全 文 ： 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 January 2013, 32(1): 64-80
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基金项目：国家食用菌产业技术体系建设项目（No. CARS-24）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金：侧耳栽培种核心种质及其指纹图
谱库的构建研究；山东省农业良种工程项目（No. 2011LZ006-04）；山东省科技发展计划项目：基于宏基因组高通量测序的食用菌病害检测
与监测技术及相关基因的研究；农业科技成果转化资金项目：城郊食用菌产业化开发
Δ并列第一作者.
*Corresponding author. E-mail: qyaomail@163.com
收稿日期: 2011-11-22, 接受日期: 2012-03-23

粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核
心种质库的构建
张雪梅 1Δ 姚强 2Δ* 宫志远 2* 高兴喜 3 李瑾 2 刘晓 2 韩建东 2
任鹏飞 2 万鲁长 2 任海霞 2
1青岛农业大学生命科学学院 山东 青岛 266109
2山东省农业科学院农业资源与环境研究所 山东 济南 250100
3鲁东大学菌物科学与技术研究院 山东 烟台 264025


摘 要：根据已知的粗皮侧耳、灵芝、香菇 EST 序列开发出 9 条粗皮侧耳 EST-SSR 引物、58 条灵芝 EST-SSR 引物
和 35 条香菇 EST-SSR 引物，从中筛选出 4 条多态性好、条带清晰的引物，对选取的 185 株粗皮侧耳栽培种进行扩增
分析。共扩增得到 59 条带，每个引物扩增条带数为 12–19 条，扩增片段在 100–1,100bp 之间。根据扩增结果构建了
一个含 47 株粗皮侧耳栽培种的初级核心种质库 P-core 47。分析得出 P-core 47 占原群体样品数 25%，占资源库的 13%，
有效等位基因数和多态性位点占有率与原群体一致，多样性指数均值比原群体高 0.12747，在原群体的低频率等位基
因有所增强。P-core 47 内菌株来源广泛，基本已覆盖各个栽培地区，统计的质量性状和数量性状均可在其中找到代
表性菌株。表明了用 EST-SSR 分子标记构建粗皮侧耳栽培种初级核心种质库的可行性。
关键词：粗皮侧耳，EST-SSR 分子标记，初级核心种质库，有效等位基因，多态性位点

Development of EST-SSR markers in Pleurotus ostreatus and
construction of primary core collection
ZHANG Xue-Mei1Δ YAO Qiang2Δ* GONG Zhi-Yuan2* GAO Xing-Xi3 LI Jin2 LIU Xiao2
HAN Jian-Dong2 REN Peng-Fei2 WAN Lu-Zhang2 REN Hai-Xia2
1College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
2Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong 250100, China
3Institute of Mycological Science and Techonolgy, Ludong University, Yantai, Shandong 264025, China
DOI:10.13346/j.mycosystema.2013.01.003
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
65
Abstract: Based on the EST sequences published on NCBI, 9 Pleurotus ostreatus EST-SSR primer pairs, 58 Ganoderma
lucidum EST-SSR primer pairs and 35 Lentinula edodes EST-SSR primer pairs were designed. Among these, 4 of good
polymorphisms and clear strips were selected to perform the amplification analysis for the cultivation of the chosen 185
strains of Pleurotus ostreatus. After amplification, 59 alleles were generated, and there were 12–19 alleles for each primer,
with the fragment sizes between 100bp and 1,100bp. A primary core collection, P-core 47, composed of 47 accessions was
constructed based on the amplification results. After analysis, P-core 47 accounts for 25% in the original sample pool, 13% in
the oringinal resource pool; as for the number of effective alleles and occupation ratio of polymorphism sites, consistency
was preserved between P-core 47 and the original pool; in addition, compared to the original pool, diversity index of P-core
outperformed by 0.12747, and alleles used to be of low frequency in the original pool were strengthened as well. The strains
in P-core 47 are widely-ranged, basically available in most of the cultivation regions; you can find representative alleles of
both qualitative and quantitative characters in this collection. This showed the feasibility of the adoption of EST-SSR
markers to construct a primary core collection of the Pleurotus ostreatus.
Key words: Pleurotus ostreatus, EST-SSR marker, primary core collection, effective alleles, polymorphism sites


粗 皮 侧 耳 Pleurotus ostreatus (Jacq.)
P. Kumm.是我国平菇的主要栽培种，不仅味道
鲜美还具有丰富的营养价值，是我国主要的食
药用真菌之一（戴玉成和杨祝良 2008；戴玉成
等 2010），年消费量达到 300 万吨以上。但目
前粗皮侧耳的种质资源混乱，以及同种异名现
象严重等问题，给选育高产、抗病、优质的新
品种带来极大困难。目前常用于粗皮侧耳遗传
分类的分子标记方法主要有：ITS、IGS、RFLP、
RAPD、AFLP、ISSR、SCAR 等，如 Sagawa et
al.（1998）对金顶侧耳、黄白侧耳、肺形侧耳、
桃红侧耳、凤尾菇进行 RFLP 分析，表明 RFLP
可应用于粗皮侧耳的亲缘关系分类。但 RFLP
分析探针的制备需要花费大量的经费和时间，
不同物种需要制备不同探针，进行分析的步骤
繁琐耗时长；马富英和罗信昌（2002）对粗皮
侧耳属 18 个种 52 个菌株及 3 个其他属的菌株
的 28S rDNA 进行 PCR-RFLP 分析，表明 28S
rDNA PCR-RFLP 可用于亲缘关系较远的粗皮
侧耳种间或属间的系统发育和分类鉴定，但不
适合种内研究；熊芳等（2010）利用 9 个常用
凤尾菇菌株的 RAPD 和 SRAP 建立了快速鉴定
凤尾菇菌株的 SCAR 标记，但是并非所有的标
记都可以成功地转化为 SCAR 标记，有时会因
为克隆不到扩增产物，转化后 PCR 扩增失败或
转化后 PCR 产物多态性消失等问题；郑素月等
（2005）采用 RAPD 技术对我国大规模栽培 54
个粗皮侧耳商业菌株进行RAPD分析，但RAPD
可靠性较差，难以在品种鉴定中广泛应用。因
此，现有的分子标记技术已不能满足粗皮侧耳
的研究，急需开发一种新型、高效的分子标记。
EST-SSR 又称表达序列标签微卫星，是一种基
于 EST 序列开发的简单重复序列设计的一种新
型分子标记，能较好地表现出物种之间的可转
移性，并充分反映出基因组功能区域的相似程
度，所以被广泛应用于植物的品种鉴别、亲缘
关系鉴定、遗传多样性研究等（Litt & Luty
1989；Fan 2000；陈军方等 2005），但是在粗
皮侧耳等食用菌上仍未有应用。
种质资源是控制物种性状的基因载体，是品
ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Mycosystema January 15, 2013 Vol.32 No.1
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66
种选育的物质基础。Frankel et al.（1984）在种
质资源库的基础上提出了核心种质的概念，其目
的是以最少数量的种质资源最大限度的保存整
个群体的遗传多样性，从而解决种质资源规模过
大导致的难以管理和利用。核心种质概念一经提
出就受到了国际的广泛关注，近年来已成为资源
研究的热点。至 20 世纪末，己有 51 个物种构建
了 63 个核心种质库（李自超等 2003）。目前核
心种质多构建在作物上，如大豆、花生、栽培稻、
芝麻等，在食用菌上的研究还未见报道。
本文旨在根据筛选出的粗皮侧耳、灵芝、
香菇 EST 序列开发 SSR 分子标记，构建适用于
粗皮侧耳的 EST-SSR 分子标记体系，形成一套
新的完整的分子标记数据，以完善粗皮侧耳的
分子标记研究。同时进一步将栽培学性状与分
子标记相结合构建粗皮侧耳的初级核心种质
库，以期为粗皮侧耳的种质保藏、育种栽培研
究提供新的方法和依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌株：供试的 185 株粗皮侧耳栽培种均由
山东省农业科学院农业资源与环境研究所提
供，各菌株保藏地及编号名称见表 1。
表 1 供试菌株
Table 1 Exhibition of strains used in the study
编号
No.
菌株
Strain
来源
Origin
编号
No.
菌株
Strain
来源
Origin
1 002
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
94
双耐
Shuangnai
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
2 004
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
95
何氏 200
Heshi200
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
3 091
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
96
农平 10
Nongping10
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
4 095
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
97
糙皮侧耳 2
Pleurotus
ostreatus 2
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
5 149
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
98
黑霸王
Heibawang
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
6 208
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
99
新白平
Xinbaiping
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
7 230
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
100
农丰 5
Nongfeng5
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
8 265
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
101
高抗 48
Gaokang48
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
9 278
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
102
凤尾 831
Fengwei831
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
67
续表 1
10 279
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
103
优选-2
Youxuan-2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
11 A184
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
104
黑平 815
Heiping815
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
12 A228
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
105
江都 109
Jiangdu109
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
13 A240
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
106
短平
Duanping
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
14 A242
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
107
黑平 119
Heiping119
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
15 A247
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
108
灰平 260
Huiping260
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
16 A289
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
109
夏王 40
Xiawang40
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
17 2002-2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
110
烟平 19
Yanping19
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
18 1290
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
111
农平 20
Nongping20
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
19 2018
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
112
江都 302
Jiangdu302
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
20 1029
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
113
特抗 650
Tekang650
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
21
槐 2
Huai2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
114
高平 2 号
Gaoping2
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
22 2002-4
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
115
珞珈 1 号
Luojia1
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
23
平 1518
Ping1518
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
116
庆丰 518
Qingfeng518
四川省农科院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
24
平 5506
Ping5506
山东省农科院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
117
黑牡丹
Heimudan
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
25
春山
Chunshan
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
118
平 50596
Ping50596
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
26
平 88
Ping88
山东省农科院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
119
风云 888
Fengyun888
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
27
特大
Teda
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
120
平 SN1
PingSN1
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Mycosystema January 15, 2013 Vol.32 No.1
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
68
续表 1
28 2026
山东省农科院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
121
糙皮侧耳 4
Pleurotus
ostreatus 4
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
29
江 8
Jiang8
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
122
农平 5 号
Nongping5
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
30 8801
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
123
牌州湾 1 号
Paizhouwan1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
31
抗 3
Kang3
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
124
新农 1 号
Xinnong1
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
32 P42
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
125
基因 2005
Jiyin2005
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
33 TD-3
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
126
牌州湾 2 号
Paizhouwan2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
34
超级 99
Chaoji99
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
127
雪美 F2
XuemeiF2
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
35
豫平 5 号
Yuping5
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
128
超强 581
Chaoqiang581
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
36
豫平 2 号
Yuping2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
129
双抗黑平
Shuangkang
heiping
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
37
豫平 3 号
Yuping3
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
130
曲师 9111
Qushi9111
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
38 XY-10
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
131
高产 8129
Gaochan8129
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
39
杂 3
Za3
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
132
法引黑平
Fayinheiping
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
40 H600
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
133
平 50796
Ping50796
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
41
庆丰 1 号
Qingfeng1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
134
神州 5 号
Shenzhou5
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
42
平 9745
Ping9745
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
135
优平 680
Youping680
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
43
高抗 1 号
Gaokang1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
136
特白 1 号
Tebai1
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
44
鲁植 2 号
Luzhi2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
137
平菇 3 号
Pleurotus
ostreatus 3
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
69
续表 1
45 R378
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
138
抗病 265
Kangbing265
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
46
科大杂优
Kedazayou
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
139
山大 1 号
Shanda1
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
47
夏优 1 号
Xiayou1
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
140
复壮 802
Fuzhuang802
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
48
太白 1 号
Taibai1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
141
富达白平
Fudabaiping
华中农业大学
Huazhong Agricultural University
49
豫平 1 号
Yuping1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
142
黑平 8 号
Heiping8
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
50
青平 1 号
Qingping1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
143
农平 21
Nongping21
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
51 SL
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
144
糙皮侧耳 3
Pleurotus
ostreatus 3
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
52
晋平
Jinping
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
145
江都 1500
Jiangdu1500
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
53
德福 2 号
Defu2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
146
江都 5178
Jiangdu5178
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
54 5526
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
147
永发黑平
Yongfaheiping
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
55
早秋 615
Zaoqiu615
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
148
白平 1 号
Baiping1
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
56
平 2093
Ping2093
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
149
姬菇 8603
Pleurotus
cornucopiae
8603
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
57
平 8633
Ping8633
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
150
永发高平
Yongfagaoping
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
58
武汉 1 号
Wuhan1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
151
抗病 1 号
Kangbing1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
59
平 645
Ping645
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
152
天达 300
Tianda300
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
60
易平 89
Yiping89
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
153
强抗 600
Qiangkang600
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
61
优平 88
Youping88
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
154
白平 2 号
Baiping2
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Mycosystema January 15, 2013 Vol.32 No.1
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
70
续表 1
62
低黑 H-1
DiheiH-1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
155
特平 8 号
Teping8
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
63
农平 4
Nongping4
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
156 P17
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
64
黑平 04
Heiping04
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
157
低温平 50576
Diwenping50576
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
65
黑丰 90
Heifeng90
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
158
平菇 9 号
Pleurotus
ostreatus 9
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
66 2019
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
159 P-01
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
67 99
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
160
黑平 602
Heiping602
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
68 1500
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
161
科大黑
Kedahei
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
69
超 100
Chao100
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
162
新冬黑平
Xindongheiping
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
70
农平 8 号
Nongping8
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
163
野平
Yeping
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
71
春栽 1
Chunzai1
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
164
超低温平菇
Chaodiwen
Pleurotus
ostreatus
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
72
高平 1
Gaoping1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
165
高产 8105
Gaochan8105
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
73
抗 2
Kang2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
166
平优 1 号
Pingyou1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
74
新 99
Xin99
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
167
锡平 1 号
Xiping1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
75
平 8801
Ping8801
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
168
黑丰 204
Heifeng204
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
76 601
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
169
华中 PU1
HuazhongPU1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
77
选 140
Xuan140
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
170
早丰 162
Zaofeng162
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
78
平 2106
Ping2106
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
171
太空 2 号
Taikong2
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
71
续表 1
79 3014
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
172
豫平 7 号
Yuping7
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
80
天达 85
Tianda85
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
173
黑平王
Heipingwang
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
81
易丰 18
Yifeng18
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
174
平菇四季大白
Sijidabai
Pleurotus
ostreatus
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
82
平 963
Ping963
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
175
高丰 246
Gaofeng246
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
83
鲁植 1 号
Luzhi1
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
176
平菇 50712
Pleurotus
ostreatus 50712
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
84
江都 71
Jiangdu71
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
177
平 50601
Pleurotus
ostreatus 50601
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
85
科大
Keda
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
178
平 50603
Pleurotus
ostreatus 50603
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
86 620
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
179
野丰 118
Yefeng118
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
87 29
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
180
佛州粗皮侧耳
Pleurotus florida
Eger
福建农林大学
Fujian Agriculture and Forestry University
88 645
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
181
金凤 2-1
Jinfeng2-1
四川省农业科学院
Sichuan Academy of Agricultural Sciences
89
冀农 11
Jinong11
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
182
永发菇王
Yongfaguwang
中国农业科学院
Chinese Academy of Agricultural Sciences
90
少孢 99
Shaobao99
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
183
科创广平
Kechuangguang
ping
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
91 2019
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
184
黑丰 268
Heifeng268
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
92 3912
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
185
纯白 201
Chunbai201
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences
93
汉 3
Han3
山东省农业科学院
Shandong Academy of Agricultural Sciences


ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Mycosystema January 15, 2013 Vol.32 No.1
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1.1.2 试剂和仪器：PCR 所用 Buffer、dNTPs、
Taq 酶、Loading Buffer 等均购自天根生化科技
有限公司。UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化试剂盒
购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化：将供试菌株分别接种于 PDA
培养基平板上，25℃恒温培养箱中培养 8d
备用。
1.2.2 基因组 DNA 的制备：采用改良的 CTAB
结合UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒的方法
提取粗皮侧耳基因组 DNA（杨同文和马利华
2009）。将刮取的约 0.2g 菌丝倒入液氮迅速研
磨成粉末，加入 600μL 65℃预热的 CTAB 提取
缓冲液，于 65℃水浴 1h，每 10min 颠倒混合一
次；12,000r/min 离心 10min，取上清转移到
UNIQ-10 柱中，室温放置 2min；12,000r/min 离
心 1min，去收集液，500μL wash solution 洗 2
次；12,000r/min 离心 1min，去收集液；将柱子
自然晾干 10min，在膜中央加入适量 elution
buffer 放置 5min，12,000r/min 离心 1min，离心
管中的液体即为粗皮侧耳基因组 DNA。采用
UNIQ-10柱式 PCR产物纯化试剂盒纯化基因组
DNA。
1.2.3 引物设计及筛选：在 NCBI 数据库中搜索
粗皮侧耳、香菇、灵芝 EST 序列，采用刘春滟
等（2010）的方法得到高质量的 Unigenes，利
用 SSR Finder 软件在其中搜索 SSR，搜索标准
为：单、二、三、四、五、六核苷酸的最少重
复次数分别为 12、6、5、5、5、5。利用引物
设计软件 Primer3.0 在含有 SSR 的序列中设计
引物，主要设定参数为：GC 含量为 45%–60%，
退火温度为 55–65℃，引物长度在 18–27bp 之
间，并由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。从设计的引物中筛选出扩增产物条带清
晰、多态性好的用于粗皮侧耳栽培种的分析。
1.2.4 PCR 扩增：PCR 扩增反应在 Eppendorf
Mastercycler pro 梯度 PCR 仪上进行，经过优化
确定最佳的 EST-SSR 反应体系为 25μL（含 10×
缓冲液 2.5μL，2.5mmol的 dNTPs 2.0μL，2.5U/μL
Taq酶0.25μL，10μmol/L的正反向引物各1.0μL，
模板 50–100ng）。
EST-SSR 扩增程序：94℃预变性 5min；94℃
变性 30s；50–65℃复性 45s；72℃延伸 1min，
35 个循环；72℃延伸 10min；4℃保温。PCR 扩
增产物用 2%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭
0.5μg/mL）电泳检测，将电泳后的凝胶置于凝
胶成像系统下观察记录结果。用 100bp DNA
Ladder 作为分子量的标准。
1.2.5 数据处理：统计在同一电泳迁移位置扩增
条带的有无，有扩增条带的记为 1，没有扩增
条带的记为 0，生成分子数据矩阵。利用
NTSYS-pc 软件的不加权平均数法（UPMGA）
进行了聚类分析，构建系统树。采用优先选取
稀有等位基因，剩余的材料多次聚类随机取样
方法抽取初级核心种质。
2 结果与分析
2.1 EST-SSR 引物
在含 SSR 位点的序列中，挑选那些重复序
列长（＞20bp）、远离序列两末端（＞40bp）且
两侧保守性好的序列来设计引物。共设计出 9
条粗皮侧耳 EST-SSR 引物，58 条灵芝 EST-SSR
引物，35 条香菇 EST-SSR 引物（表 2 为部分引
物序列）。由表 2 可知引物的退火温度一般为
60℃左右，以利于筛选时在同一 PCR 仪中完成
反应。
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
73
表 2 部分 EST-SSR 引物
Table 2 Several primers designed in this study
编号
Primers
引物序列
Sequences (5′-3′)
退火温度 Tm
Annealing temperature (℃)
GC 含量
GC content (%)
P1
F-GCTGTGAAGTGAGCTTGGAA
R-CATGTCAGCATTCTCTCTTTCAG
57.80/58.21 50.00/45.45
P2
F-GAGCATGCACACAGCGTAAT
R-GCATAAAGCCGGAACAAACT
57.80/55.75 50.00/45.00
P8
F-TTTTGGCGAGGAAACGTAGT
R-CGCCAATCCCAAAATCTAAG
55.75/55.75 45.00/45.00
P9
F-AGTGGGTGGAATCAATCTCG
R-GCCAAAGCTGCTGTCTCAG
57.80/59.72 50.00/57.89
GL1
F-CTGCTCGTTGTACACGCTTC
R- GAAAGACAGACGCGGGATTA
59.66/60.21 55.00/50.00
GL2
F- GGTAATCTCGGCTTCACGAT
R- TTGAGAATCTTCGGCACCTC
59.10/60.34 50.00/50.00
GL3
F- CTGTCCCCTTCCCCTTAGAC
R- CTCATGCGGTCGTGAGAGT
59.93/60.00 60.00/57.89
GL4
F-GAGCAGGCGATCTCTTTCAA
R-GCGAAGGGAGTGGTACACAT
60.6/60.00 50.00/55.00
GL55
F-CTTCAGCAGCCAATCTGACA
R- CGGGGGTAGGATTAAGTGGT
60.14/60.07 50.00/55.00
GL56
F- CGCATTCACCTCTCTCCAG
R- GGGACAAAGGGGAGACTTGT
59.51/60.35 57.89/55.00
GL57
F- CGGTTATGTGCTTTCGGTCT
R- GGAAGGTTGGCAAAACAAAA
60.13/59.95 50.00/40.00
GL58
F-TCGTCTGTTGTGGACGTGAT
R-ACAGACAAAGCACCGAGAGC
60.16/60.60 50.00/55.00
L1
F-GCTCTGCTTTCCCTTCGTT
R-GTCCCAGTGACTGCTGTTGG
57.56/61.90 52.63/60.00
L2
F-CTCCACTAAAGCCCTCAAAATC
R-CGAAAAGCCGTGTAGCATG
58.21/57.56 45.45/52.63
L34
F-CCTCAGCGGGTTGTAGGTT
R-TCCACGGTGGTAGCTTCTTC
59.72/59.85 57.89/55.00
L35
F-CAGAGGGCCGTAGTCTCAAG
R-ATATATCGCAGCGGGAACAG
61.90/57.80 60.00/50.00
注：P：粗皮侧耳引物；GL：灵芝引物；L：香菇引物.
Note: P: Pleurotus ostreatus EST-SSR primer; GL: Ganoderma lucidum EST-SSR primer; L: Lentinula edodes EST-SSR primer.
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2.2 EST-SSR 扩增多态性
从 102 对 EST-SSR 引物中筛选出 22 对具
多态性的引物。其中灵芝 16 对，香菇 6 对，粗
皮侧耳引物没有表现出较好的多态性，可能是
由于粗皮侧耳研究起步较晚公布的 EST 序列有
限。进一步筛选出 4 对多态性好，条带清晰的
引物作为试验用引物（表 3）。对我院收集保藏
的 349 株粗皮侧耳品种先进行初步的同种异名
排除，后根据栽培学性状随机选取的 185 株进
行扩增（表 1），取样率超过 50%，远超于正常
取样率可弥补粗皮侧耳种质资源混乱，能代表
粗皮侧耳种质资源。在 EST-SSR 分析中，每个
引物扩增出 12–19 条 DNA 条带，平均 15.5 条。
4 条引物共扩增出 59 条条带，其中 42 条条带
具有多态性，多态性比率为 67.7%，扩增片段
大约集中在 100–1,100bp 之间（图 1、图 2）。
2.3 初级核心种质库的构建及分析
根据 PCR 扩增统计有差异、易于识别的多
态性条带，有带记为 1，无带记为 0。运用
NTSYS-pc 软件，用不加权类平均法（UPGMA）
进行系统聚类分析。计算各位点等位基因的频
率，确定最低和最高频率的等位基因，优先选
表 3 4 条供试 EST-SSR 引物序列、退火温度及扩增结果
Table 3 Sequences, annealing temperature and amplification outcomes of four EST-SSR primers
引物
Primers
序列
Sequences (5′-3′)
退火温度
Annealing
temperature (℃)
扩增位点数
Amplified loci
多态位点数
Polymorphic loci
多态位点比
Percentage of polymorphic loci (%)
GL1
F-CTGCTCGTTGTACACGCTTC
R-GAAAGACAGACGCGGGATTA
55 19 13 68.4
GL2
F-GGTAATCTCGGCTTCACGAT
R-TTGAGAATCTTCGGCACCTC
54 13 10 76.9
GL19
F-AGTACGTAGCTGCCGTCCAG
R-CCTGATACGTCCCGTAACCA
55 12 9 75.0
L11
F-CGGTCCACGTTATGGTAGG
R-GTAACCCAAATCACGAGCAG
53 15 8 53.3

图 1 灵芝引物 1在 16 粗皮侧耳菌株中的 EST-SSR 图谱
Fig. 1 Electrophoresis diagrams of 16 Pleurotus ostreatus with the EST-SSR primer GL1.
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菌物学报
75

图 2 香菇引物 11 在 16 粗皮侧耳菌株中的 EST-SSR 图谱
Fig. 2 Electrophoresis diagrams of 16 Pleurotus ostreatus with the EST-SSR primer L11.

取具有稀有等位基因的个体作为核心种质材
料。对于剩余的材料采用多次聚类随机取样法
抽取初级核心种质，本试验连续进行 4 次聚类
分析随机抽样，构建了一个含 47 株粗皮侧耳栽
培种的初级核心种质库 P-core 47（图 3）。P-core
47 占原群体样品数 25%，占资源库的 13%。有
效等位基因数和多态性位点占有率与原群体一
致，多样性指数均值比原群体高 0.12747，原群
体的低频率等位基因有所增强。
P-core 47 粗皮侧耳初级核心种质包含了来
自中国农业科学院、山东省农业科学院、四川
省农业科学院及福建农林大学的各类典型代
表，基本已覆盖各个栽培地区。对 185 份样品
的 10 个质量性状、10 个数量性状，核心种质
样品达到了 100%的代表率，例如：菌盖灰黑色
的有新冬黑平、99、超强 581 等；菌盖灰白色
的有灰平 260、平 963、庆丰 1 号等；菌盖白色
的有武汉 1 号、科大、高丰 246 等；肉质硬的
有江都 8 号、早丰 162、豫平 2 号等；肉质软
的牌州湾 2 号、珞珈 1 号、风云 888 等；菌柄
粗长的有农平 20、曲师 9111、1500 等；菌柄细
长的有黑平 815、双抗黑平、豫平 2 号等；菌
柄粗短的有 1029、雪美 F2、双耐等；菌柄细短
的有特大、科创广平、烟平 19 等；菌柄有着生
毛的有黑平 815、双抗黑平、农平 8 等。因此，
在构建的初级核心种质库中均可找到相关的质
量性状和数量性状。
从聚类分析可以看出灰平 260 自成一类，
与其是唯一的高温品种相吻合。来自四川省农
业科学院的江 8 与福建农林大学的新冬黑平聚
成一类，与其他菌种距离较远，可能由于江 8
和新冬黑平为当地种，而四川、福建相对地理
位置较近，亲缘关系也相对较近，表现出一定
的地域性。当相似性系数为 0.75 时，余下的菌
株聚为两大类：第一类的 149、风云 888、高丰
246、1029、平 963 等子实体颜色均为灰白或浅
白色，肉质整体较软，菌柄多细。第二类又可
分为两类，前一类通过栽培试验可发现子实体
颜色基本为逐渐加深，如：早丰 162、曲师 9111、
双耐等子实体为淡黄褐色；黑平 815、双抗黑
平、烟平 19 等子实体颜色为灰黑色。后一类可
发现子实体颜色有逐渐变浅的趋势，如：
2002-4、抗 3 等为灰黑色；永发高平、低温粗
皮侧耳 50576 等又为灰褐色；纯白 201、白平 2
号为淡黄褐色。由于粗皮侧耳的栽培品种没有
明显的地域差异，南北栽种品种基本相似，相
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图 3 47 株初级核心种质基于 EST-SSR 遗传相似系数的
聚类图 图中编号对应具体菌株名见表 1
Fig. 3 Dendrogram of genetic relationship among 47 primary
cores detected by EST-SSR. The number corresponds to the
specific strains shown in Table 1.

互引种普遍。栽培品种的温型也没有较明确划
分，大多为广温型。栽培过程中发现子实体颜
色受栽培温度影响严重，子实体色浅的多为高
温型种，但在低温时栽培子实体颜色会变深，
所以只从农艺性状划分粗皮侧耳栽培种，有很
大的困难，也有一定的片面性。在这种情况下，
EST-SSR 标记技术可作为粗皮侧耳品种鉴定分
类及其核心种质库构建的方便、有效、经济的
方法。
3 讨论
我国食用菌产业起步较晚，但在短短的几
十年内已有了长足的发展，可以说食用菌行业
是一个具有发展前景的产业。在行业发展的前
期由于得不到重视、疏于管理等原因，各地引
种频繁，同一材料被各地育种工作者普遍采用，
没有一个系统的种质资源登记保藏制度，造成
了种质资源的混乱、亲缘关系表现相对复杂、
同种异名现象的严重，给育种和保藏工作带来
极大困难。在本试验搜集种质资源过程中问题
愈发凸显出来：没有像大宗作物那样有一个系
统全面的种质资源库，种质资源的来源地已追
寻不到，仅限于各菌种的保藏地；粗皮侧耳的
栽培不同于作物那样有明显的品种地域性，给
菌株前期筛选增加了难度；菌种活化过程中，
发现一些菌种退化严重。因此，本试验加大了
取样范围，取样率为 50%，超过取样率 5%–30%
的范围（Brown & Spillane 1999），并从我国粗
皮侧耳的几大主产区的总种质资源中选取，以
确保核心种质的全面。
构建核心种质库的方法有许多种，如用分
子标记构建水稻（Zhang et al. 2007）、小麦（Hao
et al. 2006）、马铃薯（Ghislain et al. 2006）的核
心种质库，而山药（Lebot et al. 2005）的核心种
质库是利用品种的起源、食味品质、块茎形状、
块茎肉色和形态型等性状。Ellwood et al.（2006）
提出单一的物理特性并不能反映一个物种的真
实多样性，且对于给定特征的等位基因多样性
和频率，也不一定是基因组多样性的代表，搜
集样品的不同地域可能造成简单的等位基因差
异。因此，本文采用了栽培学性状与分子技术
相结合的方法，避免了单一方法过于片面的问
题，增强了初级核心种质库的可信性。目前，
构建核心种质库常用的分子分类方法是聚类分
析，不同的聚类方法对构建的结果有较大影响。
Hu et al.（2000）在结合马氏距离比较了 3 种聚
类方法构建棉花核心种质，以及 Li et al.（2004）
张雪梅 等 /粗皮侧耳栽培种 EST-SSR 分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建
菌物学报
77
采用 6 种常用聚类方法构建水稻核心种质，发
现不加权类平均法构建效果最好，本研究也采
用了不加权类平均法对核心种质进行构建。
可用于构建核心种质库的分子标记有多
种，如：Treuren et al.（2006）用 AFLP 标记构
建了大麦的核心种质库，Che et al.（2003）用
SCAR 标记构建了西瓜的核心种质库。SSR 分
子标记技术被公认为是一种比较理想的用于构
建核心种质库的分子标记技术，并在作物中得
到了广泛的应用，如 Ghislain et al.（2006）用
SSR 标记对构建了马铃薯核心种质库；Ellwood
et al.（2006）用 6 对 SSR 引物构建了苜蓿的核
心种质库等。SSR 标记在食用菌中的应用还鲜
有报道，在香菇（刘春滟等 2010）和真姬菇（董
岩等 2009）中有初步研究报道，但以往创建的
SSR 标记为了得到重复序列两端的序列信息，
需要花费极高的测序费用，且操作麻烦，如韩
国国家农业科学院的 Ho et al.（2009）首先试验
测得重复序列两端的序列信息后设计了 36 对
引物用于试验，整个操作繁琐，增加了工作量。
最近发现根据公布的 EST 序列开发的 EST-SSR
标记相对简单方便，通过大量的试验证明了其
可行性，白菜、小麦、花生、棉花、葡萄、杏
等的 EST-SSR 标记已被开发（上官凌飞等
2011；张庶等 2010；李建斌等 2010；肖洋等
2010；刘凤楼和王辉 2010；张俊娥和邓华锋
2010）。本试验首次筛选、剪切、重组了 NCBI
公布的灵芝、粗皮侧耳 EST 序列，开发了有效
的粗皮侧耳 EST-SSR 分子标记体系，并证明其
在粗皮侧耳遗传多样性分析中的有效性。Eujayl
et al.（2004）认为 EST-SSR 标记中的核苷酸重
复序列是位于保守的编码区两侧，可应用于属
内不同物种，这种通用性在作物中研究较多特
别是草类中（Gupta et al. 2003；Thiel et al. 2003；
Saha et al. 2004；Yu et al. 2004）。本文首次将香
菇、灵芝的 EST-SSR 引物应用于粗皮侧耳的分
子标记分析中，试验表明：设计的 58 对灵芝
EST-SSR 引物在粗皮侧耳中扩增，有 16 对引物
能扩增出条带，占 27%，与黑莓（30%）、甜瓜
（35%）、茄子（32.3%）、黄瓜（28.2%）等相
近（Lewers et al. 2008；Kong et al. 2006；邵光
金等 2010；李楠等 2008）；35 对香菇引物中
有 6 对引物能扩增出条带，占 17%，与其他相
比通用性较低；基于粗皮侧耳本身设计的 9 对
引物，除引物 2 有稍微多态性外其余均无多态
性。因此，在粗皮侧耳本身缺乏 EST-SSR 分子
标记的情况下，香菇、灵芝的 EST-SSR 分子标
记在粗皮侧耳上还是具较高通用性，对于粗皮
侧耳的 EST-SSR 分子标记研究具有重要意义。
并产生了一套完整的分子标记数据能够对粗皮
侧耳栽培种遗传多样性分析，从分子水平彰显
了品种之间的亲缘关系。经过初步的排除同种
异名，根据农艺栽培性状随机选取种质资源，
采用多次聚类随机抽样的方法构建了一个含
47 株粗皮侧耳栽培种的初级核心种质库。该种
质库涵盖了种质资源的所有类型，包括一些典
型性状，基本可以代表当前粗皮侧耳栽培种的
现状。本研究所获得的经验将有助于改善我国
食用菌的种质资源及育种工作的进行，并对粗
皮侧耳栽培种核心种质库的进一步研究提供
依据。
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