全 文 ：徽 生 物 学 通 报 19 9 3年 20 ( 6 )
旋扭山绿豆快生型根瘤菌不结瘤突变株的分离
林德球 黄 才 ’ 王 黎
(华南师范大学分子生物工程研究中心 , 广州 5 106 3 1)
摘耍 旋扭山绿豆快生型根瘤菌 DI 2 02 菌株在叮陡橙 (2 。阳m/ l , 30 陀 / m l) 的作用下 ( 28 ℃培养
7天 ) , 可以诱发不结启 N od 一突变株 。 从单菌落结瘤试脸表明 , N od 一 突变个体占群体数的 10 一 20 % . 随
机挑取的未经叮吮橙处理的 20 个单菌落的回接试脸 , 旋扭山绿豆植物能正常地结瘤固氮 . 说明控制结
, 作用的基因对叮健橙处理敏感。
关工调 旋扭山绿豆 ; 快生型根瘤菌 ; 不结瘤突变株 ; 叮咤橙
iH ga hs il ]最先用质粒消除 (叮陡橙处理 )
和接合试验的方法推断三叶草根瘤菌的结瘤能
力是由一种附加因子 (质粒 )控制的 。 Z ur k o w -
。
ih[
幻用热处理的方法获得 三叶草根瘤菌的不
结瘤突变株 , 证明三叶草根瘤菌携有一个控制
结瘤特性的 S y m 质粒 。 目前一 些研究者认
为 .s[ `〕 ,绝大多数快生型根瘤菌的结瘤能力是由
一共生质粒所控制 , 但也有例外 。 M as et r s on [’j
的研究表明 , U S D A 1 94 控制结瘤的基因不在
质粒上 , 而在染色体上 。 为了弄清旋扭山绿豆
快生型根瘤菌的结瘤基因 ( N od 十 ) 是否位于质
粒上 , 我们采用消除质粒的手段进行了初步研
究 , 现报告如下 。
材 料 与 方 法
(一 ) 材料
1
. 供试菌株 : 本校分子生物工程研究中心
从旋扭山绿豆根瘤中分离的快生型根瘤菌株 。
2
. 供试植物 : 旋扭山绿豆种子来源于本校
生物系牧草试验基地 。
3
. 培养墓 : ( 1) 根瘤菌用 LM S Y 培养基 9j[ 。
( 2 ) 植物无氮培养基 ( g ) : K Z H p o ; z , M g s o .
1
, 0
.
5% H
:
B ( )
3 4m l
,
C a CO
: 0
.
2
,
eF S O
; 微量 ,
0
.
5% N
a ZM o o
;
4m l
, 琼 脂 1 0 , 水 10 0 0 m l 。
( 3 ) 旁 氏植物营养液 ( g ) : K C I 0 . 3 1 7 , C a 3
( P O
.
) : 0
.
1 8
,
C a S O
; · ZH
Z
O 0
.
13 7
,
M n S O
; ·
H : 0 0
.
0 0 6
,
K
:
H P O
; 0
.
2 6 8
,
M g SO二 7 H Z O
0
·
0 5 5
,
F e
:
( 5 0
.
)
: 0
.
0 2 7 , H
3
BO
: 0
.
0 0 5
, 水
1 0 0 0m l
.
(二 ) 方法 —1 . 叮吮橙 ( A e r id i n e o r a n g e ) 贮备液 : 按文献〔9〕配成 10 0 0拜g /m l 的原液备用 。
2
. 硫酸链霉素 ( S m ) 抗性突变株的筛选 :
用灭菌的称量瓶称取所需量的硫酸链霉素
( 20 0一 5 0 0扛g /m l ) , 用少量无菌水溶解后 , 加入
熔化好的 L M SY 固体培养基中 , 倒皿备用 。 按
照宁林夫等 .8[ ` 0] 的方法 , 每皿接入细菌细胞 >
1护 /m l , 涂布均匀后置 28 ℃培养 , 挑取单菌落
保存于 L M S Y 斜面上 。
3
. 生长曲线的测定 : 25 o m l 的三角瓶内装 一s o m l 含叮吮橙 ( A O ) 3 0拌g /m l 的 LM S Y 培养
基 , 接种后 28 ℃ 15 o r / m in 振荡培养 7天 。 每隔
2 4 小时取样于 7 21 型 分光光度计测 一次菌液
浊度 , 空白用含 A 0 30 拌g /m l 的 L M S Y 培养
基 . 对照组为不加叮陡橙的菌体培养液 .
4
. 叮陡橙处理方法 : 向 L M S Y 液体培养
基中加入叮陡橙贮备液 , 配制成所需浓度的叮
咤橙处理液 。 在每个 25 o m l 三角瓶里盛叮吮橙
处理液 80 m l , 用接种环接入斜面菌种一环 , 在
2 8 ℃恒温振荡培养 7 天 。 用各种浓度的叮吮橙
处理液稀释铺板 。 培养后 , 从平皿上随机挑出一1 0一巧 个根瘤菌的单菌落 。 每个菌落接两支
LM S Y 斜面 , 这两支斜面编为同一号码 , 置
28 ℃培养 。 待菌苔丰满后 , 将其中一支作结瘤
· 现在广东医学院生化教研室 。
DOI : 10. 13344 /j . mi crobi ol . chi na . 1993. 06. 002
199 3年 20 ( 6 ) 徽 生 物
试验 , 另一支保存 。 按同样的方法做对照组 。
5
. 植物结瘤试验 : ( l) 旋扭山绿豆种子的
处理 : 参照文献 [ 6 ] 的方法消毒种子表面 。 把
消毒的种子在无菌培养皿中摊开 , 20 一 25 ℃条
件下催芽 2 天 。 ( 2) 试管结瘤试验 : 选芽长约
一一七了Z c m 的种子 , 放入盛有根瘤菌悬液的培养皿中 , 浸泡半小时 。 用接种环将根尖朝下接种到
圆柱形琼脂上 ; 于室温下培育 , 每天光照 16 小
时 。 ( 3) 盆栽砂培法 : 种子浸泡在根瘤菌悬液
中半小时 , 播种在灭菌的塑料沙盆中 , 供以
1 5m0 l旁氏植物营养液 , 培养条件同上 。
学 通 报 一 3 2 9 -
结 果
(一 ) 叮咤祖对根自菌生长和存活的形响
高浓度的叮吮橙 ( A O ) 对根瘤菌有强烈的
致死作用 。 本试验使用叮陡橙的浓度分别为 o 、
2 0 和 5 0拌g /m l . 菌株 D I Z o Z ( Sm , ) 的正常生长
曲线和在 30 拜g /m l 叮吮橙的生长曲线表明 (图
1 )
, 叮吮橙对菌株 D I 2 0 2 ( Sm , ) 的生长有较强
的抑制作用 。 培养后期菌液混浊度的下降与培
养时间的延长和菌体发生自溶有关 。
(二 ) 叮咤祖对根. 菌结 . 性能的影响
从菌株 D I Z o Z s( m r ) 分离的单菌落的结瘤
能力 (表 l) 和用不同浓度叮吮橙处理对根瘤菌
结瘤能力的影响 (表 2) 两次试验结果中看出 ,
对照组中选出的 21 个单菌落都能结瘤 。 这一结
果与李仲贤 9j[ 研究的紫云英根瘤菌的结瘤结果
有差异 , 表明旋扭山绿豆快生型根瘤菌株不容
易丧失结瘤能力 。 从含叮咤橙的各处理中选出
的 25 个单菌落作结瘤试验 , 有 4 个菌落不结
瘤 , 不结瘤突变率为 16 士 5% , 其结果低于 iH -
ga
s
hi[
, 〕用叮咤橙处理三叶草和菜豆根瘤菌所
获结果及李仲贤闭用叮吮橙处理紫云英根瘤菌
的结果 , 表明菌株 D I Zo Z ( Sm 『 ) 具有较强的叮
咤橙耐受能力 。
60
子3Qd
0 2 一 6 8
《 d )
图 1 D IZ o Z ( S m , ) 菌株的正常的和叮吮橙处理的生长曲线图
一 。 一对照 一△一叮吮橙处理
门脚奋 ` , 口~
衰 1 从 , 株 D 12 o 2 中分离的单 , 落的结 . 试段
第一次试验叮吮橙的浓度 (户g /m l) 第二次试获叮嘴橙的浓度 (陀 /已 )
0 2 0 0 30
, 株 结 , 情况 菌株 结瘤情况 菌株 结溜情况 自株 结启情况
0 2 1 1 + 0 2 2 1 十 1 10 1 + 1 1 1 2 十
0 2 12 十 0 2 2 2 十 1 10 2 + 1 1 1 3 十
0 2 13 + 0 2 2 3 + 1 10 3 十 1 1 1 4 +
0 2 1 4 十 0 2 2 4 十 1 10 4 + 1 1 1 5 +
0 2 1 5 + 0 2 2 5 + 1 10 5 + 1 1 1 6 十
0 2 1 6
· 十 0 2 2 6 + 1 10 6 + 1 1 1 7 +
0 2 1 7 + 0 2 2 7 十 1 10 7 十 1 1 1 8 +
0 2 1 8 + 0 2 2 8 + 1 10 8 十 1 1 1 9 +
0 2 1 9 + 0 2 2 9 + 1 10 9 + 1 1 20 +
0 2 2 0 + 0 2 3 0 1 11 0 + 1 1 2 1 +
1 1 1 1 十 1 1 2 2 +
1 1 2 3 +
1 1 2 4
1 1 2 5
1 1 2 6
.3 3 0
-
. 生 物 学 通 报 1 9 9 3 年 2 0 ( 6 )
衰 2 叮吮. 处理对… 结. 性. 的. 晌备之址叮吮橙浓度 (陀 /d ) 试脸菌株数 不结 , , 株数 不结 , 突变率 (肠 )第一次试脸 0 l 0 0 0
2 0 1 O 1 l O
第二次试脸 0 l l 0 0
3 0 1 5 3 2 0
(三 ) 不结 . 央变株的鉴定
旋扭山绿豆快生型根瘤菌经浓度为 20 和
3如 g /m l叮吮橙处理 , 共获 4 个不结瘤突变株 ,
其培养的形态特征与其对应的出发菌株一致 .
在 LM S Y 培养基上能迅速生长 . 单个菌落为圆
形 , 边缘整齐的半透明 、 粘液状菌落 。 经 uT 陡
橙处理作质粒消除试验的出发菌株具有 S m `
标记 , 用于第一次试验的出发菌株 D I Z o Z ( S m `
5 0 0) 对硫酸链祥素浓度为 5 0 拜g /m l 有抗性 .
用于第二次试验的出发菌株 D I 2 0 2 ( S m , 2 0 0 )
对硫酸链排素 20 陀 /m l 有抗性 . 而所选的 4
个 A O ( N o d一 )突变株仍具有相应的 Sm , 标记 。
因而我们认为这些 A O ( N od 一 ) 突变株是野生
型 D I Zo Z ( Sm , ) 的后代 , 不是污染的杂菌 .
讨 论
1
. 用叮吮橙处理能促使旋扭山绿豆快生
型根瘤菌 D I 202 结瘤能力的丧失 , 但在本试验
所用的叮旋橙浓度内 , 不结瘤突变率仅为 16 士
5%
, 低于 H i g as ih l[J 等的结果 . 由于叮吮橙对菌
株 D I Z o Z有较强的抑制作用 , 不能无限增大叮
吮橙的浓度 , 因此 , 能否选用适当的叮陡橙浓
度或其它方法来提高不结瘤突变率还有待进一
步研究 。
2
. 根瘤菌最显著的特点是能侵染相应的
豆科植物根系 , 形成根瘤 。 近年来 , 由于快速
筛选根瘤菌共生突变体技术 l[ ’〕 , 和 T sn 转座子
诱变技术 l0[ 〕的应用 , 对结瘤基因 N od + 的研究
进展很快 。 日益增多的证据表明 : 绝大多数快
生型根瘤菌的结瘤墓因 ( N od + ) 被编码于质粒
上 [’ 一 ` ·幻 . 根瘤菌结瘤特性的丧失是由于细菌细
胞大质粒的消失 . 用叮陡橙处理能获得不结瘤
突变体 , 且用不同浓度的叮吮橙处理 , 所得的
不结瘤突变率也不同 . 因而可推论 , 菌株 D I Z o Z
( S m
,
) 的结瘤基因可能位于质粒上 , 进一步的
研究有待于对出发菌株和不结瘤突变体质粒
D N A 的分离和鉴定 。
3
. 旋扭山绿豆快生型根瘤菌是作者首次
分离的 ,具有一些特殊的特性 7j[ . 我们的工作表
明 , 菌株 D I2 02 抗热性极强 , 45 ℃培养能在
L M S Y 平皿上迅速生长 , 3 天形成直径 2 . 5一
4m m 的菌落 。 因此 , 进一步研究旋扭山绿豆快
生型根瘤菌的结瘤特性及其遗传学 , 对菌种的
改良及根瘤菌分类学 、 进化和遗传学等方面的
研究 , 都有理论价值和实际意义 。 —
, 专 文 嗽
一 H电朋址 A: J . G翻 . 沸户户 l . M 。` , ` 讨一 3 : 3 9 1一 4 0 3 , 19 6 7 .
2
.
Z ur k o” k i W r M心 . G如 . G翻以 . 1 . 1 : 5 2 2一 5 24 , 1 98 1 .
3
.
eB界。 。 n J L e t a l . : J . G洲 . 材比阳倪以 . 1 20 : 4 2 1一 4 2 9 . 19 8 0 ·
4
. 葛该 : 徽生物学通报 一4 ( 2 ) : 7 7一 8 0 , 1 9 8 7 。
5
. 伪 t e R A : E x p l o n n g th e eL ` u me R h面 b iu m S y . b iOS 认 in
T r o p ic a l A igr
e u lt u r e ( J M Vi 砚 e n t . A 5 W h i t此 y a nd J
BO . e ed
,
) 2 9 3一 3 1 1 , U in ve sr i t y of aH砒 il , aC l le砂勺 r e u l-
t u er M is e e l la n e o u s P u b li e a t io n 1 4 5
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` . 林德球等 : 华南师范大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 : 10 2一 10 6 .
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8
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G r a h a m P H
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. 李仲贤 : 徽生物学通报 , 一2 (心) : 1 5 1一 15 3 . 1 , 8 5 .
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1 1
.
R o l f B G e t a l
。 :
A “ 目 . J . B汉 . 5瓦 . 3 3 : 4 9 1一 5 0 4 , 1 9 8 0 .
( 19 9 2
一
1-0 2 6 收稿 )