全 文 :菌 物 学 报 25(2):302~307, 2006
Mycosystema
蜜环菌子实体的诱导和发生条件
程显好 郭顺星*
(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所, 北京 100094)
摘 要:研究蜜环菌子实体在人工诱导下的发生规律,主要包括子实体发生与培养基种类、培养基量、培
养时间等的关系。麦芽汁培养基是适合蜜环菌子实体发生的培养基,在该培养基上蜜环菌子实体发生率可
以达到 100%,子实体最短可以在 45 天发生。子实体发生与培养基瓶装量有关,每瓶中培养基总固形物
(琼脂除外)达到 6.75g才足以发生子实体。子实体发生时间与 25℃的培养时间有关系,培养时间不足使
子实体发生时间延迟。菌体总生物量对培养基中总营养成分的转化率可以达到 65.90%,子实体生物量对
培养基中总营养成分的转化率为 1.52%~9.11%。
关键词:子实体原基,人工诱导, 麦芽汁培养基,培养基瓶装量,生物量
中图分类号:Q939.96 文献标识码:A 文章编号:1672-6472(2006)02-0302-0307
The inducement and fruiting condition of fruit body of Armillaria
mellea
CHENG Xian-Hao GUO Shun-Xing*
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing
100094)
ABSTRACT:The development condition of fruit body of Armillaria mellea in artificial media was studied. The
relationship between fruit body formation and the induced factors such as medium formulas, medium quantities,
and incubation period were investigated. Wort agar medium was the optimal substrate for fruit body formation of
A. mellea. Fruit body formation reached 100 percent when A. mellea cultured on wort agar medium, and the
shortest forming time was 45 days. Fruit body formation was also related to quantity of medium. The lowest
requirement of gross nutritients (excluding agar) for fruit body formation was 6.75g per bottle. Fruit body
formation will be delayed if the incubation period in 25℃ was not enough. The transformation ratio of biomass
of mycelium to gross nutrients in medium was about 65.90%, and the transformation ratio of biomass of fruit
body to gross nutrients in medium was about 1.52%~9.11%.
KEY WORDS: Fruit body primordium, Artificial inducement, Wort agar medium, Medium bottling volume,
Biomass
蜜环菌 Armillaria mellea 是一种食药用真菌,该菌子实体也称榛蘑,味美可食;其液
体培养生产的菌丝体用于生产蜜环菌片等药物。另外,名贵中药材天麻和猪苓栽培都需要
基金项目:国家杰出青年科学基金专项资助项目(30325047),国家“十五”重大科技专项“创新药物和中药现代化” 资
助项目(2001BA701A62),国家自然科学基金资助项目(30470042)。
*通讯作者 Tel:(010) 62829619; E-mail:sxguo2006@yahoo.com.cn
收原稿日期:2005-10-07,收修改稿日期:2006-01-19
DOI:10.13346/j.mycosystema.2006.02.020
2期 程显好等:蜜环菌子实体的诱导和发生条件 303
蜜环菌伴栽,它们依赖蜜环菌提供营养物质才能正常生长。
蜜环菌的菌种鉴定除了传统的形态学方法之外,同工酶分析方法(Morrison et al. 1985),
培养特征分析方法(Rishbeth, 1986),免疫学方法(Burdsall & Banik, 1990),以及分子生
物学方法(Harrington & Wingfield, 1995)均有较大发展。但最具特征性的还是基于交配型
的蜜环菌生物种的鉴定方法。Hintikka(1973)发明了一种测试蜜环菌交配型的技术,
Korhonen(1978)对该技术改进后用于蜜环菌生物种鉴定。此方法依赖于能获得单孢子,并
在单孢子分离的基础上获得单倍体菌株。而单孢子的获得只能从子实体上得到。
研究人工诱导蜜环菌子实体,不但可以用于菌种复壮,也可以获得单孢子和单倍体菌
株用于鉴定其生物种,还可以为蜜环菌子实体栽培提供依据。
1 材料和方法
1.1 菌种
蜜环菌 Armillaria mellea 菌种由中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所真
菌室提供并保存。
1.2 培养基
麦芽汁培养基:每升麦芽汁(固形物 45g·L-1)中加入琼脂 15g,pH自然。
PDA培养基(g·L-1):马铃薯 200,葡萄糖 20,琼脂 15。
麦麸培养基(g·L-1):麦麸 30,葡萄糖 20,K2 HPO4 3, MgSO4 1.5, 琼脂 15。
胡萝卜培养基(g·L-1):胡萝卜 200(煮汁),葡萄糖 20,琼脂 15。
GPC培养基(g·L-1):葡萄糖 20,蛋白胨 6,玉米浆 10,琼脂 15。
GPY培养基(g·L-1):葡萄糖 20,蛋白胨 6,酵母膏 10,琼脂 15。
采用 500mL三角瓶,培养基装量 200mL/瓶,两层棉布和一层牛皮纸封口,121℃灭菌
30min,每个实验至少 3个重复。
1.3 培养方法
蜜环菌菌丝体培养:目的是进行蜜环菌营养生长研究,培养菌丝体及菌索。在 25℃条
件下暗培养。
蜜环菌子实体培养:目的是进行蜜环菌的生殖生长研究,主要包括子实体原基发生和
子实体发生。蜜环菌在 25℃条件下暗培养一定时间后,转移到 18℃、相对湿度 90%、每
天 12h散射光周期条件下培养。
1.4 适合蜜环菌子实体发生的培养基的筛选
观察 6种培养基上蜜环菌发生子实体情况,即麦芽汁培养基、PDA培养基、麦麸培养
基、胡萝卜培养基、GPC培养基、GPY培养基,在 500mL三角瓶中装量 200mL各种固体
培养基,两层棉布和牛皮纸封口,接种蜜环菌菌种后,25ºC 暗培养 20天,然后转入蜜环
菌子实体培养方法项下培养。
1.5 蜜环菌子实体发生率测定
采用麦芽汁培养基和 1.4 的培养条件,设 6 个重复,观察不同时间下蜜环菌子实体原
基和子实体的发生率。子实体原基发生的判定标准:在培养基表面生长的皮壳状菌丝的表
面,出现散生的小米粒大小和小米粒状的子实体原基,生长旺盛的子实体原基呈亮黄色,
有可能发育成子实体,而衰亡的子实体原基颜色变灰褐,不再进一步发育。子实体发生的
判定标准:由子实体原基进一步发育成子实体,初期呈白色棒槌状,即有子实体柄和菌盖
304 菌 物 学 报 25卷
的雏形,此后进一步发育成完整的子实体。
1.6 子实体发生与培养基量的关系
在 500 mL三角瓶中装麦芽汁固体培养基 100mL、150 mL、200 mL,每组 3个重复,
观察蜜环菌子实体原基以及子实体发生与培养基装量之间的关系。25℃暗培养 28天,转入
蜜环菌子实体培养方法项下培养。共培养至第 90天。
1.7 蜜环菌子实体发生与在 25℃下培养时间长短的关系
麦芽汁培养基装量 300mL/500mL三角瓶,接种后分别于 25℃暗培养至 15天、20天、
25 天后转移到 18℃、相对湿度 90%、每天 12h 散射光周期条件下培养。每组 3 个重复。
观察子实体原基和子实体的发生时间与 25℃暗培养时间长短的关系,目的是确定在一定的
培养基瓶装量条件下蜜环菌子实体发生最短时间的培养模式。
1.8 蜜环菌营养生长和子实体生长对营养成分的转化率测定
麦芽汁半固体培养基于 500mL三角瓶中装量分别为 100mL,150mL,200mL,250mL,
300mL,各组三个重复,接种蜜环菌菌种 25℃暗培养 25 天转入蜜环菌子实体培养方法项
下培养至子实体原基发生,取出培养物,用水仔细冲洗掉培养基成分,所得菌丝体和菌索
于 105℃烘干至恒重,称取菌体生物量。称取 10个成熟子实体的干重,计算每个子实体的
平均重量。
蜜环菌菌体生物量与培养基中总营养成分量(琼脂除外的总固形物)的比率为菌体生
物量对培养基中营养成分量的转化率;子实体生物量与培养基中总营养成分量(琼脂除外
的总固形物)的比率为子实体生物量对培养基中营养成分量的转化率。
2 结果与分析
2.1 适合蜜环菌子实体发生的培养基筛选
在 6种供试培养基即麦芽汁培养基、PDA培养基、麦麸培养基、胡萝卜培养基、GPC
培养基和 GPY 培养基上接种蜜环菌菌种,在 25℃条件下暗培养 20 天后,转移到 18℃、
相对湿度 90%、每天 12h 散射光周期条件下培养,至第 47 天,在麦芽汁培养基上长出蜜
环菌子实体。其它 5种培养基上培养至 90天一直未能形成子实体。表明麦芽汁培养基是适
合于蜜环菌子实体发生的培养基。子实体原基和子实体的形态见图 1-4。
2.2 蜜环菌子实体发生率实验
蜜环菌的不同培养时间,其子实体原基和子实体的发生率见表 1。在特定的培养时间,
子实体原基(60天)和子实体(84天)的发生率均可达到 100%。但最终完整子实体的发
生率仅为 67%,有的虽然有子实体的发生,但往往中间夭折或停止继续发育。子实体最短
可以在培养的第 45天发生。
本实验发现,子实体原基的发生时间分散在 20 天左右,而子实体的发生时间则分散
在 40天内。子实体的发生时间分散度更大。
2.3 子实体发生与培养基装量的关系
蜜环菌子实体的发生与培养瓶中培养基的装量有关。如表 2所示,每组 3个重复实验
中有两个发生子实体原基和子实体的时间不一致。在 500mL 的三角瓶中,100mL 培养基
装量的实验组不能发生子实体,200 mL装量的实验组发生子实体的时间比 150 mL装量的
实验组提前 10天。说明在一定的环境条件下,只有足够的营养,保证菌丝的生物量达到一
定程度,蜜环菌才有可能进行生殖生长。本研究结果表明,每瓶中培养基总固形物(琼脂
2期 程显好等:蜜环菌子实体的诱导和发生条件 305
除外)达到 6.75g才足以使蜜环菌发生子实体。营养越充分,子实体越容易发生。
图 1-4 蜜环菌子实体原基和子实体
1. 子实体原基 ×0.1;2. 幼年子实体 ×0.3;3. 子实体 ×2;4. 菌盖 ×1
FIG. 1-4 Primordium and fruit body of Armillaria mellea
1. Fruit body primordium ×0.1; 2. Young fruit body ×0.3; 3. Fruit body ×2;. 4. Pileus ×1
表 1 不同时间蜜环菌子实体原基和子实体发生率
Table 1 Formation ratio of primordium and fruit body in different incubation period
时间 (d)
Incubation period (d)
子实体原基发生率
(有原基瓶数/总瓶数)
Primordium formation ratio
(primordium formation bottles/total bottles)
子实体发生率
(有子实体瓶数/总瓶数)
Fruit body formation ratio
(fruit body formation bottles /total bottles)
41 1/6 0/6
46 5/6 2/6
60 6/6 4/6
84 6/6 6/6
2.4 蜜环菌子实体发生与在 25℃下培养时间长短的关系
表 3 和表 4分别总结了蜜环菌子实体的原基发生时间和子实体的发生时间。从实验结果
看,蜜环菌在 25℃暗培养的时间长短与转移到 18℃、相对湿度 90%、每天 12h 散射光周
期条件下培养后子实体原基以及子实体发生时间有密切关系。子实体原基发生时间比较集
306 菌 物 学 报 25卷
中,在 5天之内三组实验全部有子实体原基发生,但暗培养时间最长的实验组最早发现有
子实体原基发生,暗培养时间最短的实验组子实体原基发生的时间也最晚。
表 2 培养基装量对子实体原基和子实体发生的影响
Table 2 The effect of medium quantity on the formation of primordium and fruit body
培养基装量(mL/瓶)
Medium volume( mL/bottle)
子实体原基发生时间(天)
Primordium formation time (d)
子实体发生时间(天)
Fruit body formation time (d)
100 65 -
150 47 68
200 47 58
25℃暗培养 25天的实验组转移到 18℃、相对湿度 90%、每天 12h散射光周期条件下
培养后,最早全部发生了子实体,而且三瓶的发生时间集中在 3 天之内,25℃暗培养 20
天的实验组转移到 18℃、相对湿度 90%、每天 12h散射光周期条件下培养后三瓶子实体发
生时间分散在 7天之内,而且迟于 25天实验组。25℃暗培养 15天实验组转移到 18℃、相
对湿度 90%、每天 12h 散射光周期条件下培养后发生子实体的时间最迟,至第 74 天时还
有实验瓶未发生子实体。
25℃暗培养生长阶段主要完成菌体的营养生长。实验表明充分的营养生长是蜜环菌子
实体发生的重要条件,即在一定的环境条件下,菌体生长到一定量或者菌体生长中的某种
代谢产物积累到一定程度时,方能启动子实体的生长。
表 3 蜜环菌营养生长(25℃暗培养)时间与蜜环菌子实体原基发生时间之间的关系
Table 3 Relationship between vegetable growth time (incubation period at 25℃ in darkness) and formation time of
primordium in A. mellea
子实体原基发生率(有原基瓶数/总瓶数)
Primordium formation ratio/(primordium formation bottles /total bottles)
25℃培养时间(天)
Incubation period in 25℃
(d) 53d 55d 57d
15 1/3 1/3 3/3
20 2/3 3/3 3/3
25 3/3 3/3 3/3
表 4 蜜环菌营养生长(25℃暗培养)的时间与蜜环菌子实体发生时间之间的关系
Table 4 Relationship between vegetable growth time (incubation period at 25℃ in darkness) and formation time of fruit body
in A. mellea
子实体发生率(有子实体瓶数/总瓶数)
Fruit body formation ratio/
(fruit body formation bottles /total bottles)
25℃培养时间(天)
Incubation period in 25℃(d)
57d 59d 67d 74d
15 0/3 0/3 0/3 2/3
20 0/3 0/3 2/3 3/3
25 1/3 3/3 3/3 3/3
2.5 蜜环菌营养生长和子实体生长对培养基成分的转化率
蜜环菌营养生长和子实体生长对营养成分转化率测定结果表明,5 个处理组的每瓶平
均菌体生物量分别为 2.765g、4.335g、5.525g、6.892g和 8.897g。以 300mL麦芽汁计,其总
营养成分(固形物)为 13.5g,菌体生物量对总营养成分的转化率为 65.90%。从蜜环菌培
2期 程显好等:蜜环菌子实体的诱导和发生条件 307
养物每瓶中子实体发生数量可以看出,每瓶中子实体发生 1~6个不等,以每瓶形成 2个子
实体的瓶数所占比例较高。取出子实体经干燥称重后统计,成熟子实体的单体平均干重量
为 0.205g。子实体生物量对总营养成分的转化率为 1.52%~9.11%。从以上分析可以看出,
菌体生物量对总营养成分的转化率较高,而子实体生物量对总营养成分的转化率较低。
100mL培养基装量的实验组未能发生子实体,该实验组充分的营养生长后菌体生物量
为 2.765g(干计)。表明在一个相对封闭的环境中,菌体生物量达到 2.765g 时还不能够满
足子实体发生之需要。菌体生物量达到 4.335g以后就已经能够满足子实体发生之需要。
3 讨论
Kile (1981) 认为担子果在培养基上形成基本与自然界产生的季节一致。多数子实体培
养成功的例子都是接种后先在黑暗条件下培养,然后再暴露在变动的温度和光的节律。大
多数研究者认为子实体原基和担子果形成都需要光,但 Tang & Raabe (1973) 则认为子实体
原基发育并非无光不可。本试验也是在先 25℃条件下进行暗培养,然后转移到 18℃、相对
湿度 90%、每天 12h散射光周期条件下培养,长出了子实体。
对蜜环菌的子实体形成和发育的实验表明,子实体的形成对培养基有一定的要求,即
在特定培养基才能发生。培养基量与子实体的形成有关,揭示自然条件下,只有特定环境
中菌体生物量达到一定程度才可能发生子实体。暗培养时间长短与子实体的形成有关,表
明营养生长是否充分决定生殖生长的启动与否。一个相对封闭的环境中,蜜环菌菌体生物
量达到一定量才能发生子实体。菌体对培养基中总营养成分的转化率可达 65.90%,而子实
体对培养基中总营养成分的转化率较低,在 4.26%~25.56%。在实验室条件下,蜜环菌的子
实体最短可以在 45天左右发生。
本研究发现在实验室条件下,蜜环菌子实体的发生与自然界的季节变化无关;其子实
体诱导中低温刺激是否对蜜环菌子实体的产生有利仍待深入研究。
[REFERENCES]
Burdsall HH, Jr., Banik MT, 1990. Serological differentiation of three species of Armillaria and Lentinula edodes by enzyme-linked
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Harrington.TC, Wingfield BD, 1995. A PCR-based identification method for species of Armillaria. Mycologia, 87: 280~288
Hintikka V, 1973. A note on the polarity of Armillaria mellea. Karstenia, 13: 32~39
Kile GA, 1981. Armillaria luteobubalina: a primary cause of decline and death of trees in mixed species eucalypt forests in central
Victoria. Australian Forest Research, 11: 63~77
Korhonen K,1978. Interfertility and clonal size in the Armillaria mellea complex. Karstenia, 18: 31 ~42
Morrison DJ, Chu D, Johnson ALS, 1985. Species of Armillaria in British Columbia. Can J Plant Pathol, 7: 242~246
Rishbeth J, 1986. Some characteristics of English Armillaria in culture. Trans Brit Myco Soc, 85: 213~218
Tang H, Raabe RD, 1973. Sporophore production and heterothallism in Clitocybe tabescens. Phytopathology, 63: 1218~1222