全 文 ：菌 物 系 统 18 (3) : 033一 3 33, 199 9
月如c o sy s et m a
金耳多糖的提取及其性能研究
李卫旗 陈云龙
(杭州大学生命科学学院 杭州
皇甫宏
3 10 0 12 )
S T U D Y O N I SO L A T I O N A N D P R O P E R T I E S O F P O L Y S A C C H A R I D E F R OM
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关键词 金耳多糖 , rT e me la au ar ” iat lb “
中图分类号 Q 9 32 文献标识码 A 文章编号 1 00 7一3 5 15 ( 19 99 ) 0 3一 3 30一 33 3
金耳 ( rT e二 l la au ar n iat lb a) 又称黄木耳 , 为野生珍稀的食 、 药用菌 , 自然分布于我国西藏 、 云南等地 ,
是滋补养身 、 防御疾病的保健上品 (刘正南 , 1 99 1 ) 。 金耳的这些营养保健特性 , 与其富含的多糖成分有着
密切关系 。 目前 , 我国在云南 、 浙江等地 已研究成功人工规模栽培金耳的技术 , 人工培植的子实体在个
体 、 产量 、 营养成份方面均优于野生型 。 为了深人开发利用这一珍贵的食 、 药用菌资源 ,本文对金耳多糖
的分离纯化与结构分析了进行初步研究 。
1 材料和方法
L l 材料
金耳子实体干品自浙江省庆元县供销社食用菌厂购得 ,其它试剂均为国产分析纯试剂 。
1 .2 方法
L .2 1 金耳子实体的预处理 : 无杂质的金耳子实体干品加人 10 倍体积水 , 室温浸泡 24 小时后 ,复原成韧
胶质 , 外形呈脑状 回纹形态 。 将子实体切碎至玉米大小 , 备用 。
1 .2 2 金耳粗多糖的提取 : 以蒸馏水 、 O . SN N血O H溶液 、 .0 3 N H C I溶液分别作浸提液 , 对照试验 。 其工艺路
线为 : 子实体 + 20 倍体积浸提液 、 煮热加温 ~ 六层纱布初滤 , 滤液离心 巧 分钟 , 20 0 转 /秒一上清液水
浴浓缩 , 浓缩前后溶液体比为 :3 1一加人乙醇产生白色絮状沉淀一离心 15 分钟 , 300 转 /秒 , 离心沉淀物
自然风干 一金耳粗多糖 A P I。
L .2 3 金耳多糖的分离 : 粗多糖于热水中充分溶解 , 用蛋白酶法与 Sve ag e 法 (s ta t lb . A . 从 , 19 7 5) 脱蛋白 ,
交替进行数次 , 最后加人少量苯酚脱色 , 获多糖半纯品浓缩液 A r Z。
1 .2 4 金耳多糖的纯化 : 将 AP Z 加到氯化艳 、 三经甲基氨基甲烷液中 ,等密度梯度超速离心后 , 加人乙醇
沉淀 , 抽滤烘干 , 得多糖纯品 A P 3 。
L .2 5 粗多糖得率计算 :
得率 = 粗多糖 A P I 重子实体干重 X 10 0%
19 9 8刃 6一 2 9收原稿 , 19 9 8 { 9一 8收修改稿 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1999. 03. 020
3 期 李卫旗等: 金耳多糖的提取及其性能研究331
L2 .6 蛋白质含量测定 二 l习w y r法 (0 .H LO w y r, 19 5 1 ) , 以牛血清蛋白制作标准曲线 。
L .2 7 A P I 中的多糖含量分析 : 硫酸— 酚比色法 (李凤珍 , 19 85) 。
1
:2 多糖纯度鉴定
: 紫外分光光度法 (26 Onm , 2 80 nm )
。
L .2 9 多糖分子构型分析 :红外光谱分析 , s pe e 记 IR 红外光谱仪 , KB r 压片法
。
.12 .10 多糖的单糖组成分析 : AP 3 以 50 m g 加 1mo l 乓 Sq 封管 , 10 0℃水解 Zh, BaC O 3中和 , 过滤浓纸
作纸层析 , 展开剂为正丁醇 :乙酸 :水 = 4 : 1 : 5 (V /V ) ,苯胺— 邻苯二甲酸显色 , 105 ℃烘干 10 分钟 。
2 结果与分析
.2 1 金耳多箱的分离纯化
.2 L I 提取剂性质对粗多糖得率的影响 : 分别以 0 . 5 N 卜恤O H 溶液 、 .0 3N H C 】溶液蒸馏水作提取剂 , 对金
耳子实体进行浸提 ,各自在相同条件下分三次重复操作 ,将粗多糖得率作比较 , 结果见表 1 。
表1 提取剂性质对金耳粗多糖得率的影响
T ab le 1 I n fl ue nc e of ex tr a c iot
n
ag
e
nst on pol ys 那出iar de r a t e
次数 众 sm of / L N 台O H溶液 .0 3m of / L H C L溶液 蒸馏水
iT r n e s 0
.
s m o l / L N自O H S o liut on 0 . 3m o l / L H C L s ol iut o n 压 s it ll e d w a t e r
粗多糖得率 1 16 . 80 18 3 5 2 0 . 2 7
C ur de lP
o y s朗e h如 de I’a et 2 1 1 .6 7 1 1 . 3 3 19 3 1
(% ) 3 1 3 2 6 15 4 5 2 2 3 4
粗多糖得率
平均值 (% ) 13乡 1 15刃4 2 0 . 6 4
卫些鱼渔旦因全匹丝叁丝`h鱼丝旦旦旦丝 _ _ _ . 1 … …~ . . .一~ 一… l二 ~ ~ 一_ _ 。在实验中发现 , 用 卜恤O H 与 H C L 溶液作提取剂 , 浸提达到完全所需的时间较蒸馏水稍短 , 但从表 1
看出 ,蒸馏水提取的粗多糖得率明显较前二者高 。 这是因为稀酸 、 稀碱在浓度因子难以控制的情况下易
使金耳多糖发生糖昔键的断裂 ,使部分多糖发生水解而减少了提取得率 (Shi da . M . 197 5) 。 因此采用蒸
馏水作提取剂较易操作 , 并利于提高多糖得率 , 故以下试验中均以蒸馏水作为提取剂 。
.2 L 2 浸提条件因子对提取率的影响 : 我们以浸提结果关系最直接的四个因素— 浸提液浓缩比 、 乙醇加量倍数 (相对于浓缩液体积 ) 、 浸提时间、 操作温度作研究对象 , 按 9L (3 4 )正交表作出表头设计 (见表
2)
, 以粗多糖得率为指标 , 作正交试验 。 结果见表 3 。
表 2 L g (3 . )正交设计
aT 悦e Z ” ( 3` ) o曲o g o n 己 由 si g n
因素
几C ot r
水 平 水 平
l e v e l
因素
拍c ot r
le v e l
浓缩比
C O nc e n t扭 et d ar 把
时间 (h )
iT r OC
1
.
5 2刀
乙醇倍数
iT m
e s o f al e ho ol
温度 (℃ )
eT m pe
r a t u r e
0
.
5 1
.
5 2刀
表 3 结果表明 : B 因素 (乙醇倍数 )的极差最大 , 它对粗多糖得率影响最大 , C 因素 (浸提时间 )对得率
影响最小 。 在 9 个处理组合中 , 以第 9 组合 A 3B 3q q 的粗多糖得率最高 , 为 21 .45 % ,故在同等条件下 , 最
适的浸提工艺为 : 提液浓缩前后体积比为 4 , 乙醇加人的体积倍数为 3 , 浸提时间 1 . 5 小时 , 温度 50 ℃ 。
2
.
1 .3 金耳多糖的去蛋白分离 :
传统的多糖脱蛋白多以 Sve ag e 法多次重复来达到 目的 ,我们在此方法基础上 , 以 Sve ag e 法与蛋白酶
332 菌 物 系 统 1 8卷
表 3正交试验方差分析
T ab l
e 3V an anc
e a a ll lv si o sf o r h t
o gona l
e x pe r ime n t
因 素
处理号 凡C o tr
Te s t
n u刀 lbe r
粗多糖得率 (% )
C r ud e p o ly ac sc la r lide r a te
1 1
.
0 4
1 5
.
6 8
1 9 7 3
1 5
.
56
1 3
.
51
19 1 3
1 4 4 4
2 0 36
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9 4 3 1
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5 5 0 2 1
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4 6 4 5 4 1
.
4 0 5 1
.
0 7 4 6 3 6
KZ 4 9
.
3 8 5 2
.
5 5 5 2
.
6 9 4 9 4 3
K 一 5 6 2 5 6 0
.
1 3 4 7 3 2 5 5 2 9
凡 15 4 8 13 . 8 0 17 . 0 2 15 . 4 5
KZ 16泌6 17 . 5 2 17
.
5 6 16月 8
凡 18 . 7 5 2 0 . 0 4 15 . 7 7 18 4
R 3 2 7 6 2 4 1
,
79 2
.
9 8
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ōrù,`J且,且
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脱蛋白次数
4 5 6
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ǎ护à咧如唱位朋于龚确郭
T im es for d
e p拍 t e in
图 1 两种脱蛋白法的效果对照
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~今 - 单独用 s ve ag e法 2王于 s ve ag e法与酶法交替
进行法
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.
l C o l n p硕 si o n be wt e e n wt o de P or et i n me ht o d s
l— S e v ag e me ht ed al o en
2— S e v e ag m e ht o d a n d e nz y m e m e ht od al et arn et ly
法交替进行脱蛋白 , 所得结果如图 1。
图 1表明 , 交替使用 Sve ag e 法与酶法脱蛋白 , 有较高
的分离效率 , 因而该法有利于在操作中降低多糖折损 ,
减少脱蛋白操作次数 , 减轻后继纯化程序的操作负担 。
2
.
1 .4 金耳多糖的纯化 : 参照邹作华 (邹作华 , 199 5) 等
人的多糖纯化方法 , 将 已去蛋 白的多糖半纯品 A P Z 用
等密度梯度离心法分离 , 并用 乙醇反复沉淀提纯 , 去除
非糖组分 , 抽滤 、 烘干后得灰白色金耳多糖纯品 A P3 。
.2 2 金耳多糖的分析
.2 2
.
1 物理性质 : 金耳多糖纯品 A P 3 为灰白色粉末 ,较
难溶于冷水 , 易溶于热水或稀酸 、 碱溶液 , 浓度较高时
呈透明胶状 , 易被醇 、 酮等有机溶剂析出 。
.2 .2 2 化学定性反应 : A P 3 与硫酸葱酮液 、 硫酸苯酚液
均呈阳性反应 。
.2 .2 3 紫外光谱 : 将 A P 3 溶解后作紫外光谱分析 , 结果
表明 , 在 260 nm 与 2 80 nm 波长处均未发现有吸收峰 , 说
明 A P 3 中不含蛋白质 、 多肤与核酸 。
2
.
2
.
4 红外光谱 : 图谱中表明 : 在 29 30 、 124 7 e m 一 ’处有
两组特征峰 , 它们分别代表了糖类 -C H的伸缩振动与变角振动 , 因而进一步明确了 A P3 是糖类化合物 ;
在 16 50 一 159 0c m 一 ’处无吸收峰 , 说明 AP 3不含氨基 ; 89 6c m 一 `的吸收峰 , 代表了毗喃环 p一基端差向异构
的 。 H变角振动 ,证明了 妙3 有毗喃糖的 p一糖昔键结构 , 而这正是金耳多糖具有 良好生物活性的结构
前提 ; 7 98 c m 一 ’的吸收峰 , 反映了 A P3 含有映喃糖的衍生物 。 此外 , 10 59 、 14 1c0 m 一 `等处的红外吸收 , 也
3 期 李卫旗等 :金耳多糖的提取及其性能研究 333
是多糖类具有的吸收峰 (张惟杰 , 19 94) 。
.2 .2 5 A P 3 的单糖组成分析 : 将 A P 3 酸解液进行纸层析 , 获层析图谱如图 2 。
层析结果表明 , 金耳多糖水解物中含有甘露糖 、 半乳糖 、 木糖 、 葡萄糖 、 阿拉伯糖 、 不含岩藻糖与鼠李
糖 。 说明金耳多糖是一种杂多糖 。
口 .
.…:. …
A B C D E F G H
图 2 金耳多糖水解物纸层析图谱
A
. 岩藻糖 ; B .半乳糖 ; C .木糖 ; D . 鼠李糖 ; E . 阿拉伯糖 ; E 甘露糖 ; G 六种已知单糖混合物 ;
H
.多糖水解物
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2 1七e P a pe r C h r o m a t o g r aJ 刀 o f rT e柳 l la a “ r a n itQ lb a oP l y s ac e h o ir de hy d r o ly s aet s
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o n o s ac e h a ir de s : H yH d
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参 考 文 献
刘正南 , 19 9 1 . 金耳的经济价值与开发利用状况 . 中国食用菌 14 ( 1 ) : 23 .
李凤珍 , 19 8 5 . 芽抱杆菌属产生细胞外多糖研究 . 微生物学报 25 ( l ) : 25 .
邹作华 , 19 95 . E -F n 食用荤多糖的分离与结构研究 . 食品科学 16 (4) : 43 一46 .
张惟杰 , 19 9 4 . 糖复合物生化研究技术 . 浙江大学出版社 .
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