全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(30830117)
作者简介:邢咏梅 ,女 ,博士　　研究方向:药用真菌学　　＊通讯作者:郭顺星 ,男 ,研究员 ,博士生导师　　研究方向:药用植物菌根生物学　
　Tel:(010)62829619　　E-mail:sxguo2006@yahoo.com.cn
·论　著·
环境因子对猪苓菌丝体生长发育的影响
邢咏梅 ,郭顺星＊(中国医学科学院-北京协和医学院药用植物研究所 ,北京 100193)
摘要:目的　为系统地探讨不同环境因素对猪苓菌丝生长发育的影响 , 对 pH, 温度 ,不同光照条件等环境因素影响猪苓菌丝生
长 、菌丝多糖含量及是否能够诱导猪苓菌核形成进行了研究。方法　用改良的 PDA培养基以平皿培养真菌的传统方法对猪
苓在不同环境因素作用下菌丝的生长状况进行了分析 ,用菌落直径来判断猪苓菌丝的生长速度。以苯酚-硫酸法测定不同 pH
及温度条件下培养的猪苓菌丝的多糖含量。结果　初始 pH为 8时最适于猪苓菌丝生长;同时在这一条件下成功诱导了猪苓
菌核形成;25 ℃是猪苓生长的最适温度;光照不利于猪苓菌丝生长 。不同 pH值的改良 PDA培养基培养的猪苓菌丝多糖含量
以 pH8, pH9和 pH10组多糖含量最高;其次是 pH5组 和 pH6组;多糖含量最低的是 pH4和 pH7组。不同温度条件下培
养的猪苓菌丝以 5 ℃组多糖含量最高 , 其次是 15℃, 10℃及 25℃ 3个组多糖含量较高 , 多糖含量最低的是 30℃组。结论
　环境因子对猪苓菌丝生长发育有着重要的影响 ,为深入研究猪苓菌丝形成菌核的人工培养提供了参考。
关键词:环境因子;猪苓;菌丝;菌核
中图分类号:R282　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)07-0493-04
EfectsofEnvironmentalFactorsonDevelopmentofMycelialGrowthofPolyporusumbelatus
XINGYong-mei, GUOShun-xing＊(InstituteofMedicinalPlantDevelopment, PekingUnionMedicalCollege, ChineseAcademyof
MedicalSciences, Beijing100193, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　EfectsofseveralenvironmentalfactorssuchaspH, temperatureandlightwereinvestigatedonmycelial
growth, polysaccharidecontentofmyceliaandsclerotialdevelopmentofPolyporusumbelatus.METHODS　Classicalmethodsofcul-
tivatingfungiwithpetridishusingmodifiedPDAagarmediumwereconductedtoevaluategrowthconditionsofP.umbelatus.Colony
diameterwasmeasuredtoestimatethegrowthrateofP.umbelatus.ThepolysaccharidecontentofmyceliaofP.umbellatuswasdetec-
tedwithPhenol-Sulphatecolorimetry.RESULTS　TheinitialpHof8 wasthemostsuitablepHvalueforgrowthofP.umbelatus,
meanwhilesclerotiaofP.umbelatuswassuccessfulyinducedatthesameconditions.Myceliagrewbestat25 ℃ andlightinhibited
growthofP.umbellatus.AmongthemyceliaofP.umbelatusbeingculturedbymodifiedPDAmediumwithdifferentpHvalues, poly-
saccharidecontentofGrouppH8, 9 and10washighest, folowedbythatofGrouppH5 and6.PolysaccharidecontentofGrouppH
4 and7 wasthelowest.AmongthemyceliaofP.umbelatusbeingculturedbymodifiedPDAmediumatdiferenttemperatures, poly-
saccharidecontentofGroup5 ℃wasthehighest, folowedbythatofGroup15℃, 10 ℃ and25 ℃.PolysaccharidecontentofGroup
30 ℃ wasthelowest.CONCLUSION　EnvironmentalfactorscouldgreatlyaffectmycelialgrowthandsclerotialformationofP.um-
bellatus.Thisstudymightprovidepreparatoryknowledgeforsclerotialformationunderartificialcultivation.
KEYWORDS:environmentalfactors;Polyporusumbelatus;mycelia;sclerotia
　　猪苓 [ Polyporusumbelatus(Pers.)Fr.] 作为传
统药用真菌 ,在中国 、韩国和日本等亚洲国家以及欧
洲和北美广泛应用[ 1-3] 。猪苓的药用部位是菌核 ,中
医常用菌核治疗全身浮肿 、尿频尿急 、急性肾炎 、尿
道疼痛等疾病 [ 4] 。 1973年日本学者 Miyazaki等首
次从猪苓菌核中分离得到多糖 ,并证明对动物性肿
瘤具有抑制作用 。此后 ,猪苓多糖被成功应用于临
床治疗[ 4-5] 。研究还表明 ,从猪苓菌核提取的猪苓多
糖具有自由基损伤清除作用 ,可明显降低肝脏中氧
化脂质的含量 ,提高细胞中超氧化物歧化酶(SOD)
和肝脏过氧化氢酶(CAT)的活性 ,从而能够延缓组
织细胞衰老 、保护机体 [ 6] 。
由于猪苓菌核市场需求量的增加和野生菌核的
过度采挖 ,导致其生境遭到严重破坏 ,使生长周期长
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的野生猪苓濒临灭绝 。因此 ,有关猪苓的人工培养
广泛受到关注。目前 ,人工栽培猪苓菌核生长缓慢 ,
产量低且不稳定 ,并且进行人工培养或半野生栽
培 [ 7-8] ,需要大量天然菌核作为种苓 ,大面积推广受
到限制 。猪苓菌丝形成菌核的关键技术尚未解决 ,
本实验系统地研究了几种环境因子对猪苓菌丝体生
长发育的影响 ,并首次观察了不同初始 pH值的改
良 PDA培养基对猪苓菌丝形成菌核的诱导作用 ,初
步探讨了不同 pH及温度条件下培养的猪苓菌丝多
糖含量的差异 ,以期为解决诱导猪苓菌丝形成菌核 、
为能快速获得大量人工菌核用于猪苓的栽培生产提
供参考 。
1　材　料
1.1　实验菌株
本实验所用猪苓菌种 ,由中国医学科学院药用
植物研究所郭顺星研究员从采自山西古县的猪苓菌
核分离 、鉴定 ,并保存于麦麸琼脂培养基。
1.2　试剂
葡萄糖 ,磷酸氢二钾 ,磷酸二氢钾 ,七水硫酸镁 ,
维生素 B1,除菌滤器 ,微孔滤膜(孔径 0.22 μm,直
径 13mm),琼脂粉等购自北京科百奥生物科技有限
公司。
1.3　培养基
改良的 PDA培养基:土豆 200g(煮水),葡萄糖
20 g,磷酸氢二钾 1 g,磷酸二氢钾 0.5 g,七水硫酸
镁 0.5g,琼脂粉 15g,去离子水 1 000 mL。常规高
压灭菌后冷却至 60 ℃, 0.05 g·L-1维生素 B1通过
0.22μm微孔滤膜加入到灭菌后的培养基中 ,充分
混匀后于直径 9cm的培养皿中倒平板 ,每个平皿倒
入 20mL培养基 。
2　方　法
2.1　pH实验
在上述培养基高压灭菌前调节不同 pH值 ,分
别为 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10设置 7个处理组 ,每组 10个
重复。沿平皿中培养的菌龄为 28 d的菌落外缘 ,用
打孔器打下直径为 13 mm的猪苓菌片 ,每个平皿中
央接种一片 ,置 25 ℃暗培养环境中培养 ,观察不同
pH值改良的 PDA培养基对猪苓菌丝的生长速度以
及对猪苓菌核的诱导情况 。
2.2　温度实验
在上述培养基中每个平皿中央接入直径为 13
mm的猪苓菌片 ,置于 25 ℃暗培养环境中培养 14d
后 ,分别设立 5, 10, 15, 20, 25, 30℃等 6个温度处理
组并置暗培养环境中再培养 28 d,每组 10个重复 ,
观察不同温度对猪苓菌丝生长的影响。
2.3　光照实验
以日光灯为光源 ,分别设置 24 h暗培养 、12 h
光照 12 h黑暗以及 24h全光照 3种方式处理 ,将接
入 13 mm猪苓菌片的平皿置 25 ℃环境中培养 ,每
个处理设 10个重复 ,观察培养 40, 50和 60 d时不
同光照条件对猪苓生长的影响。
2.4　猪苓菌丝多糖含量的测定[ 9]
2.4.1　标准曲线的制定 　精确称取无水葡萄糖
(105 ℃干燥至恒重)1 mg置 10mL量瓶 ,加去离子
水溶解并稀释至刻度 ,摇匀。分别精确吸取上述溶
液 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL于具塞试管
中 ,加去离子水 1mL,加 6%苯酚溶液 1 mL,加浓硫
酸 5mL,混匀 ,置沸水浴中加热 15 min,取出后置冰
水浴中冷却 30min,在 490 nm波长处分别测定其吸
光度 。
2.4.2　猪苓菌丝多糖含量的测定　猪苓菌丝于 60
℃干燥至恒重 ,精密取 0.1 g于 10 mL离心管中 ,加
5mL去离子水 ,超声提取 30min, 4 800r· min-1离
心 10min,弃上清 ,药渣 60℃干燥 ,干燥好的药渣转
至 50mL具塞三角瓶 ,加去离子水 20mL, 80℃水浴
提取 3 h,抽滤 ,弃药渣 ,上清液定容于 25 mL量瓶
中 ,精密吸取 1 mL置 10 mL离心管 ,加无水乙醇 4
mL, 4 ℃存放过液。 4 800 r· min-1离心 10 min,弃
上清 ,沉淀物用体积分数 80%乙醇洗涤 2次 ,每次 2
mL,将沉淀用去离子水溶解 ,定容于 2 mL量瓶作为
分析用的样品。精确吸取样品 0.25 mL,加去离子
水 1.75 mL,加 6%苯酚溶液 1 mL,加浓硫酸 5 mL,
混匀 ,置沸水浴中加热 15min,取出置冰水浴中冷却
30 min,在 490nm波长处分别测定其吸光度。
2.5　统计学分析
对猪苓菌丝生长的菌落直径及猪苓菌丝多糖含
量采用 SPSS13.0软件进行统计学分析 。
3　结　果
3.1　不同 pH值对猪苓菌丝生长及多糖含量的影响
猪苓菌丝在 25℃暗培养室环境中培养 56d,与
pH4组相比 ,以改良 PDA培养基初始 pH值为 8的
组(pH8组)猪苓菌丝生长速度最快(P<0.05),其
次是 pH9组。另外 , pH10组培养的猪苓菌丝生长
速度也较快(P<0.05), 生长速度最慢的是 pH7
组 , pH 8, pH 9和 pH 10组多糖含量最高 (P<
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0.05);其次是 pH 5组 和 pH 6组多糖含量较高
(P<0.05);多糖含量较低的是 pH7组(表 1)。另
外 ,我们还观察到 , pH8组菌落边缘有散在的菌核
形成 ,其余组未发现菌核形成(图 1),说明改良的
PDA培养基 pH值对猪苓菌核的形成有一定的诱导
作用。
3.2　不同温度对猪苓菌丝生长及多糖含量的影响
猪苓菌丝在 25 ℃暗培养室环境中常规培养 14
d,各组之间生长速度无显著性差异 ,再分别置于不
同温度(5, 10, 15, 20, 25, 30 ℃)下再培养 28 d(即
总的培养时间为 42 d时),通过测量菌落直径发现 ,
与 30 ℃组相比 ,在 25℃暗培养环境下常规培养的
猪苓菌丝生长速度最快(P<0.05);其次是 15 ℃组
以及 20 ℃组猪苓菌丝的生长速度较快(P<0.05),
30 ℃组猪苓菌丝的生长速度最慢 。多糖含量测定
结果表明 , 5 ℃组多糖含量最高 , 其次是 15 ℃, 10
℃及 25 ℃ 3个组多糖含量较高 , 多糖含量最低的
是 30℃组(表 2)。
表 1　不同 pH的改良 PDA培养基对猪苓菌丝生长及多糖
含量的影响 .n=10, x±s
Tab.1　EffectofmodifiedPDAmediumwithdifferentpHon
mycelialgrowthandpolysaccharidecontent.n=10, x±s
Group Growthratecolonydiameter/cm
Polysaccharidescontent
/%
pH4 4.00±0.10 2.46±0.08
pH5 4.31±0.151) 2.81±0.041)
pH6 4.68±0.181) 2.88±0.061)
pH7 4.02±0.11 2.55±0.14
pH8 5.81±0.141) 3.15±0.021)
pH9 5.78±0.161) 3.11±0.051)
pH10 5.12±0.131) 3.03±0.081)
注:与pH4组相比 , 1)P<0.05
Note:CompoundwithpH4group, 1)P<0.05
图 1　pH8在改良的 PDA培养基中诱导猪苓菌核形成(培
养 60d)
Fig.1　SclerotialformationofP.umbelatusundermodified
PDAmediumwithaninitialpHof8aftercultivationfor60 d
3.3　不同光照条件对猪苓菌丝生长的影响
当猪苓菌丝分别培养 40, 50和 60 d时 ,经测定
发现 , 24 h全黑暗条件下猪苓菌丝生长速度最快 ,
与 12 h光照 12h黑暗以及 24 h全光照两组相比 ,
具有显著性差异(P<0.05)。 12 h光照 12 h黑暗
和 24 h全光照条件均不利于猪苓菌丝的生长 ,结果
见表 3。
4　讨　论
真菌的形态发生 ,包括菌核的生长发育和繁殖
体形成 ,都受到包括 pH,光照 ,温度 , O2 , CO2以及机
械因素在内的各种环境因素的制约 [ 10] 。本实验表
明 ,不同的环境因素对猪苓菌丝的生长发育有着不
同的影响 。在所用的培养基及各种环境条件下 ,最
适合猪苓菌丝生长的初始 pH值为 8;最适合的温度
为 25 ℃,最适合的光照条件为暗培养。
我们还发现 ,在改良的 PDA培养基初始 pH值
为 8时菌落周边有小的猪苓菌核形成 ,说明直接由
猪苓菌丝人工诱导形成菌核成功 ,这也是首次由不
同 pH值的改良 PDA培养基成功诱导出猪苓菌核 ,
而在其他的环境因子的作用下没有诱导猪苓菌核
形成 。
表 2　不同温度对改良 PDA培养基培养的猪苓菌丝生长及
多糖含量的影响 .n=10, x±s
Tab.2　EffectofmodifiedPDAmediumwithdiferenttempera-
turesonmycelialgrowthandpolysaccharidecontent.n=10, x±s
Group GrowthrateColonydiameter/cm
Polysaccharidescontent
/%
5 ℃ 4.30±0.15 3.46±0.101)
10℃ 4.60±0.181) 3.24±0.081)
15℃ 4.91±0.101) 3.30±0.601)
20℃ 5.12±0.131) 3.04±0.061)
25℃ 5.65±0.191) 3.22±0.601)
30℃ 4.28±0.16 2.38±0.12
注:与 30℃组相比 , 1)P<0.05
Note:Compoundwith30℃group, 1)P<0.05
表 3　不同光照条件在不同培养时间对猪苓菌丝生长的影
响 .n=10, x±s
Tab.3　DiferentlightconditionsonmycelialgrowthofPol-
yporusumbelatusatdifferentcultivationtime.n=10, x±s
Group 40 d 50 d 60 d
24hdark 5.40±0.121) 5.76±0.191) 6.01±0.161)
24hlight 4.35±0.15 4.51±0.14 4.72±0.12
12hdark12hlight 4.44±0.18 4.55±0.16 4.85±0.13
注:与 24h全光照组相比 , 1)P<0.05
Note:Comparedwith24hlightgroup, 1)P<0.05
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在 25 ℃暗培养环境中 ,从不同 pH值的改良
PDA培养基培养的猪苓菌丝多糖含量的测定结果
可以看出 ,菌丝生长速度快可能有利于猪苓菌丝多
糖含量的积累。另外 , 5 ℃环境下培养的猪苓菌丝
多糖含量高 ,可能与低温环境下促进多糖含量增加
有关。有研究[ 11]表明 ,低温能够使欧洲油菜细胞壁
中的果胶(多糖)含量增加。在极端的环境条件下
(如干旱 、寒冷 、营养耗竭),猪苓菌丝于地面下的土
壤中形成猪苓菌核 ,条件适宜时 ,猪苓子实体在接近
地表的猪苓菌核顶部长出 。黑暗条件下培养的猪苓
菌丝生长状态优于光照条件下培养的猪苓[ 12] ,而光
照不利于猪苓菌丝生长的原因可能由自然条件下猪
苓菌丝固有的生长特性决定的 。
在今后的研究中 , 仍需进一步优化培养条件 ,
使诱导的猪苓菌核产量进一步提高 。另外 ,人工培
养的猪苓菌核的有效成分种类和含量也有待深入
研究。
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(收稿日期:2010-10-05)
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(DF2003078)
作者简介:冯卫生 ,男 ,博士 , 教授　　研究方向:中草药活性成分研究及新药开发　　Tel:(0371)65680011　　E-mail:fwsh@hactcm.edu.cn
华北耧斗菜的化学成分研究
冯卫生a,苏芳谊a,郑晓珂b,李原京a(河南中医学院 , a.药学院;b.基础医学院 , 郑州 450008)
摘要:目的　研究华北耧斗菜(AquilegiayabeanaKitag)中的化学成分。方法　利用 DiaionHP-20、ToyopearlHW-40、硅胶柱
等柱色谱技术进行分离纯化 ,根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定结构。结果　分离并鉴定了 13化合物的结构 , 分别为:
3, 4-二羟基苯乙酸(Ⅰ ), 羟基酪醇(Ⅱ),邻苯二酚(Ⅲ), 对羟基苯乙醇(Ⅳ), 3-甲氧基-4-羟基苯乙醇(Ⅴ ), 原儿茶酸(Ⅵ ),
没食子酸(Ⅶ ), 5, 7, 4′-三羟基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(Ⅷ ), 5, 4′-二羟基-6, 7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(Ⅸ ), 5,
7, 4′-三羟基-6-甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(Ⅹ ), 5, 7, 8, 4′-四羟基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(Ⅺ), 槲皮素-3-O-β-D-木
糖-(1※ 2)-β-D-半乳糖苷(≫), 芦丁(ⅩⅢ)。结论　以上 13个化合物均为首次从本植物中分离得到。
关键词:华北耧斗菜;3, 4-二羟基苯乙酸;没食子酸;黄酮;化学成分
中图分类号:R284　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)07-0496-04
StudyonChemicalConstituentsofAquilegiayabeanaKitag
FENGWei-shenga, SUFang-yia, ZHENGXiao-keb, LIYuan-jinga(HenanColegeofTraditionalChineseMedicine,
a.SchoolofPharmacy;b.BasicMedicalCollege, Zhengzhou450008, China)
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