标记基因 。 农杆菌感
染 40 天后即可见有不定芽形成 。 用于转化体
选 择的培 养基 以 添加 25 m g l/ 卡 那霉 素 的
M S 分 化培养基最 为适宜 。 因卡那霉素本身
的影响 ,故不能在含卡那霉素 10 m g l/ 以上
的分化培养基上选择不定芽 。 在农杆菌感染
后置于添加卡那霉 素的选择培 养基时 , 以接
种 4 天内先在不含卡那霉素的分化培养基上
培养 , 然后再移于选择培养基的方法其不定
芽形成率较高 。 供试转化的小构树组织在接
种 4 天后选择的情况下 ,子 叶的不定芽形成
率为 n . 4% ,叶片为 28 . 4% , 以后者较高 。 在
调查选择的卡那霉素抗性个体中 , 有 90 %具
有 G U S 活性 。通过印迹杂交检测确认了 7 个
卡那霉素抗性个体 中有 5 个导入 了外源基
因 , 即为转化体 。
近年来 , 桑科植物 的组织培养法业 已确
立 ,基因操作 已成为可能 。 外源基因导入植物
的方法有 电激法和微束霍弹法 , 将基因直接
导入细胞的方法及通过病毒或细菌等导入的
间接方法 。 桑科植物 因通过愈伤组织或原生
质体难以形成再生个体 。 因此 , 目前通过外源
基因直接导入法获得转化体较困难 。 在桑的
转化方面 ,盯井 ( 1 9 90 )报告了采用根癌农杆
2 天 , 然后逐渐分散 。 在第 4 龄和 5 龄期 间 ,
蓖 麻蚕大量摄食人工饲料 ,结 果大量粪便积
存在蚕座上 , 必须在隔天喂食时除沙 。 由于蚕
都紧紧地贴附在蚕座的塑料蚕网上 , 除沙很
方便 。 试验中 ,整 个幼虫期均未发现病蚕 ,说
明这种人工饲料育有利于蓖麻蚕的饲育及继
代 。
人工饲料育蓖麻蚕 ,幼虫期的发育经过
是 20 一 2 天 , 和以鲜 叶喂养的对 照相 比 ,发
育状况 良好 。 幼虫期的发育开差为 2 天 , 但由
于人工饲料喂养 ,蚕能不间断地摄食 , 不受喂
养次数的限制 ,结果还是令人满意的 ,到眠期
眠蚕的体重差异甚微 ,四 眠蚕体重达 。 . 84 9 ,
蜕皮也相当整齐 。
人 工 饲 料 育 蓖 麻 蚕 茧 平 均 全 茧 量
.2 20 9
, 平 均 茧 层 量 2 01 . s m g , 茧 层 率
1 0
.
1%
, 比鲜叶喂养的低 。我们也检出了少量
的粗糙茧 ,其茧层薄而软 , 里面有未完全蜕皮
的蛹 ,表明仍存在一些生理学方面的问题 ,说
明人工饲料的营养不够均衡 。 但健康的雌蛹
均正常羽化 ,交配后产下良卵 ,产卵数量平均
为 17 3 士 25 ,其正常孵化率超过 95 % 。
总之 ,本次实验使用了更优 良的人工饲
料喂养蓖麻蚕 , 蚕发育正常 , 产卵多 。 结果还
表 明 ,这种人工饲料在蓖麻蚕繁种继代方面
是相当成功的 ,并且为科学研 究和蓖麻蚕的
蚕种生产提供了有用的饲料 。
李珍译 自《 I n d i a n
S e r i e u l t u r
e 》
19 9 2
,
3 1 ( 1 )
张国政 校
J
o u r n a l o f
: 5 3~ 5 7
国外农学一蚕业 总第 5期
菌转化桑获得了成功 。
本次 , 我们采用了根癌农杆菌转化葛首
的 方法 ( E n o m o t o 等 , 1 9 9 0 ) , 利 用 O h y a m a
和 O k a ( 1 9 8 0) 所报告的小构树不定芽分化体
系的培养条件 ,成功地将外源基因导入了小
构树 ,本文即报告其结果 。
材料与方法
拌 , 3 7 C 反 应 3 0分 钟 后 , 再 加 入 。 . Z M
N a ZC O 。 溶液 l m l 中止反应 , 用荧光分光光
度计于激发光波长 3 6 5n m 、 发光波长 4 5 5n m
测荧光强度 。
为确认导 入基 因的存 在 , 取具 有 G U S
活性 的 7 个个体的叶片 , 用 R o g e r 等 ( 1 9 8 8 )
的方 法处 理 D N A , 再通 过 E co R I 酶切 , 以
G U S 基因作探针进行印迹杂交 。
转化 实验 中 , 采用无菌播种得到的小构
树的子叶 (播种后 10 天 )及试管内通过茎顶
培 养增殖 的茎芽 (继代后约 1 个 月 )上的叶
片 。 以带有 C a M v 35 S 启动子和 p一葡萄糖昔
酸酶基因的 35 5 一 G U S 嵌合基因作为导入基
因 。 采用带有本嵌合基因及卡那霉素抗性基
因 的载体质粒 p B l l 2 1 ( C l o n e t e c h C o ) 通过
根癌农杆菌 ( S t r a i n L B A 4 4 0 4 )感染导入小构
树 。 农杆 菌 用 液 体 L B 培 养 基 振 荡 培 养
( I OO r p m
,
1 8 小时 ) 增殖后 ,调 整菌数 为 1 0 8
个 / m l 即可用于感染实验 。 将切取的组织片
(叶片为 s x l o m m )用菌液浸渍数分种 , 然后
用灭菌滤纸吸除过剩菌液 ,置于不定芽分化
培养基上 。 分化培养基以 M S 为基本培养基 ,
在其基本组成 内添加 2% 蔗糖 、 。 . 2%半乳聚
糖及 l m g l/ N 6一 B A ,于 1 21 〔 C灭菌 15 分种 , 后
加入 O 、 2 5 、 5 0 、 1 0 0 及 2 5 om g / l 卡那霉素 , 在
此培养基上形成的不定芽即为初选转化体 。
选择过程中 , 为了抑制农杆菌的增殖 , 培养基
中除添加卡那霉素外 ,还添加了 1 0 m g l/ 曲
棒霉素 (抗生物质 ) 。 另外 ,培养过程中转换培
养基数次 。 培养是在 日光灯 、 20 0 0 L u x 光强 、
日 1 6 小时光照 、 26 一 27 C条件下进行的 。 培
养容器用 gc m 的培养皿 。
G U S 活性是用对卡那霉素显示抗性 的
个体上部 1一 2 叶采用 Je f f e r s o n 等 ( 1 9 5 7 )的
方法进行检测 。 将定量的叶片加入少量的海
砂及 裂介缓冲液搅匀 , 离心得上清液 20 川 ,
再 在其中加入裂 介缓冲液 1 8如1 , s m M 4 一甲
基加州 月桂 酸基葡萄糖 昔 (4 M U G ) 4 0川 搅
结 果 (
非转化小构树 的不定芽形成率 ,子 叶及
叶片在不加卡那霉素的分化培养基上几乎都
是 1 0 % ,但在含有 25 二 g l/ 以上卡那霉素的
分化培养基上 ,其不定芽的形成明显受到抑
制 。
接种农杆菌的小构树组织 , 子叶 、 叶片在
添加 25 m g l/ 卡那霉素的培养基上都可见有
不定芽的形成 ,但 50 m g 八以上的添加区 , 其
不定芽的形成受到阻碍 。 将感染农杆菌的组
织先在不含卡那霉素的培养基上培养 4 天 ,
然后再转入含有卡那霉 素的培养基 , 其不定
芽形成率子叶为 n . 4 % , 而叶 片为 28 . 4 % ,
以后者较高 。另外 ,把感染农杆菌的叶片直接
置于含有卡那霉素的培养基上 , 其不定芽形
成率为 3 . 1% ,而先用不含卡那霉素的培养
基培.养 4 天后再转入选择培养基 ,其不定芽
形成率高达 28 . 4% (表 1 ) 。 子叶也同样具有
这种倾 向 。 还有 ,经转化处理的小构树各组
织在不含卡那霉素的培养基上 , 不定芽形成
率也明显低于非处理区 , 同时 ,不定芽生长延
迟 。 另外 , 为抑制选择培养基上农杆菌的增
殖 , 培养组织用添加 1 0 m g l/ 曲棒霉素的培
养基继续培养 ,但农杆菌往在不能完全去除
而与组织共存 。
将 卡 那 霉 素 抗性 的 不 定 芽 于 含 有
B A o
.
Zm g 八的 M S 培养基上培养约 1 个月 ,
取生长的茎芽上的叶片 ,调查 G U S 活性 。 其
结果是 13 个个体中有 1 2 个具有 G U S 活性 ,
1 9 9 3年第 3期 国外农学一蚕业
选择效率为 0 9%以 上 。 但是 , 比较 个体间的
G U S 活 性 , 最 小 值 1 14 , 最 大 值 为 14 3 4 8
4
一
M u n m o l
e s
/ g
· 鲜重 / 3 o m i n , 相差 1 2 6 倍
(表 2 ) 。
表 1 小构树组织形成不定芽
(接种农杆菌后 40 天 )
l于那霉 素 外 植 体 数
( m g l/ ) 外植体 形成不定芽 频率 ( % )
041.100R
` .10701032
O一 2 5 五
子 2 5
5 O
;::
28象019010一/Q山O八0丹O八jCJ,曰2O~ 2 5
2 5
5 O
10 0
2 5 0
* 根癌 农杆菌感染组织在 无 卡那霉 素培养 基中 4 天 , 然后
转入 含卡那霉素 25 m g l/ 的培 养基 , 培养 40 天后从组织
中形成的幼 芽数 。
表 2 35 5 一G U S 转化的纸桑中 G U S 活性
转化
1卜转化
G U S 活性 l 转化
7
7
I
,
3 1 3
1 1
,
5 0 3
1 14
14
,
3 4 8
77 3
7
8
9
l 0
1 l
l 2
l 3
G U S 活性
9
,
7 7 1
2
,
4 0 5
1 7 9
6 9 5
3 1 5
8
,
0 92
2 98
* 4一 M U
n rn
o
l
e s / g
· 鲜重八 3 o rn i n
为确认导入基 因的存在 , 还进行了印迹
杂交 , 试验的 7 个个体中从 5 个个体检出了
来 自 2 . 3 k b 的导入的 D N A ( G U S 基因 ) 片
段 , 即确认为转化 个体 。
考 察
非转化体的叶片及子叶在不含卡那霉素
的培养基上 ,其不定芽形成旺盛 ,相反 , 感染
农杆菌后在添加卡那霉素的培养基上不定芽
形成率显著降低 。 这是 由于感染农杆菌后 , 获
得了卡那霉素抗性的细胞在器官开始分化以
前 ,受到了卡那 霉素对生长发育的阻碍 。 葛
芭的情 况也是 如此 , 将感 染期间为 2 、 4 及 6
天进行 比较 ,结果表明 , 感染时间愈长 , 白化
植 物 愈 多 , 选 择 效 率 愈 低 ( E n o m ot o 等 ,
1 9 9 0 )
。 这便提示我们 ,要得到较高的转化效
率 , 充分考虑从农杆菌感染到转入添加卡那
霉素培养基的时间是很重要的 。
比较供试 叶片及子 叶的转化率 , 以叶片
的不定芽形成率较高 ,这是由于与子叶相比 ,
培养 的叶片切 口 多 , 所以 与共存状态 的农杆
菌感染的机会增多 , 故认为 ,作为外植片以叶
片更为适宜 。
在添加卡那霉素的培养基上选择 的 13
个个体中有 12 个个体呈现 G U s 活性 , 即认
为为基因导入个体 。 但是 , 个体间 G U S 活性
有很大差异 。 这种现象在其他植物的转化实
验 中也被证实 ,一般认为是由导入基 因的拷
贝数不同或位置效果所引起的 , 通过 印迹杂
交的结果也证实了导入基因的拷贝数个体间
存在差异 。
通过 印迹杂交得 知 , 7 个个体中有 5 个
个体含有 2 . 3 k b 中的片段 , 即确认 为转 化
体 。 而没有检出片段的 2 个个体 ,通过不定芽
的再生试验显示 了对卡那霉素的抗性 , 因此
认为 , 这是在通过农杆菌导入 D N A 时 , 只导
入了卡那霉素抗性基因 , 而 G U S 基 因没有
进入的个体 。
以上结果表 明 , 通过农杆菌的感 染来实
现小构树的转化是可能的 。 但 尚存在卡那霉
素浓度高时便不能形成不定芽及农杆菌感染
后 , 转入选择培养基其不定芽形成能力显著
降低等问题 。因此 ,今后有必要研究导入基因
中的报告基因及农杆菌感染后移入选择培养
基的时期以提高选择效率 。 由此认 为 , 今后若
能利用在不抑制植物生长发育及分化的条件
下 ,能够选择转化体的优良的报告基因 , 采用
此导入体 系 , 在桑科作物 中作出有用的育种
素材是可能的 。
管志文译 自《 日蚕杂 》
1 9 9 2
,
6 1 ( 3 )
: 2 0 1一 2 0 6
陈爱玉 校