全 文 ：研究报告
2014年第 40卷第 8期(总第 320期) 29
鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶及 B16 黑色
素瘤细胞的作用!
陈龙，许光治，高前欣，周萌，王姝，倪勤学，张有做
(浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 临安，311300)
摘 要 研究分子质量低于 3 kDa鸡爪皮胶原多肽对蘑菇蘑菇酪氨酸酶的抑制及对小鼠 B16 黑色素瘤细胞黑
色素合成的影响。以 L-多巴为底物，研究胶原肽对蘑菇酪氨酸酶抑制作用及抑制动力学。然后采用 B16 黑色素
瘤细胞验证提取鸡爪皮胶原多肽的安全性及对黑色素合成影响的效果。结果表明，分子质量低于 3 kDa的鸡爪
皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的 IC50值为 0. 570 mg /mL，抑制属于非竞争性抑制，米氏常数 Km 和抑制常数 Ki
分别为 24. 68 μmol /mL和 10. 76 mg /mL。鸡爪皮胶原多肽在 0 ～ 200 μg /mL的质量浓度范围内对细胞的增殖活
性没有影响，而且能够有效地抑制细胞黑色素的生成。
关键词 鸡爪皮胶原多肽，蘑菇酪氨酸酶，小鼠 B16 黑色素瘤细胞
第一作者:硕士研究生(张有做为通讯作者)。
* 国家自然科学基金(31240040) ;浙江农林大学人才启动项目
(2010FＲ062);浙江省钱江人才计划资助 D类项目(QJD1102014)
收稿日期:2014 － 04 － 23，改回日期:2014 － 05 － 20
在动物和人体内，黑色素的产生是一种自我保护
机制，它是一种对紫外线吸收效果很好的吸收剂，能
够有效地保护皮肤免受阳光辐射的侵害。但是，黑色
素的合成属于人体黑色素细胞对外来侵害的一种应
激反应，这种反应受到遗传，内分泌，紫外线刺激，饮
食等因素的影响，如果反应过于强烈，则会导致人体
黑色素代谢失调，积累量大于排泄量，造成皮肤过黑，
甚至引起一系列皮肤病，严重者导致黑色素瘤的产
生。在植物体内，多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的
主要酶类［1 － 2］，目前市场上流行的黑色素合成抑制剂
多数是通过抑制蘑菇酪氨酸酶的活性来或则阻断酪
氨酸的氧化途径来实现美白的效果［3 － 4］，据其抑制黑
色素形成过中所起的作用不同，酪氨酸酶抑制剂可分
为含酚羟基的化合物、黄酮类化合物、醛类化合物、羧
基化合物和肽、氨基酸及其衍生物等［5］。已有研究
表明，在海洋生物体内获得的胶原多肽对蘑菇酪氨酸
酶活性具有一定的抑制作用［6］。关于陆生动物胶原
多肽抑制酪氨酸酶的报道尚属鲜见。
本文以从鸡爪皮中提取的分子量低于 3 kDa 的
胶原多肽为实验对象，探索其对蘑菇酪氨酸酶活性抑
制的机制，目的是希望获得酪氨酸酶抑制活性较高的
肽类物质，并采用 B16 黑色素瘤细胞对其安全性和
色素合成阻断功能进行研究，以期为大宗禽类副产品
的利用开辟新的途径。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
实验室制备的分子质量低于 3 kDa 的脱盐鸡爪
皮胶原多肽;小鼠 B16 黑色素瘤细胞，中科院上海细
胞保藏中心;L-多巴，阿拉丁试剂公司;蘑菇酪氨酸
酶，Sigma公司;ＲPMI-1640 培养基、小牛血清、胰蛋白
酶、MTT 购自 Gibco 公司;二甲基亚砜(DMSO)、
Triton-100 等均购自于上海生物工程有限公司;其他
试剂均为分析纯。
Tecan-M200 酶标仪，瑞士 Tecan;DK-80 多温控
精宏水浴锅，上海精宏;pHSJ-35 pH 计，上海雷磁仪
器厂;BPN-BOCH CO2培养箱，上海一恒科学仪器有
限公司;TS100 倒置相差显微镜，日本尼康公司;超净
工作台，苏净集团安泰公司。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 蘑菇酪氨酸酶抑制效果测定方法
蘑菇酪氨酸酶酶活性测定方法是根据 Hyung-
Kyoon Choi［7］的方法进行适当调整而来的，采用 200
μL的反应体系，按照表 1 加入药品进行反映，其中磷
酸盐缓冲液、样品及蘑菇酪氨酸酶加入后于 25 ℃水
浴锅中保温 10 min，再加入底物，于 25℃水浴锅中反
应 10 min，测定 475 nm波长的 OD值。
根据测得的 OD 值计算蘑菇酪氨酸酶相对活性
抑制率，蘑菇酪氨酸酶抑制率计算:
I /% = 1 －
B1 － B0
A1 － A
( )
0
× 100 (1)
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.08.018
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
30 2014 Vol. 40 No. 8 (Total 320)
式中，I:蘑菇酪氨酸酶抑制率;A0:对照组空白测得的
OD值;A1:对照组测得 OD 值;B0:样品组空白测得
OD值;B1:样品组测得 OD值。
表 1 反应液组成及体积
Table 1 Compositions and volume of reaction buffer
对照组空白 /
μL
对照组 /
μL
样品组
空白 /μL
样品组 /
μL
磷酸盐缓冲液
(0. 05 mol /L pH6. 8)
160 140 120 100
L-DOPA(1. 5 mg /mL) — 20 — 20
样品(1 mg /mL) — — 40 40
酶(250 U /mL) 40 40 40 40
1. 2. 2 蘑菇酪氨酸酶半抑制浓度(IC50)的测定
以磷酸盐缓冲液将样品配制成不同浓度的溶液，
使得在 200 μL的反应体系中获得不同的抑制量。根
据 1. 2. 1 的方法固定底物 L-DOPA 和酶的浓度，反应
后测定各个单位 OD值，带入公式(2)，计算蘑菇酪氨
酸酶活性率，绘制出剂量响应曲线。根据剂量响应曲
线得出样品的 IC50值，并进行验证实验。
I /% =
B1 － B0
A1 － A0
× 100 (2)
式中，I:蘑菇酪氨酸酶活性率;A0:对照组空白测得的
OD值;A1:对照组测得 OD 值;B0:样品组空白测得
OD值;B1:样品组测得 OD值。
1. 2. 3 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学
测试
研究鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力
学，可根据 Lineweaver-Burk 曲线来判定。固定反应
体系中酶的浓度(25 U /mL)，加入不同浓度的鸡爪皮
胶原多肽，改变反应体系中底物浓度，测出每一组的
反应初速度以 OD475nm /min表示。以反应初速度的倒
数和底物浓度的倒数分别为纵坐标和横坐标绘制
Lineweaver-Burk双倒数曲线，通过曲线交点所在象限
判断鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的竞争机制。
1. 2. 4 MTT法细胞增殖活性
取对数生长期的 B16 黑色素瘤细胞，胰蛋白酶
消化后，使用 ＲPMI － 1640 完全培养基配制成细胞密
度为 5 × 104的细胞悬浮液接种于 96 孔板，每孔 200
μL，置于 5%CO2、37℃培养箱中培养。贴壁 24 h 后，
弃去培养基。向 96孔板中加入 200 μL含鸡爪皮胶原
多肽(浓度为 0、6. 25、12. 5、25、50、100、200 μg /mL)完
全培养基;对照组加入等体积的完全培养基。每一个
样品浓度设置6个复孔，两个板分别培养24 h和48 h。
用酶标仪于 570 nm测定每孔细胞的 OD值 A。以 A表
示细胞增殖活性。
1. 2. 5 黑色素含量的测定
调整细胞浓度为 5 × 105个 /mL，接种于 6 孔板，
每孔接种 2 mL细胞悬浮液。贴壁后的细胞处理及培
养条件同 1. 2. 4，鸡爪皮胶原多肽浓度为 0、25、50、
100、200 μg /mL。每个浓度设置 6 个复孔，培养 48 h
后收获细胞，并计数细胞后定量。本研究参照 Hideya
Ando等［8］的方法稍作修改，加入 10%DMSO的1 mol /L
的NaOH溶液完全溶解裂解细胞，超声破碎处理30 min，
80 ℃水浴加热2 h，于470 nm处测定OD值A，黑色素相
对含量计算:
I /% =
A1
A0
× 100 (3)
式中，I:黑色素相对含量，%;A1:样品组的 OD 值;
A0:空白组的 OD值。
1. 2. 6 酪氨酸酶相对活性测定
细胞的接种密度、处理、培养条件及收获、计数方
法同 1. 2. 4。采用 Kim［9］的方法于 475 nm 处测定 0
min和 30 min的 OD值，计算蘑菇酪氨酸酶的相对活
性:
Ｒ /% =
A30 － A0
B30 － B0
× 100 (4)
式中，Ｒ:蘑菇酪氨酸酶相对活性，%;A30:样品组在
30 min时测得 OD值;A0:样品组在 0 min 时测得 OD
值;B30:空白组在 30 min时测得 OD值;B0:空白组在
0 min时测得 OD值。
1. 2. 7 数据处理方法
实验数据均是经过 3 次平行实验的得到的平均
值，并采用 SPSS19. 0 分析计算其标准偏差，Microsoft
Excel(office 2003)软件作图。
2 结果与讨论
2. 1 鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的 IC50测定
结果与分析
鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的剂量响应
曲线是随着胶原多肽的浓度增加，蘑菇酪氨酸酶活变
化的曲线。根据实验 1. 2. 2 的方法作图 1，随着胶原
多肽的浓度增加，蘑菇酪氨酸酶活性逐渐降低，说明
胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶是具有抑制效果的。根据曲
线拟合方程测得鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的
IC50值为 0. 426 mg /mL。与熊果苷
［1 0］对蘑菇酪氨酸酶
抑制的 IC50 = 1. 44 mg /mL相比，鸡爪皮胶原多肽的抑
研究报告
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制蘑菇酪氨酸酶效果更好。这是由于熊果苷主要作用
于酪氨酸→多巴这一反应过程，而对多巴→多巴醌这
一过程的抑制效果较差。而鸡爪皮胶原多肽对多巴→
多巴醌这一催化过程抑制效果较好。
图 1 鸡爪皮胶原多肽的剂量对蘑菇酪
氨酸酶活的影响(n = 3)
Fig. 1 Effects of concentration of chicken collagen
peptides on activity of tyrosinase(n = 3)
2. 2 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动力学测试
图 2 为鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制动
力学的双倒数作图，均得到一组横轴截距不变的直
线，5 条直线相较于 X负半轴，Km 值表现为交点的负
倒数，且保持不变，这说明鸡爪皮胶原多肽不影响米
氏常数(Km);最大反应速度表现为五条直线在 Y 轴
的截距的倒数，随着浓度的增加，Vmax逐渐降低，胶原
多肽与酶分子的结合与底物分子与酶的结合是独立
的，并不影响底物和酶的结合，抑制剂可以同时与游
离(E)和结合酶(ES)结合，且结合常数相同，增加底
物浓度并不能减少 I 对酶的抑制。以直线斜率(In-
tercept)和多肽浓度做图(内插图 a)，拟合直线，得到
直线斜率为胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶的抑制常数
(Ki)为 10. 76 mg /mL。
2. 3 鸡爪皮胶原多肽对 B16 黑色素瘤细胞增殖活
性的影响
鸡爪皮胶原多肽在不同浓度和不同时间对 B16
黑色素瘤细胞增殖活性影响曲线见图 3。分别于 24
和 48 h采用 MTT检测法测定细胞相对数量。由图 3
可知，24 和 48 h 时胶原多肽在 0 ～ 200 μL /mL 质量
浓度范围内对细胞增殖活性均无显著性影响(P ＜
0. 05)，而熊果苷在 48 h时对细胞增殖活性有一定的
抑制作用(P ＜ 0. 05)，从另一个角度来讲，熊果苷对
细胞有微弱的毒性作用。
图 2 鸡爪皮胶原多肽对蘑菇酪氨酸酶抑制类型及抑制常数的测定(n = 3)
Fig. 2 Chicken collagen peptides on the tyrosinase enzyme inhibition diol type and determination of inhibition constants(n = 3)
图 3 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷作用 24 h、48 h对黑色素瘤细胞增殖活性的影响(n = 6)
Fig. 3 Different concentrations of chicken collagen peptides and arbutin role 24 h，48 h on melanoma cell proliferation activity(n =6)
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2. 4 鸡爪皮胶原多肽对 B16 黑色素瘤细胞黑色素
含量的影响
不同浓度鸡爪皮胶原多肽对黑色素瘤细胞黑色
素含量的影响见图 4。通过测定细胞中黑色素吸光
值计算黑色素的相对含量。从图 4 看鸡爪皮胶原多
肽在 0 μg /mL和 25 μg /mL时差异性不显著，而浓度
升高至 50 μg /mL时差异性显著，熊果苷作为阳性对
照，对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响均显著。当浓
度为 200 μg /mL 时，胶原多肽和熊果苷作用的黑色
素瘤细胞黑色素相对含量分别为 57. 83% 和
31. 53%。
图 4 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷对
黑色素瘤细胞黑色素含量的影响(n = 6)
同一组分标记字母不同，表示差异显著(P ＜ 0. 05)
Fig. 4 Effect of different concentrations of chicken
collagen peptides and Arbutin melanin content of
melanoma tumor cells(n = 6)
2. 5 鸡爪皮胶原多肽对 B16 黑色素瘤细胞蘑菇酪
氨酸酶酶活的影响
图 5 不同浓度鸡爪皮胶原多肽和熊果苷对 B16
黑色素瘤细胞蘑菇酪氨酸酶酶活的影响(n = 6)
同一组分标记字母不同，表示差异显著(P ＜ 0. 05)
Fig. 5 palmatum influence of different concentrations of
collagen peptides and arbutin B16 melanoma cells
activity of tyrosinase(n = 6)
鸡爪皮胶原多肽作用黑色素瘤细胞对蘑菇酪氨
酸酶活性抑制曲线见图 5。胶原多肽在浓度范围为
0 ～ 200 μg /mL时对黑色素瘤细胞蘑菇酪氨酸酶活性
影响显著(P ＜ 0. 05) ，200 μg /mL 时活性降低到
70. 63%，熊果苷作为对照，对蘑菇酪氨酸酶抑制效果
显著(P ＜ 0. 05)，曲线在 50 μg /mL 之后下降速度加
快，到 200 μg /mL 时，蘑菇酪氨酸酶活性降低到
75. 17%。鸡爪皮胶原多肽能够被细胞吸收有效抑制
黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶活性。
3 结论
目前市场上流行很多黑色素合成抑制剂，如氢
醌、曲酸、熊果苷等，均是通过干扰黑色素的形成及转
移过程而达到降低黑色素含量的目的。熊果苷和曲
酸常用于市场上出现的各种美白产品中，研究表明，
熊果苷和氢醌使用过多会导致皮肤出现永久性不可
逆白斑［5］;而曲酸是有细胞毒性作用的，并会增加卵
巢细胞染色体变异的概率。因此需要寻找安全可靠
无毒副作用的酪氨酸酶抑制剂。关于海洋生物胶原
多肽抑制黑色素合成的研究已有报道［6］。
本研究中，鸡爪皮胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶活
性的 IC50 = 0. 570 mg /mL，与熊果苷对蘑菇酪氨酸酶
抑制的 IC50 = 1. 44 mg /mL 相比，抑制能力更显
著［11］，胶原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶属于非竞争性抑
制;以小鼠 B16黑色素瘤细胞为模型体外验证鸡爪胶
原多肽的安全性及对黑色素合成的阻断作用。实验结
果表明鸡爪皮胶原多肽对细胞增殖活性无明显影响，
200 μg /mL时黑色素相对合成水平降低了 42. 17%，蘑
菇酪氨酸酶相对活性下降了 29. 37%。其抑制黑色素
合成的能力是与多肽浓度成正相关的，这与王静凤［13］
等人的研究结果相似。关于鸡爪皮胶原多肽抑制黑色
素合成的具体机制有待进一步探索。
参 考 文 献
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Effect of chicken feet skin collagen peptide on mushroom
tyrosinase and B16 melanoma cell
CHEN Long，XU Guang-zhi，GAO qian-xin，ZHOU Meng，
WANG Shu，NI Qin-Xue，ZHANG You-zuo
(School of Agricultural and Food Science，The Key Laboratory for Quality Improvement of
Agricultural Products of Zhejiang Province Zhejiang A＆F University，Lin’an 311300，China)
ABSTＲACT The effects of chicken leg skin collagen peptide with molecular weight of less than 3 kDa on mushroom
tyrosinase and melanin biosynthesis in B16 melanoma cells were studied． The Collagen Peptide inhibitory activity on
mushroom tyrosinase and its tyrosinase inhibition kinetics were investigated using L-DOPA as the substrate． Then the
safety of chicken collagen peptide extract as well as its effect on the synthesis of melanin was verified using B16 mela-
noma cells． The results showed that the chicken collagen polypeptide whose molecular weight less than 3 kDa had ty-
rosinase inhibition activity with an IC50 value of 0． 570 mg /mL． In addition，the inhibition type belonged to noncom-
petitive inhibition，and the Michaelis constant Km and inhibition constant Ki were 24． 68 μmol /ml and 10． 76 mg /
mL，respectively． Chicken collagen polypeptide in the concentration range of 0 ～ 200 μg /mL had no effect on the pro-
liferation of melanoma cells． Moreover，it could effectively suppress the generation of melanin cells．
Key words chicken leg skin collagen peptide，mushroom tyrosinase，Mouse B16 melanoma cells