全 文 ：149
第 卷第 期 34 2
2016 4 年 月
广 东 医 学 院 学 报
JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE
Vol. 34 No. 2
Apr. 2016
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( 是医院感染MRSA)
的重要病原菌之一。近年来，抗生素的临床广泛应
用加重了 菌的耐药水平，已成为临床急需解MRSA
[1]
决的严重问题 。目前研究认为， 菌产生耐药MRSA
的原因与耐药质粒的介导有很大的关系，其可在不
[2-3]
同菌株间转移和传播，使敏感菌成为耐药菌 。因
此，研制出高效、安全、无毒的质粒消除剂是当前
解决 菌耐药性的途径之一。前期研究表明大MRSA
[4-5]
叶桉挥发油具有良好的广谱抑菌作用 ，本文在此
基础上进一步研究了大叶桉挥发油对 菌质粒MRSA
的消除作用，为寻找可靠有效的 质粒消除剂MRSA
提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 MRSA 供试菌株 由中山市中医院检验科微
生物室临床分离菌株，金黄色葡萄球菌标准菌株
( ，实验操作在中山市中医院检验科微ATCC25923)
生物室中完成。
1.1.2 药物 大叶桉由广州至信药业有限公司提
供，经鉴定为桃金娘科 的干Eucalyptus robusta Smith
燥叶。
1.1.3 MH 试剂与仪器 琼脂培养基(江门市凯林贸
易有限公司)；空白药敏试纸(直径 ，6.25mm OXOID)，
吐温- 广州化学试剂厂)； 标准型净化80( XSW-CJ-2A
工作台(吴江市津化设备总厂)； 生化培养LRH-250A
箱( 广东省医疗器械厂) ； 浊度仪(珠海迪尔DL-ZD1
生物工程有限公司) ； 型立式灭菌器(山LMQR-4060
东新华医疗器械股份有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 MRSA MRSA 菌悬液的制备 菌经平板分离
培养 后，用无菌接种环挑取数个菌落置于生理24 h
盐水稀释液中，用浊度仪校正浓度至 麦氏标准0.5
液。
1.2.2 大叶桉挥发油制备 大叶桉剪碎后用水蒸气
蒸馏法固液比 提取挥发油，无水硫酸钠干燥备1:6
Abstract: Objective in vitro Eucalyptus robusta To study inhibition and plasmid elimination of volatile oil from in
methicillin resistant (MRSA). The inhibition and plasmid elimination of -Staphylococcus aureus Methods Eucalyptus robusta
derived volatile oil in MRSA were determined by one-by-one detection method. The growth of MRSA was obviously Results
suppressed by volatile oil, with the minimal inhibitory concentration of 5 mL/L, and plasmid elimination rate was 38.6% at 24 h
and 62.0% at 48 h. The volatile oil from possesses the significant inhibition and plasmid Conclusion Eucalyptus robusta
elimination in MRSA.
Key words: Eucalyptus robusta Staphylococcus aureus; plasmid elimination; methicillin resistant
大叶桉挥发油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑制及质粒消除作用
郑乐怡 （广东省中山市中医院，广东中山 ）528401
In vitro Eucalyptus robusta inhibition and plasmid elimination of -derived volatile oil in
methicillin resistant staphylococcus aureus
ZHENG Le-yi (Zhongshan People’s Hospital, Zhongshan 528401, China)
基金项目：广东省中山市卫生局医学科研立项
(No.2014A020273)
2015-07-26 2015-12-10收稿日期： ；修订日期：
1962 )作者简介：郑乐怡( － ，女，大专，主管药师。
摘 要：目的 了解大叶桉挥发油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( 体外抑制及质粒消除作用。方法 采用逐个MRSA)
检出法检测大叶桉挥发油对 抑制作用和质粒消除作用。结果 大叶桉挥发油明显抑制 生长，最低抑菌浓度MRSA MRSA
为 ， 、 质粒消除率分别为 和 。结论 大叶桉挥发油对 有显著抑菌和质粒消除作用。5 mL/L 24 48 h 38.6% 62.0% MRSA
关键词：大叶桉；质粒消除；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
中图分类号： 文献标识码： 文章编号：R 285.5 A 1005-4057(2016)02-0149-03
DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2016.02.011
用。
[6]
1.2.3 大叶桉挥发油抑菌活性实验 大叶桉挥发
油 用 的 吐 温 - 无 菌 水 溶 液 稀 释 成 、1% 80 150.00
100.00 60.00 40.00 20.00 10.00 5.00 2.50、 、 、 、 、 、 、
1.20 mL/L的大叶桉挥发油稀释液，用微量移液器吸
取 各浓度大叶桉挥发油均匀涂布于无菌空白药30 μL
敏纸片，两面各 。纸片吸透药液后贴于接种了15 μL
MRSA MH 37菌的 平板上，做好标记，置于 ℃恒温培
养箱中培养 。以平板中贴浸 有 吐温-24 h 30 μL 1%
80无菌水液的纸片为空白对照。用游标卡尺测量各
组抑菌圈直径，每组实验重复 次。判断标准：不敏3
感(抑菌圈直径≤ ，－ ，低度敏感(抑菌圈直6.25 mm )
径 ≤ ， ， 中 度 敏 感 (抑 菌 圈 直 径 > ，7 mm +) 7 mm
++) 15 mm +++)，高度敏感(抑菌圈直径≥ ， 。抑菌率
( )=[(药液抑菌圈平均直径-空白纸片直径)/空白纸片%
直径]× 。100%
1.2.4 MRSA MIC) 大叶桉挥发油对 最低抑菌浓度( 的
测定 用 的吐温 水溶液稀成 、 、
[7]
1% 80 150.00 100.00
60.00 40.00 20.00 10.00 5.00 2.50 1.20 mL/L 、 、 、 、 、 、
大 叶 桉 挥 发 油 稀 释 液 。 用 无 菌 棉 签 蘸 取 的0.1%
MRSA MH菌悬液接种于 平板中，用无菌棉签涂匀
后，移取 各浓度挥发油稀释液加于接种了0.2 mL
MRSA MH菌的 平板中，用无菌棉签均匀涂布，倒
置于恒温培养箱中培养 。观察 生长情况，24 h MRSA
有 菌落生长为阳性(+)，未见 菌落生长MRSA MRSA
为阴性(－)，以不生长 菌落的挥发油最低浓度MRSA
为大叶桉挥发油的 值。实验以 的吐温 无菌MIC 1% 80
水溶液作对照，重复 次，记录结果。3
1.2.5 MRSA MIC 庆大霉素和红霉素对 的 测定 将
庆大霉素( 和红霉素( 用倍比稀释法分别配制Gm) Em)
成 、 、 和 溶液， 测定方法128 256 512 1 024 mg/L MIC
同 。
[7]
1.2.4
1.2.6 MRSA 大 叶 桉 挥 发 油 对 的 质 粒 消 除 作 用
( 抗生素选择培养基的制备： 将 浓度的庆1) 1/2 MIC
大霉素和红霉素分别加入到 培养基，配制成质粒LB
消除的选择性培养基，现用现配。( 质粒消除实2)
验：用无菌棉签蘸取 的 菌悬液接种于0.1% MRSA MH
平板中，用无菌棉签涂匀后，移取 小于0.2 mL MIC
值浓度的大叶桉挥发油稀释液加于接种了 菌MRSA
的 平板中，用无菌棉签均匀涂布，倒置于 ℃MH 37
恒温培养箱中培养 。选取菌落数在 个左24 h 200~300
右的平板，采用逐个检出法分别接种在配制好的选
择培养基上和普通培养基平板上。 ℃下培养37 24 h
和 ，观察平板上的菌落数量并记录结果。以不48 h
加药液的培养基作空白对照，以 十二烷基硫酸SDS(
钠)作为阳性对照组，每组重复 次 。( 质粒消除的
[7]
3 3)
结果判定：在不含抗生素的平板上生长而在含抗生
素的选择平板上不生长，即为质粒消除子(需在选择
培养基平板上进行复试确认) 。质粒消除率( )=
[3]
%
A/B × 100 %(A：在不含抗生素的普通培养基平板上
生长而在含抗生素的选择性培养基平板上不生长的
菌落数； ：在不含抗生素的普通培养基平板上生B
长的菌落数)。
1.3 统计学处理
采用 软件进行χ 检验，以 为差2SPSS19.0 P<0.05
异有统计学意义。
2 结果
2.1 大叶桉挥发油对MRSA菌抑菌活性的影响
大叶桉挥发油稀释浓度≥ 时对 菌40 mL/L MRSA
呈高度敏感性，抑菌圈在 以上，抑菌率大于15 mm
145% 5~20 mL/L， 大 叶 桉 挥 发 油 稀 释 浓 度 为 时 对
MRSA 8.43~10.63 mm菌呈中度敏感性，抑菌圈在
内，抑菌率为 ，大叶桉挥发油稀释34.88%~70.08%
浓度低于 时对 菌呈低度敏感性，抑菌5 mL/L MRSA
圈小于 ，抑菌率小于 。详见表 。8.43 mm 34.88% 1
表 大叶桉挥发油 菌抑菌活性结果1 MRSA
大叶桉挥发油/(
-1
mL·L )
抑菌圈/mm
敏感度
抑菌率/%
150
26.72
+++
327.52
100
21.45
+++
243.2
60
18.64
+++
198.24
40
15.32
+++
145.12
20
10.63
++
70.08
10
9.62
++
53.92
5
8.43
++
34.88
2.5
6.52
+
4.32
1.2
6.25
－
0
空白对照
6.25
－
－
2.2 MRSA MIC 大叶桉挥发油对 菌 的测定
大叶桉挥发油浓度≥ 的培养皿内均未见5 mL/L
MRSA MRSA MIC菌生长，故大叶桉挥发油对 菌的 为
5 mL/L 2。详见表 。
2.3 MRSA MIC) 两种抗生素对 最低抑菌浓度( 的测
定结果
150 广 东 医 学 院 学 报 2016 34 年 第 卷
庆大霉素和红霉素在 以上浓度的培养1 024 g/L
皿内均未见 菌生长，故庆大霉素和红霉素对MRSA
MRSA MIC 1 024 g/L菌的 值均大于 ，该剂量下可用于
质粒消除实验。详见表 。3
2.4 MRSA 大叶桉挥发油对 质粒消除的结果
大叶桉挥发油作用 菌 和 后质粒的MRSA 24 h 48 h
消除率分别为 和 ，表现出较好的质粒消38.6% 62.0%
除作用，其消除效果跟时间有关，作用时间越长对
质粒消除效果越好，差异有统计学意义( 。详P<0.05)
见表 。4
表 大叶桉挥发油 菌 的测定2 MRSA MIC
大叶桉挥发油/(
-1
mL·L )
MRSA
150
－ －
100
－
60
－
40
－
20
－
10
－
5
+
2.5
+
1.2 空白对照
－
表 两种抗生素对 菌 的测定结果3 MRSA MIC
Gm/(g·L )
-1
Em/(g·L )
-1
MRSA
265
+++
512
++
1 024
－
2 048
－
空白对照
+++
265
+++
512
++
1 024
－
2 048
－
空白对照
+++
表 大叶桉挥发油对 质粒消除的结果4 MRSA
组别 挑选菌落/个
质粒消除[菌落数(消除率/ )]%
24 h 48 h
Gm Em 合计 Gm Em 合计
大叶桉挥发油
SDS
空白对照
500
500
500
89(17.8)
246(49.2)
0
104(20.8)
103(20.6)
0
193(38.6)
349(69.8)
0
124(24.8)
297(59.4)
0
186(37.2)
196(39.2)
0
310(62.0)
493(98.6)
0
3 讨论
李苌清等 研究表明，高温培养、溴化乙啶、
[8]
紫外照射及 均具有良好的质粒消除作用，但这SDS
些方法要么毒副作用强，要么操作性差，较难在临
床中应用。中草药中清热解毒功效的药物大部分具
有较好的抗菌作用，而从中发掘天然无毒、高效的
质粒消除剂是当前的热点。已有研究发现，黄连、
紫花地丁、艾叶等对大肠埃希菌质粒具有消除作
用 ，黄柏和甘草对 菌质粒也有消除作用，但
[9]
MRSA
质粒消除率较低，均不足 。大叶桉是南方经
[7]
30%
济树种，植株高大，从中提取出来的大叶桉挥发油
含量高，具有很好的研究开发价值。研究发现，大
叶桉挥发油具有消炎、抗菌、抗氧化等多种功效 。
[10]
本文采用牛津杯法和逐个检出法分别检测大叶桉挥
发油对 的抑制作用和对质粒的消除作用，结MRSA
果发现大叶桉挥发油对 菌具有较好的抑制作MRSA
用，其 为 ，作用 和 对 菌质MIC 5 mL/L 24 h 48 h MRSA
粒的消除率分别为 和 ，并随时间延长质38.6% 62.0%
粒消除作用增强，是理想的质粒消除剂。
参考文献：
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151第 期 2 郑乐怡 . 大叶桉挥发油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑制及质粒消除作用