全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 July 2009, 28(4): 558-563

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：安徽省自然科学基金（No. 090413086）
*Corresponding author. E-mail: yeming123@sina.com
收稿日期: 2008-08-29, 接受日期: 2008-12-12

金顶侧耳胞内多糖生物活性研究
叶明 1* 李世艳 1 郝伟伟 1 杨柳 1 庄文颖 2
1合肥工业大学生物与食品工程学院 合肥 230009
2中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室 北京 100101



摘 要：对金顶侧耳 Pleurotus citrinopileatus 胞内多糖的热水浸提工艺进行研究，并研究了该多糖的抑菌活性以及对超氧阴
离子自由基和亚硝基的清除作用。结果表明，金顶侧耳胞内多糖的最佳提取工艺为：提取温度 60℃，液料比 100:1，时间 4h，
此条件下多糖提取率可达 17.65%。该多糖对埃希氏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用且对超氧阴离子自由基和亚硝
基有较强的清除作用，说明该多糖具有明显的生物活性。
关键词：侧耳属，热水浸提，正交试验，抑菌作用，清除自由基

Bioactivities of intracellular polysaccharide from
Pleurotus citrinopileatus
YE Ming1* LI Shi-Yan1 HAO Wei-Wei1 YANG Liu1 ZHUANG Wen-Ying2
1College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Heifei 230009, China
2Key Laboratory of Systematic Mycology & Lichenology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: Extraction of the intracellular polysaccharide from Pleurotus citrinopileatus with hot water and antimicrobial activity and
scavenging capacity to superoxide anion radical and nitroso of the polysaccharide were studied. The optimum conditions for
extraction of the polysaccharide were as follows: temperature of 60℃, liquid and material in the ratio of 100 to 1, and 4 hours of
extraction duration. The extraction rate of polysaccharide is up to 17.65% under such conditions. The polysaccharide can inhibit the
growth of Escherichia coli and Staphyloccocus aureus, and the scavenging effects of polysaccharide on the superoxide anion radical
and nitroso were significant. It could be concluded that the polysaccharide displayed obvious bioactivities.
Key words: Pleurotus, hot water extraction, orthogonal experiment, bacteriolytic activity, free radical scavenging

侧耳属Pleurotus真菌，不仅味道鲜美，而且营
养丰富，除含有蛋白质、人体必需氨基酸、脂肪、
多种微量元素外，还富含60%－80%的多糖成分
（Kalmis & Sargin 2004）。侧耳多糖是一类重要的
DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.04.021
Vol.28 No.4 559
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生物活性物质，在国际上被称为“生物反应调节剂
（BRMs）”或免疫增强剂。BRMs可通过刺激免疫
系统，调节人体的生物反应，有望达到多种治疗的
目的。大量药理、药效研究已证实，侧耳属真菌多
糖（含β-D-葡聚糖链）对肿瘤的生长有明显的抑制
作用，因此具有很高的药用价值（Rout et al. 2008）。
金顶侧耳富含多种有效成分，是一种具有药用
功能的名贵珍稀食用菌，其多糖作为一种宿主免疫
增强剂，具有抗肿瘤、抗病毒、抗自由基、调节机
体免疫功能的作用（Gern et al. 2008；Lee et al.
2007）。一般侧耳多糖主要是从子实体中获得
（Gutiérrez et al. 1996），这种提取需要投入很高的
成本，因此目前还不适合工厂的大批量生产，若用
液体培养的方法，从菌丝体中提取多糖，可以简化
生产工艺，提高生产效率。本研究对1株金顶侧耳
菌丝体多糖的热水浸提工艺进行了研究，并测定其
抑菌活性和体外抗氧化活性，以期为金顶侧耳多糖
的研究、开发和应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
金顶侧耳Pleurotus citrinopileatus YM400、黑曲
霉Aspergillus niger、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus
aureus和埃希氏大肠杆菌Escherichia coli由合肥工
业大学微生物资源与应用研究室分离保藏。
1.2 主要试剂和仪器
2,6-叔丁基对甲酚（BHT，德国），邻苯三酚、
亚硝酸钠、苯酚、氯仿、正丁醇和浓硫酸等均为国
产分析纯。RE-85Z旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器
厂），TDL-50B离心机（上海安亭科学仪器厂），721E
型可见光光度计（上海禾工科学仪器有限公司）。
1.3 YM400多糖的提取及测定
称取 YM400 菌丝体 10g，粉碎至 60 目，加 80
倍蒸馏水，于 60℃水浴锅中保温 4h。将提取液浓
缩，加 2 倍体积的 95%乙醇，4℃下醇沉 24h。
3,000r/min 离心 15min 弃上清，沉淀依次以无水乙
醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥得胞内多糖粗品。
将胞内多糖粗品溶于水，用 30%的 H2O2 50℃保温
脱色，Sevage 法脱蛋白（Qin et al. 2002），即为胞
内多糖溶液。苯酚-硫酸法测多糖含量（Viñarta et al.
2006），以葡萄糖为标准物，用 721E 型可见光光度
计作比色分析。胞内多糖提取率 = (A×B)/M ×
100%，其中 A 为标准曲线上查出样品的含糖量
（mg/mL），B 为样品提取液稀释总体积（mL），M
为菌丝体质量（mg）。
1.4 YM400 多糖的热水浸提工艺
1.4.1 不同温度对多糖提取率的影响：固定液料比
为 80，提取时间为 4h，选择不同的提取温度（30、
40、50、60、70、80、90 和 100℃）进行提取，测
定多糖含量（3 个重复，下同）。
1.4.2 不同液料比对多糖提取率的影响：选择最适
提取温度，分别以不同液料比（20、30、40、50、
60、70、80、90、100 和 120）加入蒸馏水提取 4h，
测定多糖含量。
1.4.3 不同提取时间对多糖提取率的影响：选择最
适温度和液料比，提取时间分别为：1、2、3、4、
5、6 和 7h，测定多糖含量。
1.4.4 正交试验：在单因素试验基础上，以提取温
度、时间和液料比为 3 因素，各取 3 个水平，用 L9
（34）正交表进行试验。
1.5 生物活性研究
1.5.1 抑菌活性试验-牛津杯法：供试指示菌株（黑
曲 霉 Aspergillus niger 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌
Staphyloccocus aureus 和 埃 希 氏 大 肠 杆 菌
Escherichia coli 活化后，制成浓度为 105CFU/mL 的
指示菌菌悬液，备用。取 0.1mL 菌悬液均匀涂布在
牛肉膏蛋白胨培养基上，培养基上等距离均匀放置
无菌牛津杯 3 个，用移液枪在每个牛津杯中注入
0.1mL 一定浓度多糖溶夜，以无菌水作空白对照。
以黑曲霉为指示菌的在 28℃下培养 36h，以金黄色
葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌为指示菌的在 37℃下
培养 18h 后测定抑菌圈大小。
1.5.2 多糖对超氧阴离子自由基的清除试验：参照
Rout & Banerjee（2007）的方法，清除率（S）=（k0
－k1）/k0 ×100% 其中：k0为邻苯三酚自氧化速率，
即自氧化曲线的斜率；k1 为加入多糖后氧化曲线的
斜率。测定重复 3 次。
1.5.3 多糖清除亚硝基试验：参见龚宁等（2007）
方法，清除率 = [(原 NaNO2 的量－残余 NaNO2 的
量)/原 NaNO2 的量] × 100%。测定重复 3 次。
560 Mycosystema
2 结果与分析
2.1 温度对多糖提取率的影响
YM400 多糖的提取率随着提取温度的增加先
升高后又有所下降。当提取温度为 60℃时，多糖得
率高达 13.87%。当温度低于 60℃时，随着提取温
度的升高，固液扩散速度加快，温度越高，对物料
细胞的破坏作用越大，有利于物料有效成分的浸
出，此时多糖提取率增加较快。但当温度高于 60℃
时，随着温度的继续增加，胞内多糖结构遭到破坏，
降解成单糖或其他物质，从而影响了多糖的得率
（图 1-A）。


图 1 提取温度（ A）和液料比（ B）对 Pleurotus
citrinopileatus YM400 多糖提取率的影响
Fig. 1 Effect of temperature (A) and ratio of liquid to material (B) on
extraction yield of Pleurotus citrinopileatus YM400 polysaccharide.
2.2 液料比对多糖提取率的影响
随着液料比的增加，多糖的提取率逐渐增加，
当液料比达到 90:1 时，多糖提取率达到 15.38%，
此后多糖的提取率增加缓慢；当液料比为 120:1 时，
提取率为 15.53%，这说明在液料比为 90:1 时，菌
丝体中水溶性多糖已基本浸出，此时若再提高液料
比，提取率不再增加，反而会增加后期处理的难度
（图 1-B）。
2.3 时间对多糖提取率的影响
多糖的提取率随着提取时间的增加而增加，在
提取时间为 4h 时，多糖提取率为 15.69%，此后再
延长提取时间，多糖的得率不再增加，这说明提取
时间达到 4h 时，物系温度已基本稳定，物质扩散
达到平衡（图 2）。

图 2 提取时间对 Pleurotus citrinopileatus YM400 多糖
提取率的影响
Fig. 2 Effect of extraction duration on yield of Pleurotus citrinopileatus
YM400 polysaccharide.
2.4 正交试验
运用 L9（34）正交表设计研究提取温度、液料
比和时间对 YM400 多糖提取率的影响（表 1）。影
响 YM400 多糖提取率的因素大小依次为 A（温度）
＞C（时间）＞B（液料比），且最佳组合为 A2B3C2，
而直接获得的最优组合为 A2B3C1（表 1），这与极
差分析所得的结果不一致，则需进行验证性试验。
方差分析表明，A 因素（温度）对该多糖的提
取率具有极显著影响，C 因素（时间）对多糖的提
取率具有显著影响，而 B 因素（液料比）对胞内多
糖提取率的影响较小。对不同组合 A2B3C2 和
A2B3C1进行验证试验，其多糖提取率分别为 17.69%
和 17.65%，两种条件下，多糖的提取率相差较小，
考虑到生产上的能耗问题，选择 A2B3C1 为最佳提
取工艺条件：提取温度为 60℃，液料比为 100:1，
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时间为 4h（表 2）。
2.5 多糖的抑菌活性
YM400 多糖对金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus
aureus 和埃希氏大肠杆菌 Escherichia coli 均有一定
的抑菌活性，且抑菌能力随着多糖浓度的增加而增
强。其中对埃希氏大肠杆菌 Escherichia coli 的抑制
作用明显高于对金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus
aureus 的抑制作用，而该多糖对黑曲霉 Aspergillus
niger 几乎没有抑制能力。这说明 YM400 多糖可以
较好抑制细菌生长，而对真菌抑制能力较弱（图 3）。
表 1 正交试验结果
Table 1 Results of orthogonal experiment
实验号
No.
A（温度/℃）
Temperature (℃)
B（液料比）
Ratio of liquid to material
C（时间/h）
Extraction duration (h)
空列
Blank test
提取率（%）
Extraction yield (%)
1 1(50) 1(70) 1(4) 1 10.25
2 1 2(80) 2(5) 2 10.22
3 1 3(100) 3(6) 3 7.17
4 2(60) 1 2 3 16.98
5 2 2 3 1 13.26
6 2 3 1 2 17.63
7 3(70) 1 3 2 8.97
8 3 2 1 3 12.45
9 3 3 2 1 14.63
K1 9.213 12.067 13.443 12.713
K2 15.957 11.977 13.943 12.273
K3 12.017 13.143 9.800 12.200
极差 Range 6.744 1.166 4.143 0.513

表 2 方差分析表
Table 2 Analysis of variance
变异来源
Source of
variance
平方和
Sum of
squares
自由度
Degree of
freedom
比值 F
Value
of F
Fa
显著性
Signifi-
cance
A 68.855 2 149.037
F0.05
(2,2)
=19.00
**
B 2.528 2 5.472
F0.01
(2,2)
=99.00

C 30.691 2 66.431 *
D 0.462 2 1.000
总和
Summation
102.536 8

图 3 Pleurotus citrinopileatus YM400 多糖的抑菌活性
Fig. 3 Antimicrobial activity of Pleurotus citrinopileatus YM400
polysaccharide.

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2.6 多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
YM400 多糖对超氧阴离子自由基有明显的清
除作用，且随着浓度的增加，YM400 多糖对超氧阴
离子自由基的清除作用增强，但其清除能力弱于相
同浓度的 BHT（图 4-A）。
2.7 多糖对亚硝基的清除作用
低浓度的 YM400 多糖对亚硝基的清除作用较
弱，但随着浓度的增大，其清除能力增强。当浓度
低于 6g/L 时，YM400 多糖对亚硝基的清除能力与
VC 相比较弱，然而当浓度高于 6g/L 时，YM400
多糖对亚硝基的清除能力超过VC。10g/L的YM400
多糖对亚硝基的清除率高达 96.31%，而相同浓度的
VC 对亚硝基的清除率只有 93.67%（图 4-B）。


图 4 Pleurotus citrinopileatus YM400 多糖对超氧阴离子
自由基（A）和亚硝基（B）的清除作用
Fig. 4 Elimination effect of Pleurotus citrinopileatus YM400
polysaccharide on superoxide anion radicals (A) and nitroso (B).
3 讨论
目前，从食药用真菌的发酵液及菌丝体中提取
活性成分正日益受到重视。阿魏侧耳 Pleurotus
ferulae 子实体中提取的多糖具有一定的抗肿瘤活
性（董洪新和吕作舟 2003），但人工栽培子实体周
期长，劳动强度大，受季节、气候影响大及子实体
中多糖提取得率较低等限制了产品的工业化生产，
因而液体发酵是开发侧耳活性多糖的有效手段。董
洪新等（2004）从白灵侧耳 Pleurotus nebrodensis
子实体中提取水溶性多糖的得率为 5.38%，杨清香
等（2007）报道阿魏侧耳 Pleurotus ferulae 子实体
中水溶性多糖的提取率为 2.56%，而本研究从 1 株
金顶侧耳 Pleurotus citrinopileatus 菌丝体中提取水
溶性多糖的得率相对较高，可以达到 17.65%。研究
表明热水浸提 Pleurotus citrinopileatus YM400 多糖
的最适温度较低，对其结构破坏较小，且提取时间
短、液料比低，故在生产应用上具有能耗低，易于
进行后期处理等特点和优点。
我们测定了金顶侧耳胞内多糖的生物活性，结
果显示YM400多糖具有明显的抑制细菌能力，且对
超氧阴离子自由基和亚硝基的清除作用较强，多糖
浓度为300mg/L时，对超氧阴离子的清除率达到
73.69%；多糖浓度为8g/L时，对亚硝基的清除率为
92.33%，此时已经超过相同浓度VC对亚硝基的清
除率。显然YM400多糖具有较强的生物活性，有望
应用于食品、化妆品及医疗保健等行业。
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