全 文 ：小叶朴组织培养无菌体系的建立
王斯彤 (辽宁省固沙造林研究所，辽宁阜新 123000)
摘要 ［目的］建立小叶朴组织培养初代无菌体系。［方法］通过对不同消毒剂及消毒时间的对比，筛选出能够有效控制小叶朴初代培
养的污染率，且不抑制小叶朴茎段萌发的消毒处理。［结果］小叶朴茎段经 70%乙醇消毒 30 s 2 次，再用氯化汞消毒 6 min所得茎段污
染率低，萌发率高。对于后期出现的真菌污染采用多菌灵作为消毒剂和添加剂，用 200 mg /L多菌灵浸泡外植体 60 min能有效地控制污
染，且具有较高的萌发率。在培养基中添加 200 mg /L多菌灵也能抑制真菌污染，且效果优于多菌灵浸泡处理。［结论］建立了小叶朴组
织培养无菌体系，为小叶朴组培苗的增殖和生根提供参考。
关键词 小叶朴;消毒处理;组织培养
中图分类号 S723 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)31 －0153 －03
The Establishment of Tissue Culture Sterile System of Celtis bungenana
WANG Si-tong (Sand-fixation Afforestation Institute in Liaoning Province，Fuxin，Liaoning 123000)
Abstract ［Objective］The aim was to establish tissue culture sterile system of Celtis bungenana． ［Method］Through the comparison of differ-
ent disinfectants and disinfection time，tissue culture sterile system of Celtis bungenana with lowerpollution rate and higher germination rate
were screened． ［Ｒesult］By comparison with 70% alcohol disinfection 30 s 2 times，with mercuric chloride for 6 minutes from the stem seg-
ments were of low pollution，high germination rate． Late for the fungus pollution using carbendazim as disinfectant and additives，soaking with
200 mg /L carbendazim explant 60 min，can effectively control the pollution，and can have better germination rate． 200 mg /L is added in the
culture medium carbendazim can restrain fungus contamination，and better than carbendazol soaking process． ［Conclusion］The study stabli-
hed tissue culture sterile system of Celtis bungenana，and provide reference for proliferation and rooting of Celtis bungenana．
Key words Celtis bungenana;Disinfection treatment;Tissue culture
作者简介 王斯彤(1990 － ) ，女，辽宁阜新人，助理工程师，从事林木遗
传育种研究。
收稿日期 2016-08-24
小叶朴(Celtis bungenana)为榆科朴属落叶乔木，其树形
端正，遮阴好，是常用的庭院绿化及行道树种，也可以利用其
乡土树种的优势，进行荒山造林。由于小叶朴生长缓慢，主
要繁殖方式是播种繁殖，繁殖时间长，极大地制约了小叶朴
在林业上的推广应用。将组织培养技术应用于小叶朴的繁
殖上，不仅可以缩短繁育年限，同时对小叶朴的良种选育起
到促进作用。污染是小叶朴组织培养过程中的技术难题。
外植体材料、培养基、接种工具、接种室消毒不严格或无菌操
作不规范及植物内生菌的存在等因素均可导致污染的发生。
乙醇、氯化汞等消毒试剂的使用能够很好地消灭茎段表面的
细菌，但对于植物茎段内的内生菌及真菌难以消除。笔者采
用多菌灵作为消除内生菌和真菌的药剂，采用消毒剂和添加
剂 2种形式进行对比，建立初代无菌体系，为小叶朴组培苗
的增殖和生根提供参考［1 －5］。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 供试材料采自沈阳农业大学后山的小叶
朴，枝条应在连续 3个晴天后采集，采集当天天气晴朗，时间
在 11:00 ～15:00，选取小叶朴当年萌发的幼嫩茎段作为外植
体进行消毒对比试验。消毒试剂:乙醇、氯化汞、次氯酸钠、
青霉素、多菌灵。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 外植体的预处理。选取生长良好、无病虫害的小叶
朴新萌发枝条，将枝条剪成长约 5 cm带腋芽或顶芽的小段，
去除叶片，加少量洗衣粉清洗表面的杂质，用流水冲洗 30 ～
60 min后，再用蒸馏水冲洗 4 ～5次(不断振荡烧杯) ，置于超
净工作台上备用。
1． 2． 2 外值体的消毒。①乙醇(70%、75%)、氯化汞
(0. 1%)配合使用进行消毒，消毒后无菌水冲洗 3 ～ 4 次，接
种至培养基中。②使用次氯酸钠(2%)消毒 6、9、12、15 min，
消毒后无菌水冲洗 3 ～ 4 次，接种至培养基中。③使用多菌
灵(3%)溶液浸泡消毒 20、40、60 min，消毒后无菌水冲洗 3 ～
4次，再用乙醇和氯化汞配合消毒，接种至培养基后进行观
察。与多菌灵作为添加剂进行对真菌抑制对比。
1． 2． 3 培养基中消毒剂的添加。在配制培养基过程中，加
入琼脂、植物生长调节剂和蔗糖后，在各组培养基中分别单
独加入不同浓度的青霉素和多菌灵，青霉素浓度为 25、50、
100、200 mg /L ，多菌灵(50%)为 25、50、100、200 mg /L。
1． 3 数据分析 采用随机区组设计，通过腋芽萌发率、污染
率等指标，研究消毒剂和消毒时间对污染率和萌发率的影
响。计算公式:
萌发率 =萌发的茎段数 /外植体数 ×100%
污染率 =污染的茎段数 /外植体数 ×100%
2 结果与分析
2． 1 不同乙醇与氯化汞配合处理对外植体的影响 由表 1
可知，乙醇与氯化汞配合使用能有效地控制污染率，促进茎
段萌发。随着乙醇和氯化汞消毒时间的增加，污染率逐渐降
低，但消毒时间过长会抑制茎段的萌发，降低茎段的萌发率。
综合考虑，处理⑤污染率偏低，萌发率较高，为小叶朴较好的
消毒处理。
方差分析结果表明，乙醇对小叶朴茎段的预处理具有显
著影响，乙醇具有较强的穿透性，利用此特性，可以清除小叶
朴茎段表面细菌，同时加强了氯化汞的消毒效果。
2． 2 不同次氯酸钠消毒时间对外植体的影响 用 2%次氯
酸钠对小叶朴茎段进行不同时间的消毒处理，其污染率及
萌发率见表 2。由表 2 可知，随着消毒时间的增加，污染率
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(31):153 － 155 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.31.144
逐渐降低，当消毒时间达 15 min时污染率降低不明显，且会
抑制茎段萌发。因此，最适消毒时间为 12 min，此时污染率
和萌发率都控制在较适宜的范围。
表 1 乙醇和氯化汞对小叶朴茎段的消毒效果
Table 1 Disinfection effect of Alcohol and mercuric chloride to Celtis
bungenana
处理
Treatment
灭菌时间 The sterilization time
乙醇
Alcohol
氯化汞
mercuric chloride
min
污染率
Pollution
rate∥%
萌发率
Germination
rate∥%
① 70% 30 s 1次 3 55． 1 33． 7
② 70% 30 s 1次 6 38． 7 44． 5
③ 70% 30 s 1次 9 36． 6 45． 9
④ 70% 30 s 2次 3 49． 7 37． 9
⑤ 70% 30 s 2次 6 34． 5 49． 1
⑥ 70% 30 s 2次 9 33． 3 47． 8
⑦ 75% 30 s 1次 3 55． 8 34． 7
⑧ 75% 30 s 1次 6 37． 9 42． 3
⑨ 75% 30 s 1次 9 32． 5 39． 8
⑩ 75% 30 s 2次 3 47． 3 32． 5
瑏瑡 75% 30 s 2次 6 33． 1 42． 7
瑏瑢 75% 30 s 2次 9 32． 7 38． 6
注:样本数为 60。
Note:Samle number was 60．
表 2 2%次氯酸钠对小叶朴茎段的消毒效果
Table 2 Disinfection effect of 2% sodium hypochlorite to Celtis bun-
genana
处理
Treatment
灭菌时间
The sterilization
time∥min
污染率
Pollution
rate∥%
萌发率
Germination
rate∥%
① 6 55． 8 39． 4
② 9 43． 9 42． 2
③ 12 39． 7 45． 3
④ 15 38． 1 41． 9
2． 3 多菌灵对外植体真菌污染的抑制作用 由图 1 可知，
多菌灵作为消毒剂和添加剂均能降低污染率。随着多菌灵
浓度的升高，污染率降低，多菌灵浓度从 50 mg /L 升至
100 mg /L时污染率降低最明显，当多菌灵浓度为 100 ～
200 mg /L时，污染率降低趋于平缓。而多菌灵作为添加剂的
消毒效果优于消毒剂，其原因为多菌灵作为添加剂加入培养
基中，能够参与其新陈代谢，进入植物体内起到杀菌消毒的
作用。而作为消毒剂时，消毒剂的浓度和消毒时间都会影响
消毒效果。由图 2可知，随着消毒时间的增加，污染率降低，
消毒时间在 60 ～80 min时趋于平缓，污染率变化较小，且萌
发率有所下降，说明当消毒时间达 80 min时，污染率降低不
明显，但会抑制茎段的萌发。
2． 4 添加剂的消毒效果 通过在培养基中添加青霉素和多
菌灵，对比 2 种消毒剂的消毒效果，结果见图 3。由图 3 可
知，青霉素对细菌污染的发生有一定的抑制作用，特别是前
10 d，效果明显，但对真菌污染作用不明显。多菌灵对细菌污
染的抑制效果一般，但对后期真菌污染有较好的效果，这与
李颖等［6］研究结果一致。
图 1 多菌灵作为消毒液和添加剂对真菌污染的影响
Fig． 1 Effect of Carbendazim as disinfectant and additive on
fungi pollution
图 2 不同消毒时间对污染率和萌发率的影响
Fig． 2 Effect of Different disinfection time on pollution rate and
germination rate
图 3 添加剂的消毒效果
Fig． 3 Additive effect of disinfection
3 结论与讨论
小叶朴茎段具有污染率高、消毒困难的问题，需要进行
多种消毒试剂以及消毒时间的筛选。消毒时间过长影响萌
发率，过短则消毒不彻底，易污染。该试验对小叶朴茎段进
行消毒筛选，结果表明，经 70%乙醇消毒 30 s 2次，再用氯化
汞消毒 6 min所得茎段污染率低，萌发率高。在用 2%次氯
酸钠进行消毒试验中，次氯酸钠对小叶朴茎段的消毒效果较
好，用 2%次氯酸钠浸泡 12 min 时，消毒效果好，萌发率高，
但与乙醇和氯化汞配合使用相比略有不足。因此，生产实践
中，追求较低的污染率和较高的萌芽率时可采用乙醇与氯
化汞。
针对出现的真菌污染，该研究采用的多菌灵效果突出，
451 安徽农业科学 2016 年
分别作为消毒剂和添加剂加入到培养基中，发现其抗污染能
力强，对外植体的副作用小，且萌发率高。而作为消毒剂时，
长时间的浸泡会刺激植物表皮，影响茎段萌发。
在青霉素和多菌灵作为添加剂的对比试验中，青霉素能
够较好地控制细菌污染，多菌灵能够控制真菌污染，且萌发
率高，因此，可尝试青霉素和多菌灵混合使用，以减少污染。
多菌灵和青霉素对小叶朴茎段的生长发育是否有影响鲜见
报道，因此需要后续试验进行规范和调整，以建立小叶朴组
织培养的完整体系。
参考文献
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6 －8．
(上接第 125 页)
100 ～ 150 mg /mL 时，对 其 表 现 为 中 度 敏 感，浓 度
≥200 mg /mL时，对其表现为高度敏感。通过对龙葵提取液
不同浓度产生的提取液进行差异显著性分析，发现不同浓度
的龙葵提取液产生的抑菌圈直径之间差异显著。
表 1 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对龙葵乙醇提取物的敏感性测试
Table 1 The sensitivity test of Bacillus subtilis，Escherichia coli and Staphylococcus aureus on the ethanol extracts of Solanum nigrum
龙葵提取液质量浓度
Mass concentration of
Solanum nigrum
extract ∥mg /mL
抑菌圈直径 Average diameter of inhibition zone∥mm
枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis
大肠杆菌
Escherichia coli
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
抑菌结果 Antimicrobial result
枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis
大肠杆菌
Escherichia coli
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
200 10． 07 ±0． 12 a 10． 56 ±0． 14 a 16． 62 ±0． 15 a + + + +
150 8． 96 ±0． 14 b 10． 03 ±0． 12 b 11． 82 ±0． 14 b － + +
100 8． 63 ±0． 18 c 9． 37 ±0． 06 c 10． 27 ±0． 15 c － － +
50 6． 54 ±0． 04 d 7． 78 ±0． 13 d 8． 97 ±0． 13 d － － －
0 4． 76 ±0． 00 e 4． 57 ±0． 00 e 5． 00 ±0． 00 e － － －
注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P ＜0． 05)。“－”表示不敏感，“+”表示中度敏感，“+ +”表示高度敏感。
Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference(P ＜0． 05)． － stands for insensitivity，+ indicates medium sensitivity，+ + in-
dicates high sensitivity．
3 小结与讨论
试验结果显示，不同浓度的龙葵提取液产生的抑菌圈之
间差异显著，表明一定浓度的龙葵乙醇提取液对枯草芽孢杆
菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且随着龙葵
提取液质量浓度的增加，3 种菌种的抑菌效果越显著，其中，
龙葵乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最明显。
试验采用的龙葵提取物为粗提物，目前对龙葵抑菌活性
成分的分析及其抑菌活性成分之间的相互作用效应的研究
较少，日后可对龙葵活性成分进一步分离纯化及对其抑菌活
性成分的结构进行解析，也可将龙葵与其他中草药混合再测
试其抑菌效果，对临床应用提供更准确的依据。此次试验还
应用了索氏提取法对龙葵进行粗提取，但由于试验条件的限
制导致对龙葵生物成分的提取率非常低，超声波提取法的提
取率非常高，所以舍弃了索氏提取法改用超声波提取法进行
试验。
参考文献
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