全 文 ：1 9 9 1年第 2欺
N O
。
1 9 9 1
李 一、 二 正
华 南 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ,
J O U R N A L O F 吕O U T H C H I N A N O R M人 L U N IV 它RS I T y
( N A T U R A L S C I E N C E E D I T I O N )
, , , _ 司 .
旋扭山绿豆快生型根瘤菌D 5I 1菌株的研究 ’
黄文芳 李国盛 莫熙穆
( 时二物系 )
摘 要
作者从旋扔山绿亘 ( D es 舰。 id 川n i o t or lt 机 ) 根瘤中分离到快生型根瘤菌 D I51 菌株 。 其生
氏速度在指数生长期为。 、 2 2 2代 /时 , 衣一 3 0 ” C下液体振荡培养30 一 4 8小时后明显育昆浊 . 容易利用蔗
糖 、 截糖 、 鼠李糖 、 甘露醉和 a 一酮戊二酸等多种碳源 , 而不利用淀粉和纤维素 . 能利用磷酸氢
一二按和谷氨酸等氮源 ,但利用酵母膏最好 , 不利用蛋白陈和尿素 . 在酵母膏一甘露醇或蔗糖或葡萄
糖等培养基土降低 p H 使B · T · B (澳蔡香草酚兰 )变黄 , 而在酵母膏一柠檬酸 、 丙酮酸等培养基
提高 p H使 B · T · B变蓝或深蓝 . 不产生 3 一 酮基乳糖 . 7天使石蕊牛奶 培 养 基 p H升高和形成
孔清环 , 而 3 0天后布酸 . 研究结 哄丧明D I 5 1菌株是 D es 川。 dl’ u m 属中一些种的一株快生型有效根
瘤菌株 .
关锐饲 : }一白绿豆属 ; 快生 7刚仅瘤菌 ; 结瘤 ; 固氮 ; 感染
中圈法分类号: Q g 、 5 . 1 3
旋扭 山绿豆 咬D : 。 。 d 沁。 `时 or 栩 。 ) 是一种优 良的热带豆科牧草呱 7 3 , 澳大 利亚所应
用的根瘤菌 C B 6 27 是属于慢生型菌株仁5 · 7〕 . D a t o R A . 博士认为 刀。 阴 。 d2’ 。 。 这一属豆
科植物的根瘤菌是属于慢生型菌株仁 5 〕 . 我们采集了 15 个旋扭山绿豆根瘤样品 , 从中分离出
30 多个 菌株 , 经过试验 , 筛选出 ] 株结瘤 固氮较高的快生型有效菌株 D I 5 .1 并对 D 15 1菌株
峋生理生化特性和结瘤固氮进行了研究 .
1 材料和方法
1
.
1 分离根瘤菌的培养基 酵母膏一甘油琼脂 , 酵母膏一甘露醇琼脂 , 酵母 膏一 蔗 糖琼脂
和酵母膏一 d一葡萄糖酸钠培养基 , 均加入刚果红溶液 。
1
.
2 宿主植物种子 旋扭山绿豆和银叶 山蚂蝗 ( D eS o 0 d l’u 1n 泌。 铆 at u m )种子均由广西畜牧
研究所提供 : 异果山绿亘 、 D . h et er oc ar p 。 。 ) 和异果 山绿豆缅甸变种 ( D . h et e : 。 c a1’ P 。川
呱 .r 如 rn 姐 in cu l)n 种子均由华南师范大学生物系固氮研究组提供 . ,
本文 1马9 0年 3 月收到 .
. 为中国科学院科学基金资助的课题 ,
斗5
1
.
3结抽试验 采用蓝色塑料培养盒 , _ _L层装干净河砂 , 下层盛无氮植物营养液 , 经高压灭
菌 . 植物种子经消毒后发芽 , 以 1 x 10 ” / m1 根瘤菌悬液接种 , 再播入砂从 中 , 在培养室 自
然光照下培养 , 不断补充灭菌的无氮植物营养液 . 根瘤 乙炔还原话性的测定基本上按照上海
植物生理研究所介绍 的方法亡 1 〕 .
.
4 李
4
。
1
宁板长妞黔代方补) 、 矛么咖、命 几 ,酥液体培器寨, 、 , 、 。下、 、。 ,
液在了21 型分光光度计 5 2 5 n m 波长下测定光密度的变化计算出生长速度 〔 4 〕 .
1
.
4
.
2 3 一 酮基乳糖产生 ,石 蕊牛奶试验和各种破水化合物利 用产酸 产碱 ( B . ` r · B 试验 )
试验 基木上按照 仁2 〕 介绍的方法进行 。
.1 4
.
3 砂盐性试验 以酵母膏一蔗糖培养基 为基础 , 配成不 同浓 度氯化钠的培养基 , 在 27
一 2 8 “ C下培养观察其生长 。
1
.
4
.
4 碳源利 用 以 酵母膏一蔗糖培养基为基础 , 用不同的碳水化合物代替蔗糖 , 在 27 一
2 8
O
C下培养观察 D I 5 1的生长 .
, . 4
.
5 氮源利用 以酵母膏一蔗糖培养基为基础 , 用不 同的氮源物质 代替酵母 膏 , 在 27 一
28
“
C下培养观察 D I 51 生长 .
1
.
4
.
6 不同 p H值对 D 5I 1生长的影响 以蔗糖一酵母膏液体培养基 , 用 H CI 或 N a O H调节
配成不同的 p H . 接种后在 25 一 28 “ C振荡培养 48 小时 . 在 72 1型分光光度计测定 O D 值 。 在
p H S 一 2 型酸度计测定 p H变化 .
2 结 果
2
.
1 DI 5 1的生理生化特性
( 1 ) D 5I 1菌株为革兰氏阴性菌 , 大小为 0 . 42 一 0 . 56 又 0 . 85 ~ .1 6 7 协 m . 在酵母膏一蔗
糖或甘露醇琼脂平板培养基于 3 0 O C下培养 3 一 5 天 , 菌落可达 2 一 4 m m . 在斜面培养基 一 :.I
拐小时便可长满 , 无色 , 产生大量的粘液 。 不吸收刚果红 。
( 2 ) 1D 51 在酵母膏一甘露醇液体培养基 30 O C摇床振荡培养 ,在指数生长期生长速度为
0
.
2 2 2代 / 时 , 培养 30 一 4 8小时呈乳 白色混浊的菌液 .
( 3 ) D 5I 1不产生 3一酮基乳糖 , 与根癌农杆菌 C 5 8 ( 月 gr ob o ct e : 沁 m t 、 m ej ac l’e , : , 华
中 农 业 大 学土化系提供 ) 呈阳性反应完全不同 , 在蔗糖 、 甘露醇等 B · T · B培养基中呈酸
性反应 ( 表 ] ) , 与蔗糖 、 甘露醇糖发酵试验产酸不产气是一致的 . 在柠檬酸粼:和 a 一酮戊
二酸盐等七种有机酸软 中 B · T · B反应都 呈硷性 ( 表 1 ) . 石蕊午奶试验 7 天呈硷 性反应 ,
有 o . s c m 的乳清环 , 乳清环上有一层兰色 , 而 30 天后则呈酸性 . 0 . 17 M N a CI 酵母膏一蔗糖培
养基 _ L尚可生长 , 但在 0 . sl M N a CI 的培养 基上则几乎不生长 ,而在 o . 6 8 M N a CI 一中完全不生
长 , 而比根癌农杆菌 C 58 耐盐性 ( 0 . 6 8 M N a CI 培养基上尚可生长 ) 差得多 ( 图 1 ) 。 从图
中发现D I 5 1比 C 5 8对 N a C I浓度较敏感 .
表 1 碳水化合物的利用和 B · T · B反应
碳源
葡萄葡
本 怡
鼠李糖
半乳糖
草 糖
麦芽糖
生长情况 B . T 。 B反应
酸
碱磁
+ 十 十
十 十 十 +
棉子精
材`露醇
卜}` 台11
+ 十 + +
一卜 + + 十
决 + + 十
碳源
d 一 糖萄糖
酸钠
可溶性淀粉
纤维素
柠檬酸
丙酮酸
仓 一 酮戊二酸
拍琉酸
苹某酸
草 酸
丙二酸
生长情况 _ _ 些里迢鲤应_ __ _ _ _ _
奋+.+十
十
+
+ + +
十 干
干
小
丰
酸精糖乳蔗
酸限
表 2 不同 p H对川 1S 和 C 58 生长的影响
D I 5 1
」吝养前培养篆 p H
培养后培养墓 pH变化
一 0 . 1 5
+ 0
。
2 5
一 0 . 2 4 尸
一 0 。 3 4
一 0 。 6 5
一 1
。
2 5
一 0 。 0 7
一 0 。 1 6
O D 值
0 . 4 0 9
培养后培养基 p H变 化 . O D值
d
。
1 5
6
。
5 4
7
。
3 6
7
。
7 0
8
。
0 8
8
。
9 4
9
。
7 4
10
。
8 6
一一一如口~ ~ ,一~一
1
。
02 7
1
. 0 7 0
1
。
0 5 0
1
。
0 5 3
0 。 6 9 8
0
。
0 27
0
。
0 2 5
一 0 。 10
十 0 。 2 7
一 0 . 3 0
一 0 。 7 6
一 0 。 9 2
一 1 。 2 5
一 1 。 5 1
一 0
。
1 2
0
。
5 20
0
。
5 56
0
.
6 2 5
0
。
5 3 1
0
。
5 50
0
。
6 4 3
0
。
6 66
0
。
0 7 0
一 . . . , .月 . . . . 甲 . . 一 . . . 曰 . . . . . 一 . . .一 , . . . . . . . . . . . . . . . 峨. . .
( 4 ) D 巧 1苗株可利 用多种单糖 、 双糖和有机酸 , 但利用程度有所不同 ( 表 1 )
材覃籽 ( 海藻糖 ) 、 鼠李糖 、 棉 子糖 、 甘露醇 、 葡萄糖 、 甘油 、 d 一葡萄糖酸钠 、 蔗糖和乳
料 等 碳 倾 利用较好 , 对木糖 、 半乳糖 、 麦芽糖稍差 . 可以利 用多种有机 酸 ( 表 ] ) , 不能
利 用淀粉和纤维素 . ` ’
“ 5 ) 1) 15 1对氮源的利用有所不同 对 ( N H 4 ) 2 5 0 4 、 N H ; C I 、 C a ( N O 。 ) : 和 N H ;
N O
: 利 l月较差 , 而对 ` N H 4 ) 、 H P O ` 和谷氨酸钠利用较好 , 对酵母提取物的氮源利用最好 ;
不利 用蛋白陈和尿素的氮源 .
( 6 ) 不同 p H对 1) 1 5材胜长的影响结果见表 2 从表 中可见 D I 51 在 p H 6 . 5 一 8 之 间生 一长
八好 , 低干 滚或高于 8 生长不好 , 超过 9 则几乎不生长 . 比 C 58 耐碱性差 ( C 58 在 p H 9 . 74 生
一长良好 ) . 在涪养 中 , 除 了在 p H 6 .浏培养液培养的菌液的 p H值略有升高外 ( 原因待查 ) ,
其余 7 个处理的 p H 值都有下降 . 在 p H S . 9 4时 p H值下降最大 , 可达 .] 2 5 . 与C 58 有所不同 ,
C 58 是在 p H 9 . 7 4下降最大 . 从结果表明 D I 51 在酵母膏一蔗糖培养基中产生酸性物质 , 使p H
介死下降 .
2
.
2 0 1引对宿主植物结移固氮的特性
( 1 ) 回接旋扭山绿豆结瘤 固氮效本高 接种 D I 5 1 菌株的旋扭山绿豆在无氮植物营养
4 7
液砂培养基中培养5 3天 , 10 0 % 结瘤 , 且结瘤多 , 根瘤发育良好 . 平均每株根瘤达 35 . 04 个 ,
鲜重达 3 5 . 48 m g , 每个根瘤为 .] 05 m g鲜重 、 植物生 长好 , 地 上平均每株干重达 4 7 . 8 9 m g 比对
照 ( 不接种每株只有 10 . 7 4m g ) 高 3 . 46 倍 .
( “ ) 创 5 `菌株不仅能使旋扭山绿豆结瘤 固氮 , 而且能使银叶山蚂腹和异某山解幕(一
种热带豆科牧草 ) 仁“ · 7 」 加。% 结瘤固氮 ( 表 3 、 . 培养 32天在银叶山蚂蝗 .上结 瘤虽然少于
旋扭山绿豆 , 但根瘤 比旋扭山绿下的根瘤大 , 每个根瘤可达 2 . g o m g鲜重 , ` 卜每植株 的 根瘤也
较重 ; 但 D I 51 在异果山绿豆结瘤较差 , 每株只有 8 . 7个瘤和 9 . 2 m g 根瘤鲜重 , 比前两种宿主
差得多 .
( 3 ) D I 5 1菌株结瘤 固氮能力具有一定的稳定性 酵母膏一蔗糖琼脂培 养 基上连续转
接培养 5 代后的 D I 51 菌株 , 对D se m o dl’ o m属的几种豆科植物结瘤固氮能力仍然很强 , 植物
生长良好 ( 表 4 ) . 培养 36 天在旋扭山绿豆结瘤多 ( 5 1 . 3个 / 株 ) , 固 氮活 性 高 ( 5 7 。 10
n m o le S C
:
H
4
/ 株 · 分 , O 。 95 1 7 n m o le s C Z H 4 / m g鲜瘤 · 分 ) . 而在银叶山蚂蝗结瘤少些 ,
固氮活性低些 , 但每株根瘤鲜重 ( 9 m g Z 钱 ) 和根瘤发育 ( 2 , 4 2 m g / 个瘤 ) 都比旋扭山绿
豆好 . 在异果山绿豆和异果山绿亘缅甸变种 (一种热带豆科牧草 )〔 “ 〕 两种宿主植物上同样都
结瘤 , 但根瘤发育和固氮活性 、 植株生 长均比前两者差些 , 这可能是 D IS ] 对这两宿主 的侵
染和共生特性差些 。
表 3 0 ! 51 菌株接种几种宿主植物结油和生长
宿主植物 干重 / 株
( m g )
根瘤鲜重 / 株
( m g )
根痛鲜重 / 瘤
( m g )
根瘤数 / 株
( 个 )
旋扭山绿豆
银叶 山蚂蝗
异果 山绿豆
3 2
。
7 8
4 5一 0 0
2 2
。
6 1
2 3
。
9
3 6
。 3
0
。
9 2
2
。
9 0
1 。 0 8
2 6
。
9
1 2
。
6
8
。
7
表 4 第 5 代 DI 别菌株对几种宿主植物结泊固氮作用 .
宿主植物 干重 / 株
( m g )
根瘤鲜重 / 株 根润鲜重 / 瘤
( m g )
根瘤数 / 株 乙 炔还原活性
( m g ) ( 个 )
n m o l e s C Z H 4 n m
o l e s C么 H `
/ 株 · 分钟 / m g根瘤鲜重 · 分材
旋扭山绿豆
银叶山妈蝗
异果 山绿豆
异果山绿豆
腼甸变种
8 0
。
0 0
9 0
。
0 0
4 6
。
5 0
6 0
。
0 0
9 9
。
0 0
1 6
。
7 9
1
。
1 7
2
。
2 4
1
。
1 9
5 1
。
3
4 0
。
0
1 4
。
1
5 7
。
10 4 4
1 0
。
1 2 2 9
2 。 9 6 3 8
0
。
9 5 1 7
0
。
1 0 2 3
0
。
1 7 6 8
4 8
。
0 0 2 8
。
5 0 1
。
4 9 1 9
-
1 . 5 5 0 3 0
。
5 4 4
。 D儿 飞菌株在酵母膏一蔗糖琼脂培养基连续培养 5 代 .
色口户 7 :水`
图 ]
N` e工浓庄 (讨)
不同浓度的 NaC I 对 I D51和 C s s的影响
· — · DI 5 b· · ” , ` · ·… C 6断
( 0
。
0 0 1 7M 为正常 N a C I浓度 . )
乙 讨论
我们所分离的结瘤固氮效率高的菌株D I 51 生 长速度为每小时 0 . 2 2 2 代 , 这 一 生长速度与
快生型 R . o el i l of ` 菌株的生长速度 ( 0 . 2 代 / 时 )相似 〔 1们 , 比介于快一慢型菌株之间的百
脉根 C A 8 1 1 6菌株的生长速度 ( 0 . 19 6代 / 时 ) 快仁3 〕 . 在平板培养基上 3 一 5 天菌落可达 2 一
4 m m , 在斜面培养基上 4 8小时就可长满且有大量的粘浪 , 在液体培养基振荡培养 30 一 48 小
时就成为乳白色的混浊菌液 , 这些都与慢生型 C B 6 27 菌株完全不同 . 对蔗糖 、 鼠李糖 、 覃糖
( 海藻糖 ) , 慢生型菌株是不能利用的仁10 〕 , 而 D I 51 菌株则能很好地利 用 . 蔗糖 、 甘露醇 、
葡萄糖等 B · T · B反应和蔗糖 、 甘露醇发酵试验都呈酸性反应 , 这 些 都 是快生型菌株的特
点 . 但在石蕊午奶中 7 天则呈硷性反应并有乳清环 , 而 30 天后则呈酸性反应。
有人曾经从D 。 : m o d l’u 。 属的根瘤分离出快生型菌株 , 但认为是伴有快生型 细 菌农杆菌
株所致〔 9 〕 。 而我们所分离约 D 5I 1菌株 3 一酮基乳糖试验 、 氮源的利用和耐 盐 性 与 农杆菌
都不相同 . 另外许多学者认为慢生型菌株是不能利用蔗糖的 仁1 。〕 , 而我们所分离的 D I 51 培
养物在酵母膏一蔗糖培养基上连续转接培养 5代都能生长得很好 . 所以 , 我们的试验感染引
起旋扭山绿亘等 4种宿主植物结瘤 固氮完全是由快生型D IS ]_菌株所致 。
参考文献
〔 1 〕 _ !: 海植物生理研究所固氮研究室 . 植物学报 , 1 9 7 4 , 16 ( 4 ) :
〔 2 〕 中国科学院微生物研究所细菌分类组 . 一般细菌常用鉴定方法 .
〔 3 〕 宁国赞等 . 微生物学通报 , 1 9 5 9 , 2 3 ( 2 ) : 5 0一5 2
〔 4 〕 B l a n c a S H , D e n n i s D F . A p P l e d a n d E n v i r o n m e n t
习0 6 一 2 1 0
3 8 2一 3 8 4
北京 : 科学出版社 , 1 9 7 8
M i e r o b i e l o g y
,
1 9 8 4
,
4 8 ( i )
:
〔 5〕
〔 6〕
〔 7〕
〔 8〕
〔 9〕
〔 10 〕
D a上 e下之 八. 1且 : “ 1几x p l o it in gth e ij e g u m e一 Rh iz ob it一 m S y mb o s i s in T r op i e al
A疮r i e ul t ur e” ( V in e en tJ M, e t a l . ) . H o n o l u l u : C o l l e g e o f T r o p i e a l A g r i e u l t t一r
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1 9 7 7
.
2 7 3 一 3 x l
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.
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o f T h e U n i t e d N a t i o n
,
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m a n n i t o l o r
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