全 文 ：华 南 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
1 9 9 4年第2期 J O U R N A L O F S OU T H C H水A
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,
1 9 9 4 (N A T U R A L 义: IE N C E
N O R M A L U N VI E R S r r Y
ED IT】O N )
旋扭山绿豆根瘤菌抗药菌株筛选及结瘤竞争
靖元孝 程惠青
(华南师范大学生物系
莫熙穆
5 1 0 6 3 1 广州 )
摘 要
本实验获得了抗链排素突变株 M X D 6I 斗 ,此菌株既有稳定的抗药性又保持 良好的固氮能力 . 菌
株间竞争结瘤表明 M X D I 6叉 竞争能力最强 ,并有双侵染出现 . M X D I 6叉 与土著根瘤苗竞争时 ,竞
占瘤率达 90 % . 生长在 T Y 培养墓上的 M X D 6I K : 与生长在 Y E M 培养羞上的 M X D I 6S二竞争时
M X D I 6K二占瘤率为零 .
关键词 :根瘤菌 ;竞争结瘤 ;抗菌家抗性 .双侵染
中图法分类号 : Q 94 5
旋扭 山绿豆 (块 s m od iu m int or ut m )是 1 9 8 0年从澳大利亚引进 , 现已在广东广泛种植 . 旋扭
山绿豆根瘤菌的应用已有 10 多年 ,现面临着接种的根瘤菌与土著根瘤菌结瘤竟争的问题 . 为了
提高根瘤菌接种效果 ,筛选固氮活性高 、 竞争能力强的菌株非常必要 . 本工作对根瘤菌进行抗
药标记 ,然后比较结瘤竞争能力 , 从而为旋扭 山绿豆推广应用提供优良菌种 .
1 材料与方法
L l 实验菌株
C B 62 7和 M X D 6I 均为旋扭 山绿豆根瘤菌 , 其中 C B 62 7来 自澳大利亚 , M X D 6I 为本室从华
南师大牧草山分离 . M X D G 为圆叶舞草住坛`瀚对 iu m g , .献 es )根瘤菌 , 能同旋扭山绿豆共生结
瘤 , 由本实验室提供 , 以上菌株均为慢生型根瘤菌 .
L Z 抗生素
链霉素硫酸盐 (简称凡 ) : 华北制药厂出品 , 卡那霉素硫酸盐 (简称 K砂 : 上海第四制药厂
出品 .
L 3 培养墓
收摘日期 : 19 9 3一 0 6 ·
Y E M 培养基 ( g / L ) 、 : K ZH p O ` o · 5 , M g SO ` o · 2 , N a C 10 · 2 ,户 C I: o · l ;甘露醇 1 0 . 0 ;酵母粉 o · 4 ;
徽盘元素母液 4毫升 (内含 H . B ( ) .和 N 。 : oM O .各。 . 5% ) . 固体培养荃加琼脂 18 . 。 , T Y 培养基
( g / L ) [
, ’ : 胰蛋白脉 5 . 0醉母粉 3 . 0 , C a C I: · ZH : 0 1 . 0 .固体培养基加琼脂 18 . 0 .
1
.
4 出发菌株耐药能力检测
将抗生素定量加入到灭菌后冷却至 50 ℃的 Y E M 培养基中 ,混匀后立即制作平板 ,抗生素
浓度如 T 伽 g / m l ) : 链霉素 5 , 1 0 , 5 0 , 1 0 0 ; 卡那霉素 5 , 1 0 , 2 0 , 5 0 . 将 .天试菌株接种到抗药平板
上 ,并设不加抗生素平板作对照 , 28 ℃培养 8夭 ,观察记录结果 .
1
.
5 抗药菌株的获得
挑取一大环斜面菌种 , 接到 50 m l 培养液中 ,摇床培养 ( l l o r/ m in) 对于数生长初期 ,加入链
霉素或卡那霉素到上述培养液中 , 抗生素浓度为 10 m g / m l. 继续摇床培养 4一 5夭 ,然后接种到
含 5 0 0 m g /m l 卡那霉素或链霉素的 Y EM 平板上 , 28 ℃培养 ,待长出丰满菌落后 , 挑取单个菌落
到无药斜面保存备用 .
1
.
6 抗药菌株固氮能力检交
回接试验 : 旋扭 山绿豆种子进行表面灭菌 , 催芽待根长至 cI m 时 ,分别用野生型菌株和抗
药菌株菌悬液浸泡萌芽种子半小时 ,然后种植到砂盒中 ,进行无氮培养 . 6 0天后收集植株根瘤 .
固氮能力鉴定 : 采样前植株光照 3一 4小时 , 剪下带瘤根系 , 放入 24 m l 血清瓶中 , 密封 , 30 ℃
反应 h2 ,抽取 1 0 0微升气样测氢 . 然后放气 , 重新封瓶抽气 , 随即注入 Zm l 乙炔 ,反应 h2 , 测乙炔
还原活力 . 再次放气 . 注入 l m lH : , 测吸氢酶活力 .
1
.
7 菌株间竞争结瘤比较
选择具有稳定抗性和正常固氮能力的菌株 ,将各菌株菌悬液光密度调至相同 , 然后按不同
组合等体积混合 ,按 1 . 6的方法进行回接实验 . 60 天后 , 收集植株根瘤 ,按如下方法 比较竞争结
瘤 :根瘤表面灭菌后 , 各自独立压碎 ,将汁液分别点种于背面附有小方格和编号的平板上 ,同一
根瘤汁液点种四种不同处理的平板① Y E M 平板 ;② Y EM + 氏 ( 50 。拼g /m l) 平板 ;③ Y EM + K .
( 5 0 0拌g /m l) 平板 ;④ Y EM 十 S。 + K 二 平板 . 28 ℃培养 8天 ,记录每个平板上菌落数 ,计算各菌株
的占瘤率 .
1
.
8 生长在 Y E M 培养墓上的菌株与生长在 T Y 培养基上菌株竞争结瘤实验
将同一菌株分别培养在 Y E M 和 T Y 培养基上 , 调菌悬液光密度相同 ,然后等体积混 含 ,
回接试验及竞争结瘤比较同 1 . 7的方法 .
1
.
9 接种菌株同土著根瘤菌竞争结瘤检测
取种过旋扭山绿豆的土壤作为回接试验的培养基质 . 将发芽的旋扭山绿豆种子伴接菌悬
液 ,并以不伴接菌悬液作为对照 ,进行 回接实验 ,然后检测竞争结瘤情况 .
2
. 实验结果
2
.
1 抗药菌株的获得
在筛选抗药菌株之前 ,首先检测供试菌株的自然耐药能力 ,结果见表 1 .
菌株的抗药性属于基因突变图 , 因此加药时间是获得突变体的关键 . 当细菌处在对数生长
4 7
期时 ,生理状态活跃 ,此时加入抗生素容易抑制或杀死野 生型菌体细胞 .而抗药突变体能够 生
长萦殖 . 本实验所用菌株为慢生型根瘤菌 ,培养至第 4天进入对数生长期 .加入抗生素从而筛选
到杭药菌株 : M X D I 6 S二, M X D I 6 K盔, C B 6 2 7溉 , C B 6 2 7K乏, M X以〕斗 , M X D G K : .
抗药菌株用于田间试验之前首先要同野生型菌株比较在基本培养荃上生长情况 ,避免使
用有代谢缺陷的标记菌株 , 然后同野生型菌株比较结瘤和固氮能力 ,结果如表 2 .
从表 2看出 ,抗药菌株 同亲不菌株相比 , 固氮活性和吸氢活性保持正常 .
2
.
2 菌株间竞争结瘤
将抗药菌株 M X D 6I 唬 与其它抗药菌株配对 , 各对组合取 10 个根瘤 , 检测结瘤情况 , 结果
见表 .3
从表 3可以看出各菌株竞争结瘤能力顺序如下 : M X D 6I 欧 > C B 62 7K : > M XDG K :
. 此外 ,
在两个组合里都出现了双侵染 . 分别为 17 %和 16 写 ,这与前人的报道相一致 〔 , · `〕 . 另外在 Y E M
+ S
。
+ K
, 平板上无菌落出现 , 说明双侵染根瘤中没有杂交后代产生 .
2
.
3 生长在 Y E M 培养墓上的根瘤菌与生长在 T Y 培养墓上的根右菌竞争结瘤比较
竹培养在 T Y 培养基上的 M X DI 6 K黑菌悬液接种旋扭山绿豆种子 ,发现结瘤时间延长 , 结
瘤能力比生长在 Y E M 培养基上菌株差 , 但仍具有一定的结瘤固氮能力 . 进而将 M X D 6I K泛
( T )Y 与生长在 Y EM 培养荃上的 M x DI 6溉 进行竟争结瘤实验 , 结果表明 : M x DI 6 K乏( T Y )与
M x DI 6S 二(Y E M )混合接种时 ,植修所形成根瘤全部由 M x D 6I 叱 所致 .
2
.
4 M XDI 6S 黑与土著根瘤茵竞争结瘤比较
结果见表 4 . 从表 4可以看 出 : M XDI 6 S黑与土著根瘤菌竞争结瘤时 ,占瘤率为 90 % , 竟争力
非常强 , 对照处理中 Y E M + mS 平板无菌落生长 ,说 明土壤中没有耐受 5 0 0拼g / mI 的土著根瘤
菌 .
3
. 讨 论
( ” 本文利用抗药标记 , 比较根瘤菌竞争结瘤能力 . 结果发现旋扭山绿豆根瘤菌 M X D 6I 叉
结瘤固氮能力强 , 占瘤率大于 M义DG K黑和 C B 6 27 K黑; 与土著根瘤菌竞争结瘤时 , 占瘤率达
90 %
. 因此在推广种植优良牧草旋扭 山绿豆时 、 可伴接根瘤菌 M X D珑 S黑.
( 2) 在比较菌株间竞争结瘤时 , 发现了双侵染 . T ir n ick [,] 等还发现由快生型和慢生型根瘤
菌共同侵染而形成一个根瘤的双侵染现象 . 由于双侵染经常出现 , 因此在分离快生型根瘤菌时
应特别小心 ,谨防混有慢生型根瘤菌 .
( 3) 根瘤菌胞外多糖在根瘤菌一豆科植物相互识别过程中有非常重要的作用 . hB a gw o t 和
K ie st er 团报道外加胞外多糖可恢复慢生型大豆根瘤菌突变株 (胞外多糖合成缺陷 )竞争结瘤能
力 . 本实验发现 : 生长在 T Y 上 的菌株 M X DI 6 K黑与生长 Y E M 上 的菌株 M X D 6I K二竞争时 ,
M X DI 6 K黑占瘤率为零 . 这可能是因为 M X DI 6 K乙在 T Y 上生长时 ,形成胞外多搪较少 ,影响了
根瘤菌与豆科植物的相互识别 . 从而影响竟争结瘤能力 .
农 1 出发菌株的附药能力
, 株 旅映挂祥众 (
料 a /m l )
1 0 5 0 1 0 0
彼映卡那 . 众《护 ./ m l)
5 10 2 0 ` 0
++十M XD I6
C B 6 2 7
M X D G + 十 + 一 + + +
农 2 根右菌固抓和吸扭活性
困派活性
, 株 放红活住 吸盆活性
(
n m o l
0OM X D I6
M X D I6缝
8
.
5
8
.
7
5
.
5
6
。
2
M X D】6 K盔 8 .
MX刀心 7 . 2 . 2
5
。
7
5
。
3
M X DG泌
M XD G K盔
7
.
3
7
.
6
2
。
O
2
.
4 4
。
g
C B 6 2 7 8
.
2 5
.
2
CB 6 2 7诺 8 . 5 5 . 7
C B 6 2 7 K孟 7 . 9 0 4 . 9
农 3 M X D I6又 与各菌株竞争结右比较
, 株组合 Y E M 平板蔺落粉
仅 在 ( Y EM +
S m )平板 上 生长 的 , 落数
仅 在 ( y E M +
K二 )平板上生长的 , 落
在 ( Y EM +
K m ) 和 ( Y E M
+ Sm )平板 都能 生长的菌落数
M X D I6骆 : C B6 2 7 K盔
M X D I6努 : MX D G K二
1 0 0 5 0 3 3 17
1 0 0 5 4 3 0 16
农 4 M x DI 6必 与土普根泊菌竞争结有比较
处理 , 数 /株 Y EM平板曲落效 ( Y E M+ S口 )平板 , 落
拌接 M X D 16酷
对照
1 9
.
5 1 0 0
4 g
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S E L E C T IO N A N D C O M P E T仃 IV E N O D U L A T I O N O F A N T BI I O T I C
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J in g Y u a n x i a o e h e n g H u iq i n g M o X im u
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A b s t r a C t
S t r a i n M X D I 6 S瓮a g a i n s t s t r e p t o m y e i n w a s o b t a i n e d i n t h e p r e se n t e x p e r im e n t . I t k e p t a n t ib i o t i e
r e s is t a n e e a n d N
:
f i x a t i o n a b i li t y f o r g e n e drt i
o n s
.
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e t it iv e n记 u la t i o n b e t w e n d i f fe r e n t s t r a i n s
s h o w ed t h a t s t r a i n M X D I 6叉 w a s a , u沐 r io : c o m p e t i t o r , 。 n d d o u b l e in fec t io n w a s d isc o v e r己 .
S t r a i n M X D I 6嗽 w a s p r es e n t i n 9 0% o f t h e n od u les i n e o m沐 t i t孙e n记 u la t i o n 悦 t w e n s t r a i n
M X D I6叉 ` n d n a t iv e s t r a i n s . S t r a i n M X D I 6K昙 w a s n o t p r es n t in n ed u le s i n e o m伴 t i t iv e
n ed u la t i o n b e t w e e n s t r a i n M X D I 6K三g r o w i n g i n T Y m e d i u m a n d s t r a i n M x D I 6溉 g r o w i n g i n
Y EM m
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K e y w o r d s
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R h ioz b i u m ; d o u b le i n f e e t io n ; e o m Pe t i t i v e n记 u la t i o n ; a n t ib i o t ie r e s i s t a n e e .
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