全 文 ：菌 物 系 统 21（3）：346~355, 2002
Mycosystema
同宗配合蜜环菌与欧美异宗配合蜜环菌狭义种
的分子系统学关系*
秦国夫 1 J. HANTULA2
(1国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 110034; 2Finnish Forest Research Institute,P.O.Box18, FIN-01301,Vantaa,Finland)
摘 要: 从亚洲、欧洲和北美收集 18个蜜环菌狭义种菌株，PCR扩增其 rDNA的 IGS和 ITS
区域，用 AluI、HaeIII、HinfI 和 TagI 四种限制性内切酶进行酶切，同时用随机扩增微卫星
(RAMS)多态性，对蜜环菌狭义种的进行了遗传多样性和分子系统学分析。结果蜜环菌狭义
种的 IGS和 ITS-RFLP 类型比以前报道的更多，亚洲、欧洲和北美菌株都具有比较明显的特
征片段，通过 ITS和 IGS图谱可将三个大陆的菌株区分开，其中 IGS-HinfI图谱能完全区分
3个大陆的菌株。RFLP 数据的系统学分析表明，该种存在明显的大陆遗传分化，亚、欧、北
美的群体分属三个相互独立的进化系，北美群体 IGS变异程度较小，ITS变异程度极高;而欧
洲群体 IGS的变异程度较大，多态性高，ITS变异程度非常小。RAMS 系统分析表明,中国、
日本和非洲的同宗配合蜜环菌属于一个系统发育系，该发育系同欧洲和北美的异宗配
合种的两个发育系分属 3个不同的独立进化分支。据此建议欧洲和北美的异宗配合蜜
环菌应作为蜜环菌的两个亚种。
关键词：蜜环菌狭义种，同宗配合，IGS-RFLP，ITS-RFLP，RAMS
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1007-3515（2002）03-0346-0355

蜜环菌属 Armillaria (Fr.:Fr.) Staude是一类重要的经济菌物，它引起的根朽病在全球范围
内危害 600多种木本植物，造成很大的经济损失。蜜环菌是著名的中药，也是栽培天麻和猪
苓的必备共生菌材。同时还是一类具有重要理论意义的菌物，其担子果形态变异大，用传统
的形态特征难以进行分类，从 Fries 到现在的 200 年间，基于形态学的蜜环菌属的分类一直
比较混乱，全世界竟有 250多个种划归该属（Volk，1995），而又有一些应该是蜜环菌属的真
菌被分到其他属中。1978年 Kari Korhonen首次发现了蜜环菌生物种后，生物种研究逐渐成
为形态分类学和鉴定病原菌的前提（Korhonen，1978）。迄今欧洲、北美、澳洲、非洲和日本
等国学者均按生物种标准鉴定了各自地区的蜜环菌种类(Shaw and Kile，1991; Korhonen，
1995;Ota，1998)。我们鉴定了中国 8个蜜环菌种，称为中国生物种(Chinese Biological Species，
CBS)，并通过交配实验，证实 CBS A、CBS B、CBS D和 CBS I分别是芥黄蜜环菌 A. sinapina
Bérubé & Dessur.、高卢蜜环菌 A. gallica Marxm. & Romagn.、奥氏蜜环菌 A. ostoyae
（Romagn）Herink.和假蜜环菌 A.tabescens(Scop.)Emel(贺伟等，1996；秦国夫等， 2000)。

*基金项目：国家自然科学基金项目（39770618， 30070015）、国家自然科学青年基金（39500001）和国家基金
委对外交流与合作项目（39811130581， 39911130299）资助课题
收原稿日期：2001-11-06，收修改稿日期：2001-12-21
DOI:10.13346/j.mycosystema.2002.03.010
3期 秦国夫等：同宗配合蜜环菌与欧美异宗配合蜜环菌狭义种的分子系统学关系 347
蜜环菌新的分类体系解决了一些基础和应用上的问题，也遇到一些新难点，如交配机制
不同、地理分布不同、形态差别较大的群体却存在亲和交配现象，日本的 Ota(1998)和秦国夫
（2000）发现，日本和中国的同宗配合种同欧洲和北美的异宗配合种部分亲和。为进一步探
讨这些同宗和异宗配合蜜环菌之间的系统差异，Coetzee 等(2000)对全球的蜜环菌狭义种
A.mellea s.str.进行了 IGS和 ITS 的 DNA序列分析，发现了该种存在亚洲、欧洲、东北
美和西北美 4 个独立的进化群体(Coetzee 等，2000)，但他的研究没有包括中国的同宗
配合菌株。Ota 等(2000)用 RAPD 技术发现了欧洲、北美和日本的三个进化群体 ,为揭
示中国同宗配合蜜环菌同其他大陆同宗和异宗配合蜜环菌的分子系统学关系，我们进
行了欧、亚、美 3 个大陆蜜环菌种菌株 IGS和 ITS 的 RFLP 以及 RAMS 分析，现将结
果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养
18 个蜜环菌狭义种的单孢菌株来自欧洲、亚洲和北美的 6 个国家（表 1）。将菌种
接种培养在赛璐玢 (cellophane) 膜表面上，膜下为含有 2%麦芽粉、2%葡萄糖和 0.5%
蛋白胨的培养基。待菌丝生长 2~3 周后，从膜表面刮取蜜环菌菌落，进行 DNA提取。
表 1 供试的蜜环菌狭义种菌株
Table 1 The single spore isolates of A.mellea used in the study
生物种
Species
照片代码
Code of photograph
菌株号
Number of Isolates
地点
Locality
寄主
Host
采集人
Collector
CBSG 79 98001 Hunan Cyclobalanopsis sp. QinGuoFu
CBSG 81 99043 Yunnan/ Keteleeria sp. Korhonen
CBSG 83 99044 Yunnan Keteleeria sp. Korhonen
Jap-Homo 84 83003 Japan Chamaecyparis sp. Rishbeth
A.mellea 85 B274 NH Pinus strobus Smereka
A.mellea 86 B275 NH Pinus strobus Smereka
A.mellea 87 B277 NH. Quercus sp. Worrall
A.mellea 89 B288 NH Unkown Harrington
A.mellea 90 68（1） NH Unkown Anderdon
A.mellea 91 68（2） NH Unkown Anderson
A.mellea 92 87085/10 Italy Opuntia ficus-indica Marxmüller
A.mellea 93 89109/6 Luxem. Fagus sp. Marxmüller
A.mellea 94 89113 Unkown Unkown Korhonen
A.mellea 95 89115/2 Luxem. Fagus sp. Marxmüller
A.mellea 96 89128 Neth. Fagus sp. Zólciak
A.mellea 97 90254/1 Italy Unknown Grillo
A.mellea 178 89116/3 Luxem. Quercus sp. Marxmüller
A.mellea 179 B282 NH Unkown Harrington

1.2 DNA提取
DNA 提取结合刘小勇等(1997)和 Vanio 等(1998)的方法进行。菌丝放在研钵中用液氮进
行研磨，转移到离心管后加含有 2%SDS 的裂解缓冲液(150mmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA,
10mmol/L Tris-HCl，pH7.4)，65℃保温 30~40min，离心去掉菌丝残体，上清液加入 1/10 的
348 菌 物 系 统 21卷
10mol/LNaCl溶液和 1/10的 10% CTAB缓冲液(10%CTAB，500mmol/LTris-HCl，100mmol/L
EDTA，PH8.0)，混匀后 65℃保温 15min。然后冰浴 5min后，加等体积的酚：氯仿：异戊醇
(25:24:1)，用震荡器充分混匀 20min，14000r/min 离心 20min。用酚：氯仿：异戊醇抽提重
复 4次，最后用等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提。抽提后的上清液用 0.6倍体积的聚乙
二醇溶液（含 20% (w/v) PEG 6000 和 2.5 M NaCl）沉淀，DNA在 50℃下真空泵抽干后溶于
含 1mmol/L EDTA 的 6 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)中备用。

1.3 PCR和 RAMS扩增
采用位于 rDNA 大亚基 3’端和 5SrDNA5’端之间的基因间隔区（intergenic spacer
region，IGS）和位于 17SrDNA 的 3’端和 25SrDNA5’端之间的内转录间隔区(internal
transcribed spacer，ITS)进行 PCR扩增。扩增 IGS的引物 LR12R和 0-1按 Anderson (1992)
的序列，扩增 ITS的引物 ITS1 和 ITS4 按（White，1990）的序列进行合成。引物浓度
2ìmol/L，使用 DynazymeⅡDNA 聚合酶，反应体积 50 ìL。样品先在 95℃下预变性
10min，加入酶后执行以下 35 个循环：95℃30s, 55℃55s，72℃2min，最后一个循环
72℃延伸 10min。
RAMS（Random Ampilified Microsatellite，随机扩增微卫星）技术最初由 Zietkiewicz
等（1994）报道，Hantula 等（1996）首次应用于菌物研究中，该方法综合 RAPD 覆盖
整个基因组、微卫星的多态性丰富以及定向 PCR 的重复稳定性强等优点，同时又摒弃
RAPD 和定向 PCR 方法的缺点，是目前研究遗传变异的较好方法。微卫星引物设计按
照 Hantula (1996，1997，1998)，Stenlid (1993)，本文采用 TCG、CGA、M13、GAAA
和 CT 等 5 个微卫星引物的序列见表 2。RAMS扩增基本同上述 PCR 程序，采用热启
动 PCR 以防止低温过程中非特异性扩增。各引物的退火温度见表 2。
表 2 RAMS引物及退火温度
Table 2 The primers of RAMS and its denaturation temperature
引物
Primers
序列
Sequences
退火温度（℃）
Denaturation temperature
TCG 5’XDH（TCG） 5 61
CGA 5’DHB（CGA） 5 61
GAAA 5’DBB（GAAA） 3GAA 45
M13 5’GAGGGTGGCGGTTCT 48
CT 5’DX(CT) 8 50
注：任选碱基为：B（G，T，或 C），D（G，A，或 T），H（A，T或 C），X（A，C或 G）

1.4 PCR产物的内切酶消化
将扩增的 PCR 产物的 NaCl终浓度调节到 0.3 mol/L，然后加 2倍体积的无水乙醇，置
冰上 1h，14000r/min离心 20min取沉淀，DNA 50℃真空抽干，加各内切酶缓冲液溶解后 ,
约 20 ìlPCR产物的溶液量加 AluI、HaeIII、HinfI和 TagI 10-15 U，37℃下酶切 16-24h（TagI
在 65℃下进行酶切反应）。
1.5 电泳检测和 DNA数据处理
RAMS产物和酶切后的PCR产物使用Synergel（Diversitfied Biotech）和琼脂糖(Promega co.)
3期 秦国夫等：同宗配合蜜环菌与欧美异宗配合蜜环菌狭义种的分子系统学关系 349
各1%制胶，电泳在TAE缓冲液(40 mmol/L Tris-Acetate，pH8.0; 1mmol/LEDTA)进行，溴乙锭
染色，紫外光下观察照相，用DNA100 bp ladder (Gibco BRL)判断分子片段大小，一般误差在
10bp左右。比照国外同类研究的做法，进行不同研究结果的片段比较时，误差在5bp左右视为
谱带相同。rDNA-RFLP图谱和RAMS图谱进行0，1数据转换后，分别用NEI＆LI（1979）和
LINK（1995）的方法计算相似系数，用TREECON软件的neibour-join程序构建系统树，根据
系统发育树探讨其亲缘关系。
2 结果与分析
2.1 RFLP 结果与分析
PCR扩增的 IGS和 ITS两个 DNA片段的 RFLP 表明，ITS 较 IGS的多态性高，能够检
测到种下更多的变异，除了HaeIII在 ITS没有识别位点外，其他三种酶对于 ITS的酶切多态
性都比 IGS要高。不过 IGS的多态性也较大，产生的类型也比较复杂。综合 ITS和 IGS的酶
切图谱看，亚洲、欧洲和北美菌株都分别具有比较明显的特征性片段，通过第一或第二长度
的酶切片段，或者二者的组合，都能够将三个大陆的菌株区分开，其中以 IGS-HinfI 的片段
多态性同菌株大陆起源吻合性最好。
以往的作者都使用 AluI 酶切 IGS 进行分子鉴定，Harrington(1995)将欧洲和北美的
A.mellea识别出(490，180bp)和(320，155bp)两种类型，Sierra(1999)将欧洲的 A.mellea识别出
(320，155bp) 和 (320，180，155bp)两种类型，Kim(2000)识别出(472，186，175，153bp)和
(473，175bp基本同 490，180bp)两个类型，Terashima(1998)报道日本的同宗配合种产生(371，
162bp)，这些作者加起来也只报道了 4 个类型，而本研究仅用 AluI酶切 IGS就产生了 6 个图
谱类型，其中包括以上 4位作者的结果。用 HaeIII酶切 IGS产生 6个图谱类型，亚洲菌株都
产生（320，270，180bp）图谱，欧洲菌株产生(320，270，190bp)和(320，285，190bp)两种
类型，北美菌株则产生 3 种类型，而且这 3 种类型似乎具有相似的酶切位点。用 HinfI 酶切
产生 3个图谱类型，而且这 3个图谱类型同蜜环菌的地理来源密切相关，亚洲的同宗配合种
全部产生(310，250，160bp)片段，欧洲菌株全部产生(260，230，160bp)片段，北美的菌株全
部产生(250，235，160bp)片段。用 TagI酶切 IGS产生 9 种图谱类型，亚洲的 4 个菌株就产
生了 3 种, 所有的北美菌株则产生相同的(390，190，140bp)片段，但是欧洲菌株变化较大,
产生了 5个图谱类型，同 HaeIII-IGS相似的是，它们似乎也有相似酶切位点。
在 ITS区具有酶切多态性的 3种酶切图谱中，亚洲、欧洲和北美 3个大陆的菌株都产生
特征性的酶切图谱，利用这 3 种酶切图谱都能够将 3个大陆的菌株分开。在 AluI酶切图谱中,
亚洲的菌株都产生(320，230，190，100bp)片段，欧洲菌株除一个菌株（89115）外，都产生
（320，200，195，100bp）的片段，北美菌株则产生(320，190，180，100bp)和(320，190, 100bp)
两中片段类型。在 HinfI 酶切图谱中，亚洲和欧洲菌株分别产生(280，180，170，150，110)
和(400，270，170，100)片段，而北美菌株则产生 4种片段类型。在 TagI酶切图谱中共产生
了 8种类型的片段，中国、日本和欧洲的菌株都分别产生特征性的片段，只有北美的菌株产
生了多态性比较复杂的 5种片段类型。
2.2 两个 DNA片段 RFLP 结果的系统学分析
基于 IGS-RFLP 数据建立的系统树如图 1 所示，可以清楚地发现，3 个大陆的蜜环菌群
350 菌 物 系 统 21卷
体之间存在明显的地理性遗传分化，系统树包含 3个非常明显的分支：亚洲同宗配合群体、
欧洲异宗配合群体和北美异宗配合群体，同 RFLP 的直观图谱一致。基于 ITS-RFLP 数据建
立的系统树见图 2，同 IGS的分析结果一样，也分化为 3个系统分支。通过 IGS和 ITS两个
系统树可以清晰地发现，不同 DNA 片段对于 3 个大陆的蜜环菌群体的变异程度不一样，亚
表 3 蜜环菌 IGS和 ITS扩增区的酶切片段
Table 3 Digested Fragments of amplified IGS region and ITS region of A. mellea
Endonucleases
Regions Strains
AluI HaeIII HinfI TagI
98001/50 320,230,190,100 920 280,180,170,150,110 270,240,195,165
99043/3 320,230,190,100 920 280,180,170,150,110 270,240,195,165
99044/2 320,230,190,100 920 280,180,170,150,110 270,240,195,165
83003/2 320,230,190,100 920 280,180,170,150,110 360,240,195
87085/10 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
89115/2 320,200, 100 920 400,270,170,100 500,195,140
89128 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
89116/3 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
89109/6 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
89113 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
90254/1 320,200,195,100 920 400,270,170,100 500,195,140
B274 320,190,180,100 920 410,400,390,370,100 500,480,210,200,140
B275 320,190,180,100 920 410,400,390,370,100 500,480,210,200,140
B288 320,190,100 920 400,400,100 500,210,140
B277 320,190,100 920 410,390,100 500,200,140
68(1) 320,190,180,100 920 405,370 500,480,210,140
68(2) 320,190,100 920 400,400,100 500,480,210,140
ITS
B282 320,190,100 920 410,400,390,370,100 500,480,200,140
98001/50 380,170 320,270,180 310,250,160 410,385
99043/3 315,170 320,270,180 310,250,160 490,385
99044/2 315,170 320,270,180 310,250,160 490,385
83003/2 315,170 320,270,180 310,250,160 385,370,150
87085/10 320,160 320,270,190 260,230,160 390,280,160
89115/2 320,160 320,270,190 260,230,160 390,160,140
89128 320,160 320,270,190 260,230,160 520,390,160
89116/3 No test 320,270,190 260,230,160 390,160,140
89109/6 320,185,160 320,285,190 260,230,160 520,390,160
89113 320,185,160 320,285,190 260,230,160 390,160
90254/1 320,185,160 320,285,190 260,230,160 520,160
B274 490,185,160 320,285,270,190,180 250,235,160 390,190,140
B275 490,185,160 320,285,270,190,180 250,235,160 390,190,140
B288 490,185,160 320,285,270,190,180 250,235,160 390,190,140
B277 490,185 320,190,180 250,235,160 390,190,140
68(1) 490,185 320,190,180 250,235,160 390,190,140
68(2) 490,185 320,285,190,180 250,235,160 390,190,140
IGS
B282 No test 320,285,190,180 250,235,160 390,190,140
3期 秦国夫等：同宗配合蜜环菌与欧美异宗配合蜜环菌狭义种的分子系统学关系 351

图 1 基于 IGS-RFLP 结果的系统分支图
Fig. 1 Unrooted dendrogram tree based on the IGS-RFLP data of the Armillaria mellea

图 2 基于 ITS-RFLP 结果的系统分支图
Fig. 2 Unrooted dendrogram tree based on the ITS-RFLP data of the Armillaria mellea

洲群体的两个DNA片段的遗传多态性基本相同, 但 IGS多态性较高。对于北美群体，IGS变
异程度较小，多态性低，而 ITS 变异非常大，多态性极高，这同 Coetzee 等(2000)对两个
DNA 片段的序列比较的结果是一致的。而欧洲群体则正好相反，IGS的变异程度比较大,
多态性高，甚至能够明显分化为两个亚群体，而 ITS 大都呈现为单一的 RFLP 图谱类型，变
异程度非常小。本研究用了 4 种内切酶，每种酶平均有两个识别位点，分别占两个扩增
0.1
m89115
m68(1)
J83003
mB277
G99044
mB282
m89109
m89116
m90254
m89113
m89128
m87085
m68(2)
mB288
mB275
mB274
G99043
G98001

G98001
m89113
J83003
mB288
m68(1)
mB277
mB282
m68(2)
mB275
mB274
m90254
m89109
m89128
m87085
m89116
m89115
G99044
G99043
0.1
352 菌 物 系 统 21卷
片段的 4%左右，结果表明两个 DNA片段对欧洲的变异程度不同，这同 Coetzee等(2000)
的序列分析结果有较大差异，可能是两个研究采用的菌株不同，或者本研究的覆盖的
DNA 区域较小的缘故。在两个系统树中，欧洲和北美的群体关系较近而它们距亚洲的较
远。
2.3 RAMS扩增结果的系统学分析
用 5个 RAMS引物进行了覆盖整个基因组的多态性分析，结果各引物间的多态性相差较
大，其中 M13、TCG、CGA扩增产物的效果最好，多态性最高，而 GAAA和 CT的产物较
少，多态性较小，尤其是引物 CT的多态性不高。但去掉 CT或 GAAA性状后得到的系统树
同不去掉基本一致，说明这两个引物产生的多态性也反映了进化上的信息。分析还表明，用
Nei ＆ Li（1979）和 Link(1995)两种相似系数计算方法得到的系统树也完全一致。为此，我
们用全部引物扩增后的 97个 0，1 性状进行了 Link（1995）相似系数计算，并构建了系统树
（图 3）。该系统分支树明显分为亚洲、欧洲和北美 3个蜜环菌系统进化系。在 3 个系统进化
系中，亚洲同宗配合群体的遗传分化较大，不仅日本同中国菌株间遗传差异较大，而且中国
内部（98001与 96043）的遗传差异也比较大；欧洲群体中除了 90254的遗传差异同欧洲的非
常大以外，其余所有菌株的遗传一致性都比较高；在北美群体的遗传差异较亚洲小而高于欧
洲群体。唯一的例外是产自欧洲的 90254菌株，其系统关系基本在北美发育系中，但如果分
析时将其作为外群处理，显示出该菌株处于 3个群体的中间位置（图 4），从而表明了该菌株
特殊的遗传本质。

图 3 基于 RAMS结果的系统树
Fig. 3 Unrooted phylogenetic tree based on the RAMS data of the Armillaria mellea


0.1
90254
68(1)
83003/2
B274
B282
99043/1
99043/3
89113
99044/1
99044/2
98001/11
98001/50
89109
89116
89128
90260
87085
89115
B288
68(2)
B275
B277
3期 秦国夫等：同宗配合蜜环菌与欧美异宗配合蜜环菌狭义种的分子系统学关系 353
3 讨论
目前日本和中国的同宗配合蜜环菌的单孢菌株呈现双倍体性状，并且与欧洲和北美的蜜
环菌狭义种呈现部分亲和交配现象，Ota（2000）用双倍体配对和 RAPD 技术证实日本的同
宗配合种同非洲的同宗配合种实际上属于一个克隆，我们在交配实验中也发现 83003
也同非洲的菌株呈现为同一克隆反映（结果另发表），所以来自日本的 83003 应该代表
了非洲亚种或至少部分菌株。因为 Chillali(1997)报道非洲亚种(A.mellea ssp.africana)
ITS-AluI产生(390，271，150，72bp)的片段，ITS-HinfI产生（400，234，200bp）的片段, 同
本实验亚洲同宗配合种的 ITS片段差异很大，可能非洲还存在与日本不同的菌株。本研究证
实，日本、非洲和中国的同宗配合蜜环菌属于一个系统发育系，该发育系同欧洲和北
美的异宗配合种的两个发育系分属 3 个不同的独立进化分支，这一结果与 Coetzee 用
IGS和 ITS的序列得到的结果一致，也同 Ota 用 RAPD 分析的结果一致。由于 RAMS
与 RAPD 的最大区别是所用引物为基因组中真实存在的序列，所以其产物多态性比
RAPD 多态性片段的真实性更好；同 IGS 和 ITS序列相比，RAMS多态性片段覆盖了
整个基因组，检测的多态性信息更全面。所以本研究用 RAMS 多态性建立的分子系统
树可信度更高。根据目前的系统发育种概念(Phylogenetic Species Concept，PSC)，不
同的系统发育系(Lineage)应该作为不同的系统发育种，我们认为欧洲和北美的异宗配
合蜜环菌应作为蜜环菌的两个亚种，同蜜环菌日本亚种(A.mellea subsp.nipponica )并
列，鉴于蜜环菌狭义种的模式在欧洲哥本哈根附近，欧洲亚种应为指名亚种，而北美
的则称为北美亚种，当然还需要进一步验证有关标本后才能作为有效名称。该方面的
研究正在进行之中。

图 4 设立外群的 RAMS系统分支图
Fig. 4 Rooted phylogenetic tree based on the RAMS data of the Armillaria mellea

0.1
90254
68(1)
83003/2
B274
B282
99043/1
99043/3
89113
99044/1
99044/2
98001/11
98001/50
89109
89116
89128
90260
87085
89115
B288
68(2)
B275
B277
354 菌 物 系 统 21卷
[参 考 文 献]
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PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS BETWEEN HOMOTHALLIC AND
HETEROTHALLIC ARMILLARIA MELLEA
Qin Guo-Fu
(Botanical Museum, University of Helsinki, P. O. Box, 47, FIN-00014, Helsinki, Finland)
Jarkko HANTULA
（Finnish Forest Research Institute,P.O.Box18, FIN-01301,Vantaa,Finland）
ABSTRACT: The 14 heterothallic isolates from Europe and North America, and 4 homothallic isolates from
China and Japan of Armillaria mellea were used for phylogenetic analysis. The IGS and ITS of these isolates
were amplified and digested by AluI, HaeIII, HinfI, TagI restriction enzymes. The result showed that the
IGS-RFLP and ITS-RFLP patterns observed are quite complicated and the variability of the patterns is greater
than that published before. The three continent isolates could be recognized by both IGS and ITS patterns,
and every continent possessed a characteristic pattern of its own in the IGS-HinfI digestion. The dendrogram
trees based on both IGS-RFLP and ITS-RFLP data indicated that there are three separate groups of A. mellea :
Asian, European and North American and the ITS sequence was more variable than IGS for the North
American group, and IGS sequence was more variable than ITS for the European group.
The random amplified microsatellite (RAMS) experiments were carried out with the primers TCG,
CGA, M13, GAAA and CT, respectively. Based upon the phylogenetic tree of RAMS results, these isolates
were also separated into three clades, i.e. the European (EU), North American(NA), and Chinese(CH)
geographical lineage. The Asian lineage consisted of homothallic isolates from Japan, and China. According
to this result and the Phylogenetic Species Concept (PSC) of fungi, appeared recently, we suggest that these
three groups should be considered as geographical subspecies.
KEY WORDS: Homothallism, IGS-RFLP, ITS-RFLP, random amplified microsatellite (RAMS)